崔娟娟 馬曉楠

摘要：目前口腔癌的診斷方法均存在一定的局限性，臨床上仍需一種快速、準確、簡便的方法來診斷口腔部位病變細胞，而近紅外熒光染色有可能填補這一空白。通過分析數(shù)據(jù)庫中腫瘤特異性親和的近紅外熒光染料IR-783的轉運體OATP1B3在癌癥組織中表達特征，發(fā)現(xiàn)轉運體的高表達與口腔鱗癌患者生存期縮短相關。另外，體外試驗中IR-783染色容易區(qū)分出口腔鱗癌細胞與非癌細胞，提示OATP1B3有可能作為口腔癌診斷的標志物，而IR-783染色可以成為潛在的口腔癌診斷方法。

關鍵詞：口腔癌;近紅外熒光;OATP1B3

頭頸部腫瘤包括頸部腫瘤、耳鼻喉科腫瘤以及口腔頜面部腫瘤三大部分?？谇活M面部惡性腫瘤發(fā)病率僅次于鼻咽癌，居頭頸部惡性腫瘤的第2位。每年新發(fā)口腔癌患者數(shù)約占新發(fā)頭頸部腫瘤的15%?？谇话┦且环N高度致死的癌癥，致死率接近50%[1]。目前，口腔癌的診斷方法主要有兩種，即影像學檢查和細胞學/組織活檢，但臨床上仍需要一種快速、準確、簡便的方法來診斷口腔部位病變細胞。所以考慮應用一些對癌細胞有特異親和力的熒光染料，借助顯微成像系統(tǒng)進行診斷，形成一種全新、安全、高效的高分辨率實時影像學診斷系統(tǒng)。小分子近紅外熒光染料IR-783是一種水溶性陽離子七甲川花菁染料，以前被用來測量血流量和心輸出量，如今，人們注意到了它的一種重要特性：IR-783很容易穿透生物膜結構，可以特異性地富集于癌細胞的線粒體中。IR-783在癌細胞線粒體中的富集依賴于有機陰離子轉運體OATP1B3（由SLCO1B3基因編碼）。OATP1B3在許多種類的腫瘤細胞中都有高表達，但具體表達水平和表達機制均未知。本研究將通過分析數(shù)據(jù)庫中OATP1B3在癌癥組織中表達特征，分析OATP1B3是否適合作為口腔癌的診斷標志物，并考察IR-783是否富集于腫瘤細胞中，從而使IR783染色成為潛在的口腔癌診斷方法?，F(xiàn)報道如下：

1材料與方法

基因表達資料交互分析：GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/detail.php）在線程序被用于分析和比較TCGA及GTEx數(shù)據(jù)，得到SLCO1B3在不同組織的分布情況。線箱圖用于比較多種腫瘤與對應的正常組織中SLCO1B3表達差異是否有統(tǒng)計學意義，|log2FC|臨界值設定為1，P值臨界值設定為0.01，其余為默認值。

生存分析：GEPIA的生存分析（包括了總體生存期與無病生存期）模塊中用時序檢驗（Log-rank test）作為假設檢驗（hypothesis test）。SLCO1B3表達的中位數(shù)作為臨界值。

近紅外熒光染料染色及熒光觀察：細胞數(shù)相同的人口腔鱗癌細胞CAL-27與人胚胎腎細胞HEK293共培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中（含有10% FBS，1%青霉素-鏈霉素雙抗）。細胞鋪板8h后，在培養(yǎng)基中加入10 nmol/L IR-783，37℃避光孵育10 min，棄去培養(yǎng)基后用冷的PBS洗3次，加入新鮮培養(yǎng)基后40倍物鏡相差及熒光顯微鏡觀察并拍照（Olympus IX71，熒光激發(fā)波長630 nm，發(fā)射波長780 nm）。

2結果

2.1 OATP1B3在腫瘤和正常組織中的表達差異

基因表達資料交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis， GEPIA）被用于比較TCGA及GTEx數(shù)據(jù)，得出OATP1B3（SLCO1B3）在正常組織或器官和對應的腫瘤組織中的表達差異及差異是否有統(tǒng)計學意義。正常人體內，OATP1B3僅在肝臟和膽囊高表達，而在其他組織中幾乎觀察不到表達。但在小腸以外的其他消化系統(tǒng)腫瘤中存在表達水平升高的情況（圖1A、B）。相反，與正常肝臟和膽囊相比，在肝癌和膽囊癌組織中OATP1B3表達量卻降低（圖1B）。對表達差異進行統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，只有結腸腺癌、食道癌、頭頸癌、肝癌和膽囊癌中SLCO1B3的表達與正常組織對照相比有顯著性差異（P<0.01，圖1C、D）。提示SLCO1B3的表達可能與這五種癌癥發(fā)生與進展相關。

2.2 SLCO1B3表達與癌癥病人生存期相關性分析

為了明確SLCO1B3的表達對這幾種癌癥病人預后的影響，GEPIA被用于分析基因表達與患者生存期之間的相關性。泛癌分析結果顯示SLCO1B3的高表達患者明顯有著更短的總體生存期與無病生存期（圖2A、B）。而結腸腺癌、食道癌、頭頸鱗癌患者SLCO1B3的高表達與生存期縮短顯著相關（圖2C），尤其是頭頸鱗癌患者SLCO1B3的高表達意味著更差的預后（圖2D）。另外，肝癌和膽囊癌患者SLCO1B3的表達對總體生存期與無病生存期均無顯著性影響（圖2E、F）。以上結果提示SLCO1B3的表達對頭頸鱗癌患者預后影響較大。

2.3 OATP1B3介導的IR-783在口腔癌細胞中富集

作為頭頸部腫瘤重要的一類，口腔癌鱗細胞是否可以通過表達OATP1B3而富集近紅外熒光染料并無報道。為了觀察IR-783是否可以特異性染色口腔癌細胞，人口腔鱗癌細胞CAL-27與人胚胎腎細胞HEK293共培養(yǎng)，經(jīng)IR-783染色后進行白光及近紅外熒光觀察。結果顯示IR-783在CAL-27細胞中特異性富集，而在HEK293細胞中幾乎沒有富集（圖3）。而CAL-27細胞紅外熒光信號很強烈（圖3B），293細胞幾乎不被紅外染料著色，很難將其與背景分開，兩種細胞染色對比度達到100：1。使用IR783，能夠清楚的區(qū)分兩種細胞。

3討論

根據(jù)已有文獻報道，IR-783可以在多種腫瘤細胞系及裸鼠的異體移植腫瘤中富集，顯示出其作為癌癥診斷試劑的價值，但哪些腫瘤可以富集IR-783并不清晰，限制了其應用。本研究從IR-783的轉運體OATP1B3的表達出發(fā)，明確了SLCO1B3基因在腫瘤與配對正常組織中表達的差異，及SLCO1B3高表達與患者生存期縮短的的相關性。在此基礎上證明了口腔鱗癌細胞易于富集IR-783，而這種近紅外熒光染料有成為口腔癌診斷試劑的潛力。

參考文獻

[1]趙友，周燁，崔笠，等.基于代謝組學的前列腺癌腫瘤標志物研究進展[J].腫瘤學雜志，2020，26（2）：78-82.