王坤，肖羽芯，李夢(mèng)瑩，馬嬌陽(yáng)，覃一書，向萍,*

1. 西南林業(yè)大學(xué)環(huán)境污染與食品安全及人體健康云南省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，昆明 650224 2. 西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院/環(huán)境修復(fù)與健康研究院，昆明 650224

廣義上，重金屬是指密度>4.5 g·cm-3的金屬元素，而在環(huán)境污染中重金屬通常指的是鎘、汞、鉛、鉻和砷等具有生物毒性的金屬(砷是一種類金屬，因其毒性效應(yīng)與其他有毒金屬相似，故也被劃為重金屬之一)。由于重金屬污染具有隱蔽性、長(zhǎng)期性、不可逆轉(zhuǎn)性和生物蓄積性等特點(diǎn)，因此重金屬暴露對(duì)人類健康的影響受到廣泛重視。為此，世界衛(wèi)生組織(WHO)每年定期評(píng)估重金屬對(duì)人類健康的影響，世界各國(guó)也以據(jù)其健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果，先后建立起重金屬污染管控的環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定了多介質(zhì)中重金屬的環(huán)境限量標(biāo)準(zhǔn)。然而，越來(lái)越多的研究表明，傳統(tǒng)基于重金屬總量開(kāi)展的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法并不能全面地評(píng)價(jià)人體實(shí)際面臨的暴露風(fēng)險(xiǎn)，因此需要建立更為準(zhǔn)確的重金屬暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法。

面對(duì)不足，研究者們陸續(xù)發(fā)展起了多種基于生物可給性(bioaccessibility)的重金屬人體暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法，如體外胃腸模擬法，即還原胃腸道物理化學(xué)環(huán)境，對(duì)環(huán)境介質(zhì)中污染物的胃腸階段溶出率進(jìn)行分析。常見(jiàn)的體外胃腸模擬法有基于生理學(xué)的提取試驗(yàn)法(physiologically based extraction test, PBET)、體外胃腸法(invitrogastrointestinal, IVG)和可溶性生物可給性研究聯(lián)合會(huì)方法(Solubility Bioaccessibility Research Consortium, SBRC)等[1]。重金屬的生物可給性通常被定義為重金屬經(jīng)過(guò)消化過(guò)程從環(huán)境介質(zhì)中溶出至胃或腸道消化液中的部分占總量的百分比[1]，它優(yōu)于基于總量的評(píng)估方法，反映了人體胃腸道實(shí)際接觸重金屬的情況。即便如此，生物可給性依然無(wú)法確定有多少重金屬進(jìn)入了人體內(nèi)。為更好地反映重金屬的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，研究者把通過(guò)胃腸道吸收進(jìn)入人體內(nèi)循環(huán)的重金屬量占重金屬總量的百分比定義為生物有效性(bioavailability)，在此基礎(chǔ)上能較好地對(duì)人體重金屬暴露風(fēng)險(xiǎn)展開(kāi)評(píng)估[2]。

目前，研究者們通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(invivo)或體外實(shí)驗(yàn)(invitro)開(kāi)展了有關(guān)重金屬的生物有效性和暴露毒性研究。但由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)存在周期長(zhǎng)、成本高、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體的物種間差異等缺陷，限制了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在重金屬相關(guān)研究上的應(yīng)用。相較之下，體外實(shí)驗(yàn)具有成本低、高通量、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，一些研究者選擇體外腸細(xì)胞模型開(kāi)展重金屬腸道暴露的體外實(shí)驗(yàn)研究。重金屬的跨腸細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)是重金屬對(duì)人體內(nèi)臟器官產(chǎn)生毒害的重要前提，因而腸細(xì)胞模型在重金屬生物有效性、吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和毒性機(jī)制研究中受到特別關(guān)注。為了盡可能模擬體內(nèi)腸道功能，多種體外腸道模型得以成功構(gòu)建與應(yīng)用。本文綜述了腸道上皮層的結(jié)構(gòu)功能、體外腸道細(xì)胞模型發(fā)展、腸細(xì)胞模型在重金屬生物有效性或吸收研究中的應(yīng)用及優(yōu)缺點(diǎn)分析、模型優(yōu)化方法等，并對(duì)腸細(xì)胞模型的發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

1 人體腸道上皮的結(jié)構(gòu)與功能(The structure and function of human intestinal epithelium)

1.1 人體腸道上皮層結(jié)構(gòu)與功能

攝入受重金屬污染的食物是人體重金屬暴露的重要途徑。進(jìn)食后，經(jīng)口腔和胃作用后的食糜被送入腸道完成主要的吸收過(guò)程。人體消化道中約90%的吸收過(guò)程發(fā)生在腸道的小腸之中，其具有不同尺度上的折疊結(jié)構(gòu)，如腸絨毛(villi)和微絨毛(microvilli)，使其具有巨大的表面積，實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)的最大程度吸收，同樣包括了對(duì)重金屬的吸收[3]。因此，腸道組織結(jié)構(gòu)和各類腸細(xì)胞類群的功能特征對(duì)建立和優(yōu)化體外腸道細(xì)胞模型尤為重要。

在腸道組織結(jié)構(gòu)中，腸道與腸腔直接接觸的是上皮層(圖1)，其能夠?qū)崿F(xiàn)腸道的主要功能，具有自我更新能力，由包括執(zhí)行選擇性吸收的吸收性腸上皮細(xì)胞(absorptive enterocytes)、分泌黏液的杯狀細(xì)胞(goblet cells)、轉(zhuǎn)運(yùn)顆粒和呈遞抗原的微褶皺細(xì)胞(microfold cells，簡(jiǎn)稱M細(xì)胞)和分泌抗菌肽的潘氏細(xì)胞(Paneth cells)等構(gòu)成。此外，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞散布于上皮層下的結(jié)締組織、毛細(xì)血管和淋巴組織中，它們同樣對(duì)腸上皮功能起著重要作用。腸腔側(cè)，覆蓋著上皮細(xì)胞的黏液、共生微生物和食糜也與腸道上皮功能密切相關(guān)[3]。腸上皮細(xì)胞之間通過(guò)緊密連接(tight junction)維持了腸道上皮的完整性，并與黏液、細(xì)胞分泌的抗菌肽等一起維持了腸道上皮的屏障功能，實(shí)現(xiàn)了腸道分泌、免疫和物質(zhì)的選擇性吸收功能[3]。基于對(duì)上述腸道上皮結(jié)構(gòu)與功能的理解，提出并建立了多種腸道細(xì)胞模型。

1.2 重金屬的腸道上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)

腸道吸收性上皮細(xì)胞作為腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的關(guān)鍵部位，存在4種吸收轉(zhuǎn)運(yùn)方式：細(xì)胞旁途徑擴(kuò)散(paracellular diffusion)、跨細(xì)胞途徑的被動(dòng)擴(kuò)散(passive diffusion)、轉(zhuǎn)胞吞作用(tanscytosis)和載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)(carrier-mediated transport)。一些低分子量的親水分子能夠直接通過(guò)細(xì)胞旁途徑穿過(guò)腸道上皮細(xì)胞層，細(xì)胞旁途徑轉(zhuǎn)運(yùn)受細(xì)胞間緊密連接和黏附連接的調(diào)控，緊密連接是腸道上皮屏障的重要組成部分，能夠阻止物質(zhì)自由穿越腸道上皮細(xì)胞層。據(jù)報(bào)道，一些毒性重金屬如砷、鎘和汞能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞旁路途徑的通透性[4]。小分子可以通過(guò)不依賴能量的被動(dòng)擴(kuò)散穿過(guò)腸道上皮細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層。轉(zhuǎn)胞吞作用是腸道上皮細(xì)胞腸腔側(cè)通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞，將分子吸收，然后通過(guò)胞吐將內(nèi)吞物釋放轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞的基底側(cè)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。

作為載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)方式，金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(transporter)調(diào)控著重金屬在腸上皮細(xì)胞膜上的進(jìn)出，這是腸上皮細(xì)胞吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬的重要途徑，本文綜述了部分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)重金屬的轉(zhuǎn)運(yùn)功能(表1)。內(nèi)流轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(influx transporter)在腸腔側(cè)將金屬離子吸收進(jìn)細(xì)胞，而外排蛋白(efflux transporter)可以將金屬離子從細(xì)胞內(nèi)排出腸上皮細(xì)胞的基底側(cè)或腸腔側(cè)。鐵、錳和鋅等金屬是人體的必需元素，細(xì)胞膜上存在著吸收轉(zhuǎn)運(yùn)這些金屬的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而一些毒性重金屬與必需元素特征相近，采用模仿“搭便車”的方式，競(jìng)爭(zhēng)或劫持必需元素的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞，這一過(guò)程被稱為離子擬態(tài)(ionic mimicry)[5]。例如，在腸道吸收過(guò)程中，鎘能夠利用細(xì)胞重要的二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DMT1(divalent metal transporter 1)進(jìn)入腸上皮細(xì)胞[6]。除此以外，重金屬還能通過(guò)分子擬態(tài)(molecular mimicry)間接被細(xì)胞吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，部分重金屬能夠結(jié)合到生物分子的特定位點(diǎn)上形成復(fù)合物，結(jié)合了重金屬的生物分子復(fù)合物通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)攜帶著重金屬完成了跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[5]。如砷在細(xì)胞內(nèi)能夠與谷胱甘肽形成As(GS)3復(fù)合物，Shukalek等[7]研究發(fā)現(xiàn)多藥耐藥蛋白(multidrug resistance-associated protein)MRP1和MRP2負(fù)責(zé)將As(GS)3復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞。

圖1 小腸上皮的組織結(jié)構(gòu)Fig. 1 The structural pattern of small intestinal epithelium

2 基于腸道細(xì)胞的體外模型(In vitro models based on intestinal cells)

為研究重金屬的生物有效性、吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程和毒性效應(yīng)及其機(jī)制，模式動(dòng)物(如小鼠)被廣泛應(yīng)用，然而隨著研究深入，越來(lái)越多的報(bào)道指出小鼠腸道結(jié)構(gòu)、菌群與人類存在差異，因此，動(dòng)物模型并不能完全模擬人體腸道[17]。此外，出于實(shí)驗(yàn)倫理考慮，歐盟等發(fā)達(dá)地區(qū)以替代(replace)、減少(reduce)和優(yōu)化(refine)的“3R原則”提倡科研者使用體外方法替代和減少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。鑒于此，腸道細(xì)胞模型為重金屬的腸道暴露研究提供了一種具有較好生理相關(guān)性的體外方法，其采用的人源細(xì)胞能較好地模擬人體腸道的功能特征，并在不同實(shí)驗(yàn)室表現(xiàn)出了較高的可重復(fù)性，還具有實(shí)驗(yàn)成本低、高通量和周期短等優(yōu)點(diǎn)。

隨著細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，腸道細(xì)胞體外模型日益完善。基于Transwell小室的腸道細(xì)胞模型(圖2(a))早期被應(yīng)用于藥物吸收研究領(lǐng)域，近年來(lái)陸續(xù)應(yīng)用在環(huán)境污染物的生物有效性、吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和毒性研究上，這有助于更早識(shí)別出生物有效性高、毒性大的污染物，為污染物的人體健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。目前，腸道細(xì)胞模型在重金屬人體暴露方面的研究可簡(jiǎn)要?dú)w納為以下幾點(diǎn)：(1)人體對(duì)環(huán)境介質(zhì)中重金屬的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程和生物有效性研究；(2)環(huán)境介質(zhì)中的其他成分對(duì)重金屬吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的影響研究；(3)重金屬暴露對(duì)人體所需營(yíng)養(yǎng)元素?cái)z取的影響研究；(4)重金屬對(duì)腸道產(chǎn)生的直接毒性效應(yīng)及其機(jī)制研究。

2.1 腸道細(xì)胞單培養(yǎng)模型

腸道細(xì)胞單培養(yǎng)模型所采用的細(xì)胞大多來(lái)源于人結(jié)腸腺癌，相較于更復(fù)雜的細(xì)胞模型，它具有成本低廉、技術(shù)簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，目前仍然是應(yīng)用最廣泛的一類腸道細(xì)胞模型(圖2(b))。近年來(lái)，許多環(huán)境污染物腸道暴露研究采用了這一模型，并取得了與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相近的結(jié)果[18]?；谘芯啃枨螅珺ourgine等[19]報(bào)道了一些常用于建立腸道細(xì)胞模型的細(xì)胞系基因表達(dá)譜，以幫助研究者根據(jù)具體需要，選擇合適的腸道細(xì)胞材料。Caco-2、HT29和T84細(xì)胞系常用于建立腸道細(xì)胞單培養(yǎng)模型，是目前研究最多和應(yīng)用最廣的腸道細(xì)胞系。

表1 人體腸道上皮細(xì)胞負(fù)責(zé)重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)蛋白Table 1 Transporters for transporting heavy metals in human intestinal epithelial cells

2.1.1 Caco-2細(xì)胞模型

分離自人結(jié)腸腺癌的Caco-2細(xì)胞系長(zhǎng)期被廣泛用于重金屬的生物有效性、腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和毒性效應(yīng)研究。盡管Caco-2細(xì)胞源自人結(jié)腸腺癌，但其能夠表達(dá)大多數(shù)吸收性腸細(xì)胞的形態(tài)和功能特性，是建立腸細(xì)胞模型的良好材料，許多改進(jìn)版的腸道細(xì)胞模型也是以Caco-2細(xì)胞為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的。Caco-2模型的建立一般將Caco-2細(xì)胞在Transwell小室中培養(yǎng)21 d，在此期間Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)匯合，并自發(fā)分化，細(xì)胞頂部(腸腔側(cè))逐漸形成具有微絨毛的刷狀緣，細(xì)胞之間形成緊密連接，表達(dá)多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和代謝酶，最終形成一層極化的吸收性腸細(xì)胞層。

Caco-2細(xì)胞模型常應(yīng)用于環(huán)境介質(zhì)中的重金屬生物有效性和吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究[20-22]。研究方法簡(jiǎn)言之，即對(duì)介質(zhì)進(jìn)行體外模擬消化后，用緩沖鹽溶液或培養(yǎng)基對(duì)模擬消化液進(jìn)行混合配比，使其達(dá)到細(xì)胞生存所需的營(yíng)養(yǎng)與滲透壓要求，后將溶液加入Caco-2細(xì)胞模型的腸腔側(cè)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。Lee和Lee[22]對(duì)砷污染稻米進(jìn)行體外模擬消化，結(jié)合Caco-2模型轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大米中的總砷生物有效性在16%～38%之間，為評(píng)估食用稻米帶來(lái)的砷暴露風(fēng)險(xiǎn)提供重要信息。而Fujishiro等[6]利用Caco-2模型研究轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DMT1和ZIP14在鎘吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的作用，進(jìn)一步闡述了鎘跨上皮吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)理。

食物基質(zhì)或藥物對(duì)重金屬的生物有效性可能會(huì)產(chǎn)生一定影響，因此Caco-2模型可被用于發(fā)掘和篩選降低重金屬暴露風(fēng)險(xiǎn)的方法。Lee等[22]研究發(fā)現(xiàn)精白米中總砷的生物有效性(31%)高于糙米(21%)，研究結(jié)果可為砷污染區(qū)居民砷暴露風(fēng)險(xiǎn)防控提供科學(xué)膳食指導(dǎo)。此外，Caco-2模型實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)一些食品添加劑能降低重金屬的生物有效性。Fu和Cui[23]在受污染小白菜的體外模擬消化過(guò)程中分別添加FeCl3、CaCl2和醋酸，經(jīng)Caco-2模型轉(zhuǎn)運(yùn)后發(fā)現(xiàn)3種添加劑均能降低鎘和鉛的生物有效性。近年來(lái)，通過(guò)類似研究，一些物質(zhì)對(duì)重金屬吸收的抑制或促進(jìn)作用也被陸續(xù)揭示[24-25]。同理，Caco-2模型也能被用于研究重金屬暴露對(duì)人體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的影響，不過(guò)目前這一領(lǐng)域的研究仍很少。

此外，Caco-2模型還被大量用于重金屬對(duì)腸道上皮毒性的研究。腸道屏障的完整性是腸道上皮細(xì)胞選擇性吸收物質(zhì)的前提，重金屬暴露可能破壞腸道屏障的完整性，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞旁路途徑轉(zhuǎn)運(yùn)通量的增加，使外源有害物質(zhì)更易進(jìn)入人體。Luo等[18]利用Caco-2模型發(fā)現(xiàn)鎘暴露導(dǎo)致細(xì)胞旁路通透性增強(qiáng)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這是由于鎘暴露引起細(xì)胞鈣黏蛋白E和閉鎖蛋白減少，導(dǎo)致腸屏障破壞。許多重金屬能直接或間接誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，過(guò)量的活性氧將導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷甚至死亡，Sutherland等[26]將Caco-2模型暴露于多種重金屬污染的魚和牡蠣提取溶液，發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶活性被激活，Caco-2細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

Caco-2模型仍存在許多局限性。Caco-2細(xì)胞會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間和傳代次數(shù)的增加，發(fā)生異質(zhì)性變化現(xiàn)象，為了減少Caco-2細(xì)胞的異質(zhì)性，目前已從Caco-2細(xì)胞系中分離出克隆型，如Caco-2/TC-7、Caco-2/15和Caco-2/AQ等。其中，Caco-2/TC-7細(xì)胞保留了親本Caco-2的功能特征，但分化速度更快，且更為均一穩(wěn)定[27]。相較于人真實(shí)腸道，Caco-2模型缺乏黏液層，而黏液層是腸道上皮屏障的重要組成部分，為模擬黏液層，研究者采用Caco-2細(xì)胞與產(chǎn)生黏液的腸道細(xì)胞(如HT29)共培養(yǎng)(co-culture)的方法來(lái)建立腸道細(xì)胞模型[28]。此外，Caco-2細(xì)胞還存在高表達(dá)P-糖蛋白(P-gp)和低表達(dá)代謝酶的缺陷，因此Caco-2模型仍需更新和改進(jìn)。

2.1.2 HT29細(xì)胞模型

HT29細(xì)胞系源自人結(jié)腸腺癌，HT29細(xì)胞模型同樣可用于生物有效性和細(xì)胞機(jī)制的研究。不同于Caco-2細(xì)胞，HT29細(xì)胞的分化不是自發(fā)進(jìn)行的，而是營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)條件驅(qū)動(dòng)的，HT29細(xì)胞系被認(rèn)為是一種多能的細(xì)胞系，根據(jù)其培養(yǎng)條件的不同，細(xì)胞將會(huì)以不同路徑分化[29]。在一定培養(yǎng)條件下(例如高葡萄糖無(wú)血清培養(yǎng)條件)，HT29細(xì)胞會(huì)分化為杯狀細(xì)胞樣，具備分泌黏液的能力[29]。Lecoeur等[30]采用HT29細(xì)胞建立了單培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)鎘能夠通過(guò)Nramp2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入腸上皮細(xì)胞，并證明了鎘在細(xì)胞內(nèi)的積累量與金屬硫蛋白的含量部分相關(guān)。

除HT29親本細(xì)胞以外，較常用的亞克隆細(xì)胞系還有HT29-MTX，其通過(guò)甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)對(duì)HT29細(xì)胞進(jìn)行藥物抗性篩選獲得[31]。與HT29細(xì)胞的不同，HT29-MTX細(xì)胞能夠自發(fā)分化為杯狀細(xì)胞樣細(xì)胞[31]，有助于簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟。然而HT29和HT29-MTX細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，低表達(dá)乳糖酶，且細(xì)胞間緊密連接性能不足[32]，因此較不適合用于單獨(dú)建立細(xì)胞模型開(kāi)展重金屬相關(guān)研究，其更多是和Caco-2細(xì)胞建立共培養(yǎng)模型。

2.1.3 T84細(xì)胞模型

來(lái)源于人結(jié)腸癌(肺轉(zhuǎn)移)的T84細(xì)胞系也能用于構(gòu)建腸細(xì)胞模型。T84細(xì)胞培養(yǎng)在Transwell膜上能形成細(xì)胞間緊密連接和微絨毛的極化細(xì)胞單層，但微絨毛數(shù)量較少，沒(méi)有在細(xì)胞腸腔側(cè)形成明顯的刷狀緣。不同于Caco-2細(xì)胞系，T84細(xì)胞在分化過(guò)程中始終表現(xiàn)結(jié)腸細(xì)胞特征，在許多研究中作為結(jié)腸模型[33-35]。Breton等[33]選用T84細(xì)胞于Transwell膜上建立了細(xì)胞模型，用CdCl2和PbCl2分別暴露細(xì)胞模型的腸腔側(cè)24 h，其中20 μmol·L-1CdCl2誘導(dǎo)T84模型發(fā)生可逆的屏障損傷，而68 μmol·L-1CdCl2則對(duì)屏障造成不可逆損傷，而1 000 μmol·L-1PbCl2并不誘導(dǎo)屏障損傷，這表明重金屬對(duì)腸上皮單層滲透性的影響取決于元素種類、暴露時(shí)間和暴露濃度。不過(guò)目前基于T84模型的重金屬研究仍然較少，作為結(jié)腸模型的T84細(xì)胞模型更多被用于電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究[36]和與腹瀉有關(guān)的Cl-分泌研究[34-35]?？梢?jiàn)T84模型在開(kāi)展重金屬暴露下的結(jié)腸電解質(zhì)紊亂和腹瀉方面的研究具有一定潛力。

綜上所述，腸細(xì)胞單培養(yǎng)模型在重金屬研究領(lǐng)域的應(yīng)用十分廣泛。但隨著研究的不斷深入，許多報(bào)道證實(shí)，單培養(yǎng)模型結(jié)構(gòu)單一，難以完全模擬體內(nèi)腸道細(xì)胞的生理功能，包括多種關(guān)鍵代謝酶和部分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的低表達(dá)、黏液層的缺失等[20, 37](表2)，因而很難滿足人體腸道暴露重金屬的精確研究。鑒于此，研發(fā)生理功能更為接近體內(nèi)腸道的模型成為研究者們努力的新方向。

2.2 腸道細(xì)胞共培養(yǎng)模型

生理狀態(tài)下的腸道上皮層通常由多種細(xì)胞類群組成，不同細(xì)胞相互協(xié)作，共同組成了腸道上皮層的結(jié)構(gòu)與功能。因此，研究者們提出，可以利用不同種類腸道細(xì)胞，借鑒細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)在體外構(gòu)建功能化的腸道細(xì)胞模型[26]。目前的腸道細(xì)胞共培養(yǎng)模型多是在Caco-2模型的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，共培養(yǎng)模型整合了2種或2種以上細(xì)胞，相比于細(xì)胞單培養(yǎng)模型，其能更好地模擬復(fù)雜的腸道上皮組織結(jié)構(gòu)。

2.2.1 Caco-2/HT29細(xì)胞共培養(yǎng)模型

在人腸道上皮中，分泌黏液的杯狀細(xì)胞占到了10%～25%，黏液是人腸道屏障的重要組成部分，起著應(yīng)對(duì)外源有害物質(zhì)威脅的作用。Caco-2模型缺乏分泌黏液的能力，無(wú)法模擬人腸道黏液層，這一缺陷可以通過(guò)建立Caco-2/HT29細(xì)胞共培養(yǎng)模型來(lái)克服，在此模型中Caco-2細(xì)胞提供屏障功能和作為吸收性腸細(xì)胞，而HT29細(xì)胞作為生成黏液的杯狀細(xì)胞。但是，在模型建立過(guò)程中，HT29細(xì)胞向杯狀細(xì)胞樣分化需要設(shè)置特定的培養(yǎng)條件，這導(dǎo)致實(shí)際步驟較為繁瑣，還易分化形成異質(zhì)細(xì)胞[31]，因此實(shí)際研究中較多選擇HT29-MTX細(xì)胞用于Caco-2/HT29共培養(yǎng)模型的構(gòu)建。Caco-2/HT29模型在腸腔側(cè)覆蓋的黏液層通常被認(rèn)為是腸道接觸或吸收重金屬的重要屏障。另外，黏液層也能影響外源物質(zhì)在腸壁上的停留時(shí)間[38]。Vázquez等[38]基于Caco-2/HT29-MTX模型研究Hg2+和甲基汞的轉(zhuǎn)運(yùn)，結(jié)果表明共培養(yǎng)模型對(duì)Hg2+和甲基汞的轉(zhuǎn)運(yùn)能力弱于Caco-2模型，這一現(xiàn)象被解釋為Hg2+和甲基汞被保留在了黏液層中。

在屏障功能上，Caco-2/HT29模型緊密連接性能不如Caco-2模型緊密，但與人體腸道實(shí)際情況更為接近，這使得細(xì)胞旁路途徑轉(zhuǎn)運(yùn)通量增加[28]。此外，關(guān)于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，Caco-2/HT29模型中二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DMT1的表達(dá)高于Caco-2或HT29細(xì)胞單培養(yǎng)模型[39]。目前Caco-2/HT29模型在重金屬的生物有效性研究方面應(yīng)用較多[28, 38]。Lv等[28]分別使用Caco-2/HT29模型和Caco-2模型研究了煮熟大米中鎘的生物有效性，發(fā)現(xiàn)Caco-2/HT29模型對(duì)鎘的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)活性高于Caco-2模型。但目前該細(xì)胞模型的建立存在一些難點(diǎn)，如在建立該模型的過(guò)程中2種細(xì)胞的生長(zhǎng)速度不一，導(dǎo)致模型穩(wěn)定建立時(shí)2種細(xì)胞比例偏離預(yù)期，目前主要采用根據(jù)實(shí)際情況摸索并調(diào)整Caco-2/HT29細(xì)胞比例的方法解決[40]。

2.2.2 Caco-2/免疫細(xì)胞共培養(yǎng)模型

常見(jiàn)的腸道細(xì)胞模型主要采用上皮細(xì)胞，卻忽視免疫細(xì)胞是腸道上皮中的第二大細(xì)胞類群，免疫細(xì)胞在腸道細(xì)胞間通訊、炎癥反應(yīng)和分化控制中發(fā)揮著重要作用。研究者理解并利用腸道上皮細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的關(guān)聯(lián)性，建立了以Caco-2模型為基礎(chǔ)的Caco-2/免疫細(xì)胞共培養(yǎng)模型，該模型能夠?yàn)檠芯恐亟饘僖鸬哪c道上皮炎癥和腸道細(xì)胞-免疫細(xì)胞間通信提供有效工具。目前，常用以建立此模型的免疫細(xì)胞主要有人外周血單核細(xì)胞(PBMC)、人髓系白血病單核細(xì)胞(THP-1)和人Burkitt’s淋巴瘤細(xì)胞(Raji B)等。目前比較主流的Caco-2/免疫細(xì)胞模型是在Transwell膜上培養(yǎng)腸道細(xì)胞，待其形成完整單層后(約14 d)，在膜的下側(cè)培養(yǎng)免疫細(xì)胞，2種細(xì)胞并不直接接觸。然而一些研究采用了較為特殊的建立方法，Susewind等[41]將2種細(xì)胞培養(yǎng)在同一腔室中，使兩者直接接觸；還有的研究則采用3 μm孔徑Transwell建立Caco-2/免疫細(xì)胞共培養(yǎng)倒置模型，用于考察免疫細(xì)胞在腸上皮層的遷移[42]。

Caco-2/免疫細(xì)胞模型目前多用于納米顆粒毒性、微生物對(duì)腸道炎癥的影響和細(xì)胞間通信研究[43-44]，在重金屬領(lǐng)域的研究較少。不過(guò)近幾年陸續(xù)有研究采用此模型開(kāi)展金屬毒性的相關(guān)研究。K?mpfer[45]建立了Caco-2/THP-1共培養(yǎng)模型研究氧化銅(CuO)納米顆粒(nanoparticles, NPs)對(duì)腸道炎癥反應(yīng)和通透性的影響。Calatayud等[46]報(bào)道了無(wú)機(jī)三價(jià)砷和2種有機(jī)三價(jià)砷MMA(Ⅲ)和DMA(Ⅲ)在Caco-2/PBMC共培養(yǎng)模型中的促炎癥作用，并檢測(cè)到釋放到基底側(cè)的炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-8大幅增加。

在各種Caco-2/免疫細(xì)胞模型中，Caco-2/Raji B模型是較為特殊的一種。據(jù)報(bào)道，來(lái)源于人淋巴瘤的Raji B細(xì)胞能夠誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞分化為M細(xì)胞表型[41]。在人體實(shí)際環(huán)境中，M細(xì)胞通過(guò)在腸腔側(cè)的內(nèi)吞作用和基底側(cè)的胞吐作用跨腸上皮轉(zhuǎn)運(yùn)多種物質(zhì)(尤其是顆粒性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn))。利用Caco-2/Raji B模型，Ude等[47]評(píng)估了CuO NPs和CuSO4對(duì)腸道上皮屏障和炎癥因子分泌的影響，發(fā)現(xiàn)CuO NPs和CuSO4誘導(dǎo)的銅毒性水平相似，結(jié)合Caco-2/HT29-MTX模型的對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Caco-2/Raji B模型對(duì)CuO NPs和CuSO4的轉(zhuǎn)運(yùn)效率更高，且對(duì)兩者的毒性更為敏感。此外，Huang等[48]進(jìn)行了稀土金屬鑭的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究，氯化鑭和檸檬酸鑭在體外消化后>99.9%的鑭發(fā)生了沉淀，形成了粒徑200～600 nm的顆粒，Caco-2模型和Caco-2/Raji B模型的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)顯示M細(xì)胞是轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸鑭顆粒的主要途徑。這都表明Caco-2/Raji B模型在(重)金屬及其納米顆粒在人體暴露風(fēng)險(xiǎn)方面的研究具有一定潛力，盡管如此，該模型依然忽視了黏液和基質(zhì)細(xì)胞的作用。

2.2.3 Caco-2/HT29/Raji B細(xì)胞共培養(yǎng)模型

綜合考慮上述各模型的優(yōu)缺點(diǎn)，一些研究者將Caco-2/HT29模型和Caco-2/Raji B模型結(jié)合，開(kāi)發(fā)了囊括多種類型腸道細(xì)胞的Caco-2/HT29/Raji B細(xì)胞三重共培養(yǎng)模型[49]。該模型利用多種細(xì)胞各自的特征和共培養(yǎng)時(shí)的行為，以求在單層水平上更大程度地模擬人腸道上皮(圖2(c))。類似于Caco-2/免疫細(xì)胞模型，Caco-2/HT29/Raji B細(xì)胞共培養(yǎng)模型目前也多見(jiàn)于金屬納米毒理學(xué)的研究。Sohal等[49]建立Caco-2/HT29/Raji B共培養(yǎng)模型以研究Fe2O3NPs和ZnO NPs對(duì)腸道上皮的影響，發(fā)現(xiàn)ZnO NPs的毒性較強(qiáng)。此外，該研究還通過(guò)與Caco-2模型的對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Caco-2/HT29/Raji B模型在研究金屬NPs毒性方面具有較高的生理相關(guān)性，顯著優(yōu)于Caco-2模型。

此外有研究者將納米顆粒毒性研究與金屬生物有效性研究相結(jié)合，深入研究了納米顆粒暴露對(duì)腸道吸收金屬元素或營(yíng)養(yǎng)元素的影響。Mahler等[50]對(duì)比了腸道細(xì)胞模型與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證實(shí)了Caco-2/HT29/Raji B模型在金屬生物有效性和納米毒性交叉研究方面的潛力。該研究采用膳食性攝入的方式將三細(xì)胞模型暴露于聚苯乙烯納米顆粒，分析了聚苯乙烯納米顆粒暴露下的腸道模型對(duì)鐵的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，以及納米顆粒的跨腸上皮轉(zhuǎn)運(yùn)，發(fā)現(xiàn)腸細(xì)胞模型對(duì)大粒徑(>200 nm)聚苯乙烯顆粒的轉(zhuǎn)運(yùn)是主動(dòng)耗能的過(guò)程，Raji B細(xì)胞誘導(dǎo)分化的M細(xì)胞在大粒徑顆粒物轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用，小粒徑氨基化聚苯乙烯納米顆粒則能夠增強(qiáng)腸道細(xì)胞對(duì)鐵的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)。

盡管Caco-2/HT29/Raji B三細(xì)胞模型在重金屬相關(guān)領(lǐng)域的研究中鮮有應(yīng)用，但不可否認(rèn)的是，其在其他領(lǐng)域的研究方法和經(jīng)驗(yàn)對(duì)重金屬研究極具參考價(jià)值。隨著實(shí)驗(yàn)室硬件條件的改善和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，這一更具生理相關(guān)性的細(xì)胞模型在重金屬領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2.4 Caco-2細(xì)胞/靶細(xì)胞分層共培養(yǎng)模型

重金屬經(jīng)腸道上皮吸收轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入人體血液循環(huán)，最終到達(dá)相應(yīng)的毒性靶器官，并對(duì)其產(chǎn)生毒害作用。因此，研究者將腸道細(xì)胞與不同器官來(lái)源的細(xì)胞共同建立了Caco-2/靶細(xì)胞分層共培養(yǎng)模型(圖2(d))，以期同時(shí)進(jìn)行重金屬的生物有效性與生物毒性研究，并為重金屬細(xì)胞毒性參數(shù)和生物代謝轉(zhuǎn)化研究提供一種具有潛力的評(píng)估工具。該模型常見(jiàn)的共培養(yǎng)體系有Caco-2/肝細(xì)胞、Caco-2/血管細(xì)胞和Caco-2/神經(jīng)細(xì)胞等，這些共培養(yǎng)體系已被證明具有類似器官系統(tǒng)的功能，以及不同器官來(lái)源細(xì)胞之間的相互作用，并能夠用以檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化代謝過(guò)程。

Caco-2/肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型是一類典型的Caco-2/靶器官模型，肝細(xì)胞的引入能夠使模型在研究腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和毒性效應(yīng)的同時(shí)，開(kāi)展腸細(xì)胞/肝細(xì)胞相互作用、肝毒性和肝臟代謝轉(zhuǎn)化的研究。Scheers等[51]在Caco-2細(xì)胞模型的基底側(cè)孔底培養(yǎng)了HepG2肝細(xì)胞，建立的Caco-2/HepG2模型被同時(shí)用于研究腸道對(duì)鐵的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和肝細(xì)胞分泌的鐵調(diào)素(hepcidin)對(duì)腸道鐵吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，在鐵的腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，HepG2細(xì)胞通過(guò)分泌鐵調(diào)素與Caco-2細(xì)胞產(chǎn)生相互作用，Caco-2/HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)模型增加了Caco-2細(xì)胞中的鐵蛋白水平，這也表明在研究中需考慮肝臟對(duì)腸道鐵吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)作用。此外，Sutherland等[26]采用Caco-2/肝HepaRG細(xì)胞共培養(yǎng)模型評(píng)估了人腸道細(xì)胞和肝臟細(xì)胞對(duì)多種有機(jī)污染物和重金屬污染的魚和牡蠣提取物的抗氧化反應(yīng)，還通過(guò)單培養(yǎng)與共培養(yǎng)模型的比較研究提出，Caco-2/HepaRG共培養(yǎng)模型可能更適用于重金屬?gòu)?fù)合污染的毒性研究。這種共培養(yǎng)模式在研究重金屬或其他污染物對(duì)人類健康方面的影響尤為重要，因?yàn)楦闻K是代謝最活躍的器官，負(fù)責(zé)外源性物質(zhì)的解毒。

除上述模型外，一些研究者建立了Caco-2/血管內(nèi)皮細(xì)胞(如EA.hy926細(xì)胞)分層共培養(yǎng)模型，用于研究食品活性成分對(duì)炎癥反應(yīng)和心血管疾病發(fā)展的影響[52-53]。另有研究者建立了Caco-2/神經(jīng)細(xì)胞(如PC12細(xì)胞)分層共培養(yǎng)模型，以研究腸上皮細(xì)胞與腸神經(jīng)細(xì)胞之間的相互作用，如Satsu等[54]研究Caco-2/PC12細(xì)胞共培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)Caco-2細(xì)胞合成分泌的神經(jīng)生長(zhǎng)因子能夠促使神經(jīng)PC12細(xì)胞分化為交感神經(jīng)樣細(xì)胞，并促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞軸突分支和生長(zhǎng)。雖然這些模型目前應(yīng)用的主要領(lǐng)域在食品科學(xué)和生命科學(xué)方面，但其可以推廣至包括重金屬在內(nèi)的污染物毒性研究中，如Caco-2/血管內(nèi)皮細(xì)胞模型可用于研究重金屬在被腸道吸收后引起的炎癥反應(yīng)或?qū)π难芗膊“l(fā)展的影響，Caco-2/神經(jīng)細(xì)胞模型可評(píng)估重金屬吸收后對(duì)人體產(chǎn)生的神經(jīng)毒性。

腸細(xì)胞共培養(yǎng)模型雖說(shuō)增加了腸道細(xì)胞類群，在一定程度上提高了生理擬真性，但共培養(yǎng)模型缺乏細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用，不能完全重建組織結(jié)構(gòu)，一些癌癥來(lái)源的細(xì)胞系也與真實(shí)腸道細(xì)胞存在表達(dá)譜差異。但迄今為止共培養(yǎng)模型仍是研究重金屬跨腸道細(xì)胞吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和毒性機(jī)制的有利工具(表2)。為了開(kāi)發(fā)更接近真實(shí)生理狀態(tài)的腸細(xì)胞模型，近年來(lái)干細(xì)胞、類器官和微流控芯片技術(shù)興起，這為3D化腸道細(xì)胞模型提供了新方向。

3 腸細(xì)胞模型體外功能化培養(yǎng)優(yōu)化研究(Optimization of functional culture of intestinal cell model in vitro)

由于建立腸道細(xì)胞模型一般需要維持21 d的培養(yǎng)以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分化和緊密連接，較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間易使模型受到微生物污染而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，因此許多研究者嘗試縮短腸道細(xì)胞模型建立所需時(shí)間。

生長(zhǎng)因子是調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化的重要生物分子，馬美湖和黃晶[58]向Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)因子抗壞血酸，模型完整建立的時(shí)間縮短為9 d。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是腸道上皮細(xì)胞的主要微環(huán)境成分，其中含有膠原、生長(zhǎng)因子等生物分子，Li等[59]通過(guò)還原腸道細(xì)胞ECM的方式，將Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于小腸粘膜下層水凝膠之上，用時(shí)7 d即成功建立Caco-2細(xì)胞模型，同時(shí)添加ECM也是腸道細(xì)胞模型3D化的一種嘗試。此外，一些化學(xué)物質(zhì)也能夠促進(jìn)Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化，例如在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑丁酸，11 d內(nèi)建成模型[28]。

盡管快速建立法能大幅縮短模型建立所需的時(shí)間，減少實(shí)驗(yàn)成本，但目前對(duì)待Caco-2快速建立模型的態(tài)度仍需謹(jǐn)慎，有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)快速方法建立的Caco-2模型的細(xì)胞外排蛋白表達(dá)較少，影響了物質(zhì)的跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)[60]。

4 腸道細(xì)胞模型的驗(yàn)證評(píng)價(jià)方法(Validation methods of intestinal cell model)

驗(yàn)證腸道細(xì)胞模型是否成功建立，需要對(duì)模型的完整性、分化特征和腸道功能進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)量細(xì)胞層的跨膜電阻值(transepithelial electrical resistance, TEER)是驗(yàn)證模型完整性最為簡(jiǎn)單易行的方法。隨著腸細(xì)胞的生長(zhǎng)匯合以及緊密連接的加強(qiáng)，多孔膜上的孔隙不斷被細(xì)胞封閉，其TEER也不斷提高，因此運(yùn)用跨膜電阻儀檢測(cè)模型的TEER即可快速檢驗(yàn)細(xì)胞模型的完整性。通常，細(xì)胞間緊密連接性能越強(qiáng)，測(cè)得的模型TEER值就越高。在一項(xiàng)食品中重金屬生物有效性的研究中，研究者在進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)前對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)到TEER值達(dá)到520～610 Ω·cm2，高于設(shè)備參考值的250 Ω·cm2[55]。此外，細(xì)胞間緊密連接直接影響細(xì)胞旁路途徑轉(zhuǎn)運(yùn)量。一些分子(如熒光黃、FITC標(biāo)記的葡聚糖和甘露醇等)通過(guò)細(xì)胞旁路途徑實(shí)現(xiàn)跨腸道上皮轉(zhuǎn)運(yùn)，因此當(dāng)細(xì)胞間緊密連接性能越強(qiáng)、模型完整性越高時(shí)，此類分子越難以通過(guò)，借助這一現(xiàn)象也能夠驗(yàn)證模型的完整性。例如，Lv等[28]通過(guò)檢測(cè)熒光黃的轉(zhuǎn)運(yùn)量來(lái)驗(yàn)證模型完整性，基于熒光黃的轉(zhuǎn)運(yùn)量計(jì)算滲透系數(shù)，間接反映了模型的完整性。

表2 腸道細(xì)胞模型的優(yōu)缺點(diǎn)及其在重金屬研究領(lǐng)域的應(yīng)用范圍Table 2 Advantages and limitations of each intestinal cell model and its application in the research areas of heavy metals

圖2 腸道細(xì)胞模型示意圖注：(a) Transwell小室；(b) Caco-2單培養(yǎng)模型；(c) Caco-2/HT29/Raji B細(xì)胞模型；(d) Caco-2/毒性靶細(xì)胞模型。Fig. 2 Illustration of intestinal cell modelsNote: (a) Transwell chamber; (b) Caco-2 cell model; (c) Caco-2/HT29/Raji B cell model; (d) Caco-2/target cell model.

對(duì)于模型細(xì)胞分化特征的驗(yàn)證，最直觀的方法是用電子顯微鏡或原子力顯微鏡觀察腸道細(xì)胞形態(tài)。一項(xiàng)研究中采用的方法是將多孔膜從小室取下，將多孔膜上的細(xì)胞固定化后，經(jīng)包埋切片置于投射電子顯微鏡下成像，觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)極化，細(xì)胞間的緊密連接、橋粒和細(xì)胞頂側(cè)的刷狀緣是否形成，以此作為細(xì)胞分化的依據(jù)[28]。除此以外，還可以通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)對(duì)不同細(xì)胞的特異性細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)檢測(cè)，如Caco-2細(xì)胞的P-糖蛋白(P-gp)、HT29-MTX的黏液蛋白(MUC)等。Mahler等[50]為驗(yàn)證Caco-2/HT29/Raji B模型出現(xiàn)M細(xì)胞樣分化，對(duì)其特異性標(biāo)志物整聯(lián)蛋白β1和Sialyl Lewis A antigen進(jìn)行了免疫熒光染色，由此證明模型部分細(xì)胞出現(xiàn)M樣細(xì)胞分化。此外，為了衡量建成模型的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)功能，對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性進(jìn)行檢測(cè)，如用模型單位時(shí)間內(nèi)對(duì)地高辛(digoxin)的轉(zhuǎn)運(yùn)量驗(yàn)證P-gp的轉(zhuǎn)運(yùn)活性[61]，用5(6)-羧基-2’,7’-二氯熒光素(CDCF)檢測(cè)多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP2/3/5)的轉(zhuǎn)運(yùn)活性[62]等。

5 展望：腸道細(xì)胞模型的3D化嘗試(Prospects: 3D modeling of intestinal cell model)

腸道細(xì)胞模型作為動(dòng)物模型的替代，在重金屬暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與毒性機(jī)制研究方面具有重要作用。從最初簡(jiǎn)單的2D腸道細(xì)胞單培養(yǎng)模型，發(fā)展到多種細(xì)胞的2D共培養(yǎng)模型，再到3D腸道類器官模型，雖然腸道細(xì)胞模型已經(jīng)得到了一定發(fā)展，但在增加模型的生理相關(guān)性和重金屬研究應(yīng)用方面仍有許多工作要做。目前，大多數(shù)腸道細(xì)胞模型仍然以2D形式構(gòu)建，盡管2D模型尚存局限性，但其提供了一種比動(dòng)物實(shí)驗(yàn)更經(jīng)濟(jì)和道德的選擇，且與重金屬領(lǐng)域研究結(jié)合最緊密，并取得了不少有意義的研究結(jié)果，未來(lái)還能繼續(xù)在重金屬研究領(lǐng)域發(fā)揮其應(yīng)有的作用。此外，近年出現(xiàn)了以微流控芯片、腸道類器官為代表的3D腸道細(xì)胞模型，有著更高的生理相關(guān)性與復(fù)雜性，是腸道-重金屬研究的良好改進(jìn)方案，為未來(lái)的發(fā)現(xiàn)提供前所未有的機(jī)遇，但其挑戰(zhàn)在于目前高昂的研究成本和技術(shù)難度。

5.1 腸道類器官

由于腸道細(xì)胞模型所采用的永生或癌癥細(xì)胞系中的信號(hào)通路和核心代謝有所改變，動(dòng)物模型也與人體實(shí)際腸道存在物種差異。為了更好地重現(xiàn)腸道上皮的復(fù)雜性，還原人腸上皮組織結(jié)構(gòu)，研究者基于誘導(dǎo)分化培養(yǎng)或多能干細(xì)胞(pluripotent stem cells, PSCs)、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)和腸干細(xì)胞(intestinal stem cells, ISCs)開(kāi)發(fā)構(gòu)建了人類腸道類器官(intestinal organoids，又稱mini-gut)[63]。在近年來(lái)對(duì)已知的發(fā)育線索和生長(zhǎng)發(fā)育因子的理解基礎(chǔ)上，干細(xì)胞可以在人工ECM上誘導(dǎo)產(chǎn)生類似腸道器官的絨毛樣三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)，干細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成多種腸道上皮細(xì)胞(包括腸干細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞) (圖3)，能夠?qū)崿F(xiàn)人體腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、屏障和分泌等多種功能[64]。

根據(jù)細(xì)胞的來(lái)源不同，腸道類器官分為HIOs(human intestinal organoids)和HIEs(human intestinal enteroids)2種類型。多能干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞來(lái)源的HIOs除腸道上皮外還可能具有間質(zhì)，因?yàn)椴牧霞?xì)胞的稀缺和干細(xì)胞培養(yǎng)的高成本，目前在腸道生理學(xué)或病理學(xué)研究中應(yīng)用較少。HIEs是從腸隱窩組織中的腸干細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的腸道類器官，能夠長(zhǎng)期維持其原始的生理和遺傳特征[65]。然而，在ECM凝膠中培養(yǎng)的腸類器官是封閉的管腔結(jié)構(gòu)，使得在實(shí)際研究中很難進(jìn)行腸腔重金屬暴露或取樣操作。為了增強(qiáng)腸類器官的應(yīng)用場(chǎng)景和可操作性，研究者將培養(yǎng)于ECM上的HIEs移植至平板或Transwell膜上用以開(kāi)展獨(dú)立的腸道上皮暴露研究[66]。

不同于細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，腸道類器官培養(yǎng)反映了人體腸道上皮的細(xì)胞異質(zhì)性，因此腸道類器官提供了一個(gè)全新的高生理相關(guān)性體外平臺(tái)，這個(gè)平臺(tái)為重金屬暴露風(fēng)險(xiǎn)研究帶來(lái)了新機(jī)遇。但不可否認(rèn)的是，腸道類器官的取材存在著倫理問(wèn)題，此外高成本、高人力的現(xiàn)狀也使得腸道類器官模型只在高水平研究中有應(yīng)用空間。

5.2 “腸道芯片”模型

器官芯片(Organ-on-a-Chip)是一種微流控細(xì)胞培養(yǎng)裝置，重現(xiàn)人體活體器官的關(guān)鍵功能和微環(huán)境，為研究器官結(jié)構(gòu)和功能提供了另一種途徑。它最初借鑒了計(jì)算機(jī)微電子芯片的制造方法(如光刻等)，它的主體結(jié)構(gòu)為流體連續(xù)灌流的腔室，里面培養(yǎng)有用以模擬組織和器官的細(xì)胞(圖4)。目前常見(jiàn)的商業(yè)化腸道細(xì)胞模型平臺(tái)，如Transwell小室，上下腔室的培養(yǎng)液是靜止的，而在人體實(shí)際腸道環(huán)境中，腸道上皮承受著腸腔內(nèi)食糜的流動(dòng)和剪切應(yīng)力的作用。鑒于此，人體腸道微流控芯片又稱為腸道芯片(Gut-on-a-Chip)已被開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于腸道生理學(xué)和病理學(xué)研究中。

已有研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了基于聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)設(shè)計(jì)和制造的腸道微流控芯片的器件，微流控芯片系統(tǒng)為腸道細(xì)胞提供支持、流體持續(xù)灌注和實(shí)時(shí)監(jiān)控[67]。Bein等[68]報(bào)道，在Caco-2細(xì)胞和腸道來(lái)源的其他上皮細(xì)胞構(gòu)建的腸道芯片中，同時(shí)施加腸腔側(cè)和基底側(cè)的流體灌流，能刺激腸細(xì)胞模型形成腸絨毛樣結(jié)構(gòu)，絨毛生長(zhǎng)高度可達(dá)上百微米，并增加腸道特異性功能的表達(dá)，包括黏液的分泌等。為更好重建腸道類器官的隱窩與絨毛結(jié)構(gòu)，Shin等[69]結(jié)合生物來(lái)源的腸道類器官構(gòu)建了腸道類器官-微流控芯片模型。近年來(lái)，腸道芯片模型的工程復(fù)雜性逐步增加，研究者通過(guò)流體管道連接不同器官微流控芯片陸續(xù)建立起腸道-血管芯片[67]、甚至腸道-多器官芯片模型，如腸-肝-皮膚-腎四器官芯片模型[70]等。

圖3 人腸道類器官的2種形式(HIEs和HIOs)注：PSCs為多能干細(xì)胞；ESCs為胚胎干細(xì)胞；ISCs為腸干細(xì)胞。Fig. 3 Illustration of two forms for human gut organoids (HIEs and HIOs)Note: PSCs means pluripotent stem cells; ESCs means embryonic stem cells; ISCs means intestinal stem cells.

圖4 腸道細(xì)胞微流控芯片[69, 71] 注：(a)微流控芯片實(shí)物；(b)微流控芯片剖面圖。Fig. 4 Illustration of intestinal cell microfluidic chip[69, 71]Note: (a) Microfluidic chip; (b) Section view of microfluidic chip.

許多微流控芯片研究團(tuán)隊(duì)采用的是自制芯片，這就使得不同實(shí)驗(yàn)室間的芯片參數(shù)與功能不盡相同，并且不是每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都有條件制造此類芯片。盡管目前已有商業(yè)化芯片的推出，使得不具備制造芯片條件的實(shí)驗(yàn)室也能夠采用這一技術(shù)，但高昂的售價(jià)讓許多研究者望而卻步。未來(lái)，隨著腸道微流控芯片模型發(fā)展完善，腸道芯片能夠?yàn)檠芯堪ㄖ亟饘僭趦?nèi)的污染物人體暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供新的技術(shù)方案，對(duì)于揭示重金屬等污染物人體暴露風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。