楊東升，于 卓，于肖夏，李佳奇，李景偉，吳國芳，盧倩倩

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

冰草屬(Agropyron)為小麥族多年生及禾本科草本植物，主要分布于歐亞大陸的溫帶和溫寒帶草原區(qū)，共有10個(gè)種，其中中國有5個(gè)種。細(xì)胞遺傳學(xué)分析表明，冰草屬有二倍體(2n=2x=14，PP)、四倍體(2n=4x=28，PPPP)和六倍體(2n=6x=42，PPPPPP)3個(gè)染色體倍數(shù)水平，自然界中以二倍體種和四倍體種占多數(shù)，六倍體種較為少見[1]。該屬植物根系較發(fā)達(dá)，具沙套，抗旱、抗寒性強(qiáng)，適應(yīng)性廣，是我國北方天然草地改良和人工草地建植的優(yōu)質(zhì)飼草[2]，同時(shí)也是小麥、黑麥等麥類作物抗逆性遠(yuǎn)緣雜交改良的寶貴基因資源[3-4]。目前有關(guān)冰草的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)等方面已有研究[5-7]，但關(guān)于冰草高密度和超高密度遺傳作圖方面的研究報(bào)道較少。Zhang等[8]以冰草Z2098×Z1842的113個(gè)F1分離單株為作圖群體，利用特定長度擴(kuò)增片段測序技術(shù)(specific length amplified fragment sequencing，SLAF-seq)[9]開發(fā)SNP標(biāo)記，首次構(gòu)建了含 1 032個(gè)SNP標(biāo)記、平均圖距為1.5 cM的二倍體冰草高密度分子遺傳連鎖圖譜，其覆蓋基因組長度為907.8 cM。本課題組前期將產(chǎn)于內(nèi)蒙古草原抗寒抗旱性強(qiáng)的二倍體野生蒙古冰草(A.mongolicumKeng，2n=2x=14，PP)與引自美國的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的二倍體栽培品種航道冰草(A.cristatumcv. Fairway，2n=2x=14，PP)進(jìn)行人工授粉雜交，成功獲得種間雜種F1植株，進(jìn)而用秋水仙堿溶液對F1種子進(jìn)行染色體加倍，最終得到了遺傳穩(wěn)定的四倍體雜交冰草[10]。為構(gòu)建四倍體雜交冰草的高密度分子遺傳連鎖圖譜，通過人工套袋自交獲得了四倍體雜交冰草F2代的347個(gè)分離單株，以此為作圖群體，利用AFLP(amplified fragment length polymorphism)和SSR(simple sequence repeats)第一代分子標(biāo)記技術(shù)，首次構(gòu)建了含766個(gè)分子標(biāo)記(581個(gè)AFLP和185個(gè)SSR)、平均圖距為3.82 cM的四倍體雜交冰草高密度遺傳連鎖圖譜，其覆蓋基因組長度 2 574.3 cM[11]。

為構(gòu)建超高密度(平均圖距<0.5 cM)四倍體雜交冰草的分子遺傳連鎖圖譜，本研究以四倍體雜交冰草F2代的115個(gè)分離單株及其親本蒙古冰草、航道冰草為遺傳作圖材料，利用基因分型技術(shù)(genotyping-by-sequencing，GBS)技術(shù)[12]，構(gòu)建首個(gè)超高密度的四倍體雜交冰草遺傳連鎖圖譜，以期為深入開展冰草產(chǎn)量、品質(zhì)及抗旱、抗寒等重要性狀的QTL精細(xì)定位、功能基因圖位克隆和分子標(biāo)記輔助育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)材料為四倍體雜交冰草F2代的115個(gè)分離的無性系單株及其二倍體親本蒙古冰草(♀)和航道冰草(♂)，種植于呼和浩特市內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場的多年生牧草材料圃內(nèi)，株距25 cm，行距45 cm。該試驗(yàn)地位于111°42′ E、45°57′ N，海拔1 063 m，年降水量約400 mm無霜期約145 d，土質(zhì)為沙壤土，pH值在7.8～8.2之間，肥力中等，具灌水條件。生長期內(nèi)，視生長狀況適時(shí)適量灌水施肥。

1.2 冰草基因組DNA的提取及其質(zhì)量檢測

于2019年5月10日冰草拔節(jié)初期，分別剪取四倍體雜交冰草的115個(gè)F2分離單株及其親本的幼嫩葉片約1 g，裝入自封袋并迅速放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。每個(gè)材料準(zhǔn)確稱取0.15 g，剪碎后混勻，置研缽中加適量液態(tài)氮充分研磨成細(xì)粉狀后，用北京TIANGEN公司生產(chǎn)的植物基因組試劑盒提取DNA，具體方法按照說明書的方法 進(jìn)行。

用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度，用超微量分光光度計(jì)(NanoDrop ND-2000，USA)測定DNA的濃度，將符合試驗(yàn)要求的各樣品DNA稀釋至80 ng·μL-1，置于-40 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 GBS文庫的構(gòu)建與測序

供試材料基因組DNA測序采用GBS方法，由北京安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司完成。具體步驟如下：

(1)用多種限制性內(nèi)切酶對四倍體雜交冰草F2群體分離單株及其親本的基因組DNA進(jìn)行酶切，根據(jù)酶切試驗(yàn)結(jié)果選出最適合的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行DNA酶切。在內(nèi)切酶兩端分別加上P1和P2接頭，其中P1接頭含有PCR擴(kuò)增所需的引物序列、Illumina測序引物結(jié)合位點(diǎn)序列和區(qū)分不同樣品的短標(biāo)簽序列，混合不同接頭的樣品，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

(2)對質(zhì)量檢測合格的DNA樣品，用GBS建庫方式構(gòu)建長度范圍在300～500 bp之間的pair-end文庫。

(3)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，并對構(gòu)建好的文庫進(jìn)行質(zhì)檢，用Illumina HiSeq PE150平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。

1.4 SNP標(biāo)簽的篩選與過濾

對各樣品中的標(biāo)簽(Tag)進(jìn)行比對和歸類，按照每類Tag的深度信息由大到小排序，獲得所有個(gè)體的Tag頻數(shù)表及雜合位點(diǎn)信息。綜合考慮個(gè)體間的Tag頻數(shù)表信息，尋找個(gè)體之間單堿基差異信息并進(jìn)行篩選和過濾SNP標(biāo)記，要求Tag完整度>80%，雜合率<5%，等位基因型頻率>5%。最后過濾掉偏分離(P<0.05)的SNP標(biāo)記，保留多態(tài)性好、高質(zhì)量的SNP標(biāo)記，用于構(gòu)建冰草超高密度遺傳連鎖圖譜。

1.5 SNP分子遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

采用遺傳作圖軟件Join Map 4.0，參考李佳奇等[13]的方法構(gòu)建四倍體雜交冰草超高密度分子遺傳連鎖圖譜，略作修改。具體步驟如下：

(1)打開軟件，執(zhí)行New Project命令新建一個(gè)文件，點(diǎn)擊Load Date命令導(dǎo)入數(shù)據(jù)。

(2)運(yùn)行LOD Grouping(tree)命令，生成樹狀圖，選擇14個(gè)LOD≥5.0的連鎖群，打開圖譜分組命令(create groups for mapping)，獲得標(biāo)記不同的連鎖群。

(3)先用Calculate Map命令構(gòu)建出各個(gè)連鎖群SNP圖譜，然后用Map Chart 2.3繪制出含14個(gè)連鎖群的超高密度(平均圖距<0.5 cM)分子遺傳連鎖圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 冰草GBS測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果

對四倍體雜交冰草F2代115個(gè)單株及其親本的基因組DNA測序結(jié)果見表1。共獲得 3 989 607 400 reads和584 895 503 397 bases，reads質(zhì)量值≥30的堿基(Q30，可識(shí)別堿基的正確率為99.9%)平均占比為94.14%，GC堿基含量平均占比為43.13%。說明測序質(zhì)量和文庫構(gòu)建質(zhì)量均較高，滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

表1 GBS測序結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of GBS sequencing results

2.2 冰草的基因分型與SNP過濾

各樣品的基因分型數(shù)據(jù)見表2。共鑒定出 98 695個(gè)高可信度的多態(tài)性SNP標(biāo)記，其中有 34 105個(gè)SNP標(biāo)記具有多態(tài)性。在34 105個(gè)候選標(biāo)記中，過濾掉F2分離群體的低覆蓋率序列(覆蓋率<80%)，剩余13 164個(gè)標(biāo)記。經(jīng)偏分離過濾后，最終得到5 035個(gè)可用于遺傳作圖的高質(zhì)量SNP標(biāo)記。

表2 不同基因分離類型的SNP標(biāo)記數(shù)Table 2 Number of SNP markers in different types of gene segregation patterns

2.3 四倍體雜交冰草超高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

按照軟件Join Map 4.0操作程序，將GBS測序分析獲得的5 035個(gè)高質(zhì)量SNP標(biāo)記分成14個(gè)連鎖群(LG1～LG14)，構(gòu)建出一張超高密度四倍體雜交冰草分子遺傳連鎖圖譜(圖1)。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)(表3)，該圖譜覆蓋基因組長度2 148.621 cM，各連鎖群的長度范圍在68.959～280.309 cM之間，平均長度為153.473 cM，以連鎖群LG12最長，LG6最短。5 035個(gè)SNP標(biāo)記不均勻分布在LG1～LG14連鎖群上，每個(gè)連鎖群的SNP標(biāo)記數(shù)目在152～767之間，其中LG9的標(biāo)記數(shù)目最多，LG5的標(biāo)記數(shù)目最少，平均標(biāo)記數(shù)目約為360個(gè)；各連鎖群標(biāo)記間的平均間距在0.120～1.304 cM之間，圖譜SNP標(biāo)記平均間距為0.427 cM，為目前所報(bào)道的冰草超高密度分子遺傳連鎖 圖譜。

表3 四倍體雜交冰草遺傳連鎖圖譜特征Table 3 Basic characteristics of genetic map of tetraploid hybrid crested wheatgrass

另外，從圖1中的連鎖群LG6和LG7看出，在同一位點(diǎn)上有多個(gè)標(biāo)記，稱為共位點(diǎn)標(biāo)記，這種現(xiàn)象在植物超高密度遺傳連鎖圖譜上常有出現(xiàn)[14-15]，其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值尚待深入研究。

圖1 四倍體雜交冰草超高密度遺傳連鎖圖譜Fig.1 Ultra-high density genetic linkage map of tetraploid hybrid crested wheatgrass

續(xù)圖1 四倍體雜交冰草超高密度遺傳連鎖圖譜Continued Fig.1 Ultra-high density genetic linkage map of tetraploid hybrid crested wheatgrass

續(xù)圖1 四倍體雜交冰草超高密度遺傳連鎖圖譜Continued Fig.1 Ultra-high density genetic linkage map of tetraploid hybrid crested wheatgrass

續(xù)圖1 四倍體雜交冰草超高密度遺傳連鎖圖譜Continued Fig.1 Ultra-high density genetic linkage map of tetraploid hybrid crested wheatgrass

續(xù)圖1 四倍體雜交冰草超高密度遺傳連鎖圖譜Continued Fig.1 Ultra-high density genetic linkage map of tetraploid hybrid crested wheatgrass

續(xù)圖1 四倍體雜交冰草超高密度遺傳連鎖圖譜Continued Fig.1 Ultra-high density genetic linkage map of tetraploid hybrid crested wheatgrass

續(xù)圖1 四倍體雜交冰草超高密度遺傳連鎖圖譜Continued Fig.1 Ultra-high density genetic linkage map of tetraploid hybrid crested wheatgrass

3 討 論

3.1 遺傳作圖群體的選擇

選擇合適的作圖群體是構(gòu)建植物遺傳連鎖圖譜的重要基礎(chǔ)，而親本的選配會(huì)直接影響作圖群體的分離程度及構(gòu)建圖譜的難易程度，所以盡可能選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的品種作親本，通常利用F2、BC(backcross)、DH(doubled haploid)、RIL(recombinant inbred lines)或NIL(near isogenic lines)群體來構(gòu)建遺傳連鎖圖譜[16]。其中，F(xiàn)2群體是由2個(gè)高度純合的親本雜交產(chǎn)生的F1代進(jìn)行自交后得到的分離群體，具有成本低、時(shí)間短、遺傳信息量大的優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用較廣泛的遺傳作圖群體，如谷子[17]、棉花[18]、芝麻[19]、菠菜[20]和高丹草[21]。

本研究以蒙古冰草×航道冰草雜交后經(jīng)套袋自交獲得的四倍體雜交冰草F2代115個(gè)單株為材料，獲得了5 035個(gè)高質(zhì)量的SNP標(biāo)記，表明該作圖群體的基因組DNA中含有豐富的SNP多態(tài)性標(biāo)記。原因可能是親本材料分別為內(nèi)蒙古草原的野生蒙古冰草和美國的航道冰草，它們生長的自然環(huán)境條件、形態(tài)特征和生物學(xué)特性等差異很大[22]，其種間雜交F2代的性狀分離明顯而引起的，同時(shí)亦說明F2代性狀分離越明顯的材料越適合進(jìn)行植物的遺傳作圖研究。

3.2 GBS技術(shù)與SNP標(biāo)記的開發(fā)應(yīng)用

構(gòu)建高質(zhì)量的超高密度分子遺傳連鎖圖譜是植物產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等重要性狀QTL精細(xì)定位及分子標(biāo)記輔助選擇等研究的基礎(chǔ)[23-24]，標(biāo)記數(shù)目越多、密度越大，遺傳作圖就越精確、實(shí)用。GBS技術(shù)是在第二代測序技術(shù)的基礎(chǔ)上，高效開發(fā)的植物基因組SNP分子標(biāo)記新技術(shù)，目前已成功應(yīng)用于小麥[25]、玉米[26]、水稻[27]等多種重要作物的SNP標(biāo)記開發(fā)及高密度分子遺傳圖譜的構(gòu)建中。該項(xiàng)技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)在于構(gòu)建遺傳圖譜過程中不受參考基因組的限制[28]，無參考基因組的植物亦可進(jìn)行基因分型和大規(guī)模地開發(fā)SNP標(biāo)記。而用傳統(tǒng)的RFLP[29]、AFLP[30]及SSR[31]等分子標(biāo)記構(gòu)建的植物遺傳連鎖圖譜，往往因標(biāo)記數(shù)目有限而出現(xiàn)較大的連鎖空隙或較多的連鎖斷點(diǎn)，且這些方法在基于凝膠電泳統(tǒng)計(jì)條帶時(shí)易造成人工誤差。另外，這些方法作圖耗時(shí)、成本高，且需要選擇大群體[32]，難以滿足后續(xù)QTL精細(xì)定位等研究的需求[33]。用GBS技術(shù)開發(fā)的新型SNP標(biāo)記可以彌補(bǔ)這些傳統(tǒng)分子標(biāo)記的不足。

冰草還未有全基因組測序數(shù)據(jù)，為無參考基因組植物。本研究利用GBS技術(shù)對四倍體雜交冰草F2分離群體及其親本蒙古冰草和航道冰草基因組DNA首次進(jìn)行測序分析，成功地獲得了3 989 607 400 reads，經(jīng)過完整度和偏分離過濾及SNP基因分型共得到5 035個(gè)高質(zhì)量的SNP標(biāo)記，進(jìn)而利用Join Map 4.0作圖軟件首次構(gòu)建了四倍體冰草超高密度遺傳連鎖圖譜，其含有14個(gè)連鎖群，覆蓋基因組長度為2 148.621 cM，標(biāo)記間的平均間距為0.427 cM，是目前飼草中分子標(biāo)記數(shù)目最多、密度最高的遺傳連鎖圖譜，因此，通過GBS技術(shù)大規(guī)模開發(fā)的SNP標(biāo)記，能有效增加冰草各連鎖群的標(biāo)記數(shù)目，提高遺傳連鎖圖譜的整體密度和飽和度，這為冰草的圖譜構(gòu)建提供了最新方法，也為后續(xù)從正向遺傳學(xué)角度深入開展冰草品質(zhì)、抗寒、抗旱等優(yōu)異性狀基因的圖位克隆及其功能研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。