劉薇，梅璽麗，陳雨萌，向哲源，高澤欣，邢立國，趙慧敏，劉猛，陳景文

1.大連理工大學環(huán)境學院，工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程重點實驗室，大連 116024 2.中化集團沈陽化工研究院有限公司，沈陽 110027

工業(yè)革命以來，人類合成了化肥、農(nóng)藥、藥物和各種工業(yè)化學品，至今美國化學文摘社(Chemical Abstracts Service, CAS)注冊的化學物質(zhì)有1.5億種以上(每天約增加15 000種)，人類在市場上使用的化學品在35萬種以上[1]。根據(jù)2019年3月聯(lián)合國環(huán)境署(United Nations Environment Programme, UNEP)發(fā)布的全球化學品展望Ⅱ(Global Chemicals Outlook Ⅱ)[2]，歐盟區(qū)域2016年使用的3.45億t化學品中，62%對人體健康有害。因此，合成化學品是生態(tài)與人體健康的重要風險源，是人類社會可持續(xù)發(fā)展面臨的重大挑戰(zhàn)。

預防和控制化學品對人體健康的風險，需要化學品的毒性數(shù)據(jù)，以填補關(guān)于化學品危害性的信息空白。然而，傳統(tǒng)的毒性測試方法往往需要消耗大量的測試動物，成本高，耗時長，存在動物實驗倫理問題。而且，動物實驗結(jié)果外推至人類具有極大的不確定性。新時代的環(huán)境毒理學，倡導從以往主要是描述性的科學向更具預測性、主要基于人源細胞和組織的體外高通量測試的科學轉(zhuǎn)變；倡導通過對毒性通路(toxicity pathway, TP)和有害結(jié)局路徑(adverse outcome pathway, AOP)的機理認識并構(gòu)建計算毒理學模型來進行化學品的風險評價和預測，進而減少實驗測試動物的數(shù)目、測試成本和時間。因此，發(fā)展基于人源細胞和組織的體外高通量毒性測試方法體系，是新時代環(huán)境毒理學的前沿方向[3-5]。

人源細胞和組織用于毒理學測試，先后經(jīng)歷了2D單層細胞培養(yǎng)、細胞球模型和類器官模型(表1)。2D細胞培養(yǎng)和細胞球模型常用單一的特定細胞系，與體內(nèi)多細胞組織及其生理功能差異較大。所謂類器官(organoid)，指的是由誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)、胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)或成體干細胞(adult stem cells, ASCs)在體外自組織并經(jīng)歷一定程度的細胞分化形成的3D結(jié)構(gòu)，具備體內(nèi)組織器官的部分典型功能，具有較為穩(wěn)定的表型和遺傳學特性[6-7]。3D類器官模型可模擬組織器官的復雜空間形態(tài)，突破了細胞間單純的物理接觸和聯(lián)系，表現(xiàn)出細胞間和細胞-基質(zhì)相互作用，與體內(nèi)組織器官具有更相似的生理反應(yīng)。類器官模型與2D單層細胞模型或細胞球模型相比，能更好地用于模擬器官組織的發(fā)育過程及生理病理狀態(tài)，因而能更好地反映體內(nèi)毒性效應(yīng)(表1)。關(guān)于類器官模型的基礎(chǔ)研究以及在再生醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用進展，已有相關(guān)綜述[6-13]。目前類器官模型在化學品毒理學評價領(lǐng)域的應(yīng)用僅處于起步階段[14]，本文從類器官的生理學特性、構(gòu)建方法及組織類型等方面，重點綜述了類器官模型對化學品暴露的毒性響應(yīng)特征，及其在化學品毒理學評價中的優(yōu)勢和可行性，并提出了存在的問題和對策，以期為基于類器官模型的化學品毒理學研究提供參考。

1 類器官的特性(Organoid features)

類器官由多種細胞自組織形成，在細胞類型、結(jié)構(gòu)和功能等方面模擬體內(nèi)相應(yīng)組織器官。作為實驗室培養(yǎng)的器官微縮模型，類器官應(yīng)用于體外環(huán)境中特定靶器官毒理學的研究，具有以下幾方面優(yōu)勢。

(1)細胞形態(tài)呈3D模式。與傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)中貼壁生長的2D細胞形態(tài)不同，在類器官模型中，細胞在3D空間中生長，形態(tài)學特征和生理特性與體內(nèi)更相似。例如，3D毛囊乳頭細胞球相較于單層培養(yǎng)的毛囊乳頭細胞，其細胞分泌因子能夠改善毛囊微環(huán)境，促進毛囊中β-catenin和CD133的表達，這2種蛋白與毛囊干細胞功能和毛囊再生密切相關(guān)[15]。呼吸道上皮細胞在3D培養(yǎng)條件下表達上皮細胞標志物PCK、CK5和ZO-1，而且形成纖毛樣突起，但在2D條件下培養(yǎng)并無以上特征[16]。

(2)能夠反映細胞間相互作用和細胞-基質(zhì)相互作用。類器官模型包含多種細胞類型，突破了傳統(tǒng)2D模型中簡單的細胞間物理接觸，形成了更加緊密的細胞間生物通信和信號網(wǎng)絡(luò)，細胞間相互影響、反饋及協(xié)作發(fā)育。細胞間相互作用和細胞-基質(zhì)相互作用支持細胞微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的建立，有助于形成和維持具有特定結(jié)構(gòu)和功能的微型組織器官。類器官模型可顯著促進針對細胞相互作用過程的毒理學研究，例如對細胞粘附、遷移、分化和愈合等細胞功能的損傷作用[17]。

(3)具有良好的生理功能。例如，皮膚類器官比單層培養(yǎng)的角化細胞、成纖維化細胞具有更好的抗氧化應(yīng)激能力[18-19]，與人體表皮脂質(zhì)成分高度相似，具有較為完善的屏障功能。Lancaster等[20]構(gòu)建的腦類器官模型，不僅符合哺乳動物的基本神經(jīng)發(fā)育機理，還具備了一定的人類大腦發(fā)育特征，并且作者利用該腦類器官模型成功構(gòu)建了在小鼠體內(nèi)很難模擬的小頭畸形障礙疾病模型，有效解決了該疾病實驗研究的難題。相對于單層細胞培養(yǎng)，3D培養(yǎng)條件下的生殖細胞中自噬體數(shù)量明顯降低，緩解了細胞在體外培養(yǎng)中產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)[21]。

2 類器官模型的構(gòu)建方法(Organoid development methods)

根據(jù)使用的支架材料和培養(yǎng)設(shè)備等，常用類器官構(gòu)建方法主要包括4類：懸浮培養(yǎng)、凝膠支架培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器和氣液界面培養(yǎng)(圖1)。此外，生物打印技術(shù)和器官芯片技術(shù)是類器官模型構(gòu)建的新興方法。

2.1 懸浮培養(yǎng)

使用低附著力表面的培養(yǎng)瓶/微孔板、磁懸浮器件或者采用懸滴法，細胞可在液體培養(yǎng)基中懸浮生長并形成類器官。懸浮法不使用支架材料，細胞自發(fā)團聚，避免了其他因素的干擾。懸滴法中細胞懸滴所含細胞數(shù)相同，球體大小一致，無需借助額外裝置，自發(fā)實現(xiàn)細胞成球，局限性主要在于不適于大規(guī)模培養(yǎng)[22]。磁懸浮方法將具有生物相容性的磁性納米顆粒引入細胞，將磁性驅(qū)動組件蓋在培養(yǎng)板頂部，細胞在磁力作用下懸浮到空氣-液體界面，并集中在磁鐵下，形成3D結(jié)構(gòu)。Tseng等[23]利用磁懸浮法實現(xiàn)了4種細胞共培養(yǎng)，包括成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞和平滑肌細胞，形成了細支氣管3D模型。

雌性BLAB/c裸鼠（山東濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物許可證號：SCXK（魯）20160007），6周齡，體質(zhì)量18～20 g。宮頸癌CaSki細胞購自上海滬震生物科技有限公司。qRT-PCR相關(guān)試劑（寶生物）；Fascin抗體（Santa Cruz）；增殖細胞核抗原（PCNA）抗體、Survivin抗體（PTGlab）；細胞周期依賴性蛋白激酶4（CDK4）抗體、p21抗體（R&D Systems）；HRP標記的二抗（羽朵生物）；Fascin siRNA慢病毒和陰性對照慢病毒由深圳中洪博元生物技術(shù)有限公司構(gòu)建。

2.2 凝膠支架

水凝膠由交聯(lián)的多聚鏈或復雜蛋白分子組成的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成，其高含水量和高孔隙性使得氧、營養(yǎng)物質(zhì)和廢物的運輸更為便利，為細胞提供附著、分化和增殖的場所，因而可以作為高效的3D細胞培養(yǎng)基質(zhì)[24]。水凝膠包括天然來源和人工合成材料，其中Matrigel是一種細胞體外培養(yǎng)最常用的天然基質(zhì)膠，是從富含胞外基質(zhì)蛋白的EHS小鼠腫瘤中分離得到的，其組分與體內(nèi)大多數(shù)活細胞的胞外基質(zhì)相似[25]。Matrigel在4 ℃時為液體，當濃度>4 g·L-1時，在24～37 ℃時凝膠化[26]。Matrigel主要成分為層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白和硫酸肝素糖蛋白等，具有結(jié)構(gòu)支持和信號轉(zhuǎn)導的作用。其中層粘連蛋白含量最為豐富，是主要的凝膠因子。Matrigel還包含F(xiàn)GF、EGF、TGF-β、IGF和PDGF等生長因子，通過改變生長因子的組成和濃度，可調(diào)控特定類型的細胞增殖和分化。Matrigel的局限性主要在于組分不完全明確，存在一定的產(chǎn)品批次差異[11]。

表1 不同體外細胞模型的優(yōu)缺點Table 1 Advantages and disadvantages of various in vitro cell models

圖1 類器官的構(gòu)建方法和組織類型注：ASCs表示成體干細胞，ESCs表示胚胎干細胞，iPSCs表示誘導多能干細胞。Fig. 1 Methods for organoid development and tissue-specific typesNote: ASCs stand for adlut stem cells; ESCs stand for embryonic stem cells; iPSCs stand for induced pluripotent stem cells.

2.3 旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器

旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器解決了類器官構(gòu)建的主要難題之一，即細胞的營養(yǎng)和氧氣供給。例如，與靜態(tài)懸浮培養(yǎng)相比，旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中的神經(jīng)節(jié)細胞和S型視錐細胞的分化能力增強，促進和改善了視網(wǎng)膜類器官構(gòu)建中的細胞增殖和分化[27]。在旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中建立的小頭畸形障礙的大腦類器官模型，盡管6～7個月后尺寸有所皺縮，但可維持活性長達15個月[20]。保持適宜的轉(zhuǎn)速對使用旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器培養(yǎng)類器官至關(guān)重要，攪拌速度過慢會使細胞球沉降，速度過快則會損壞細胞。此外，該方法不適用于培養(yǎng)粘附性低或?qū)羟辛γ舾械募毎鸞28]。

2.4 氣液界面法

氣液界面(air-liquid interface, ALI)培養(yǎng)是指細胞的頂層暴露于空氣中，底層與液體培養(yǎng)基接觸，而不是完全浸入培養(yǎng)基中。ALI培養(yǎng)主要用于構(gòu)建呼吸道和皮膚模型，還用于腎和腦類器官[12, 29-30]，有利于呼吸道纖毛細胞和皮膚表皮細胞等細胞的定向分化和增殖。ALI法有利于氧傳輸，提高了培養(yǎng)體系內(nèi)的氧濃度，ALI培養(yǎng)體系中的氧梯度相比于浸沒培養(yǎng)體系降低了1.5倍[13]。因此，ALI法改善了細胞氧合作用，進而促進類器官的自組織，有助于其維持更長時間。例如，ALI培養(yǎng)體系中的大腦類器官可以維持更長時間，從而促使模型進一步成熟[29]。ALI培養(yǎng)在操作上存在一定的難度，此外在半透膜上培養(yǎng)的類器官模型難以進行分離和高通量毒性測試[31]。

2.5 器官芯片技術(shù)

傳統(tǒng)的類器官培養(yǎng)需在特定時間點向培養(yǎng)基中加入外源因子，外源因子和細胞分泌的可溶性因子在干細胞的局部微環(huán)境中自發(fā)擴散，不容易控制，無法精確模擬體內(nèi)器官發(fā)育關(guān)鍵因子的梯度分布。器官芯片技術(shù)在體外模擬機械力刺激、特定信號通路和化學梯度等復雜條件的組織器官生理微環(huán)境，從而精確地調(diào)控細胞行為，減少類器官構(gòu)建的變異性[32]。微流控芯片技術(shù)能促進內(nèi)分泌細胞分化和胰島類器官成熟，Tao等[33]采用人誘導多能干細胞在多層可灌注芯片上動態(tài)灌注培養(yǎng)出了胰島類器官，相比于靜態(tài)培養(yǎng)形成的胰島類器官，對于葡萄糖的刺激更敏感，且胞漿中Ca2+通量更高。此外，可通過器官芯片技術(shù)模擬灌注血管，Shirure等[34]構(gòu)建的腫瘤類器官芯片器件由3個相互連接的隔室組成，可支持內(nèi)皮細胞自組裝形成血管，是解決3D細胞培養(yǎng)中血管形成難題的重要策略之一。Wang等[35]提出了一種在微流控芯片細胞灌注式培養(yǎng)系統(tǒng)中構(gòu)建肝類器官的方法，通過對微陣列的尺寸進行優(yōu)化，調(diào)控類器官大小與均一性。由于微流控芯片技術(shù)是按照預先確定的方式設(shè)計和構(gòu)建的，對細胞的大小、形狀和相對排列的控制存在一定的局限性[32]。

2.6 3D生物打印

3D生物打印將生物材料和活細胞在指定的逐層堆疊的組織中同步定位，與傳統(tǒng)的組織構(gòu)造方法相比，采用3D生物打印法構(gòu)建類器官具有精確、可重復及尺寸可控性強的優(yōu)勢[36]，能夠精確地定位活細胞、蛋白質(zhì)、DNA、藥物、生長因子和其他生物活性物質(zhì)的時空分布，以控制生物組織的形成。大部分的3D組織模型缺乏組織界面，如血管內(nèi)皮組織與周圍結(jié)締組織和實質(zhì)細胞之間的界面，而組織界面對器官功能至關(guān)重要[37]。King等[38]利用3D生物打印平臺開發(fā)了近端人腎小管模型，由腎成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和原代人腎小管近端內(nèi)皮細胞形成了組織界面，該模型暴露于順鉑后，組織活性呈劑量依賴性降低，且通過組織病理學觀察到上皮細胞數(shù)量也呈劑量依賴性降低，通過抑制陽離子攝取轉(zhuǎn)運蛋白OCT2可保護其免受這種損傷。Nguyen等[39]報道，通過生物打印的人類肝臟組織在培養(yǎng)4周時仍能維持ATP、白蛋白水平以及細胞色素P450酶活性，且對肝毒性藥物曲氟沙星和結(jié)構(gòu)類似的左氧氟沙星表現(xiàn)出不同的毒性反應(yīng)，表明該肝組織模型能夠區(qū)分結(jié)構(gòu)高度相似的藥物毒性。3D生物打印的局限性主要在于打印過程中細胞存活率降低，影響類器官活性，此外生物打印的類器官數(shù)量較為有限[40]。

3 類器官的組織類型(Tissue-specific organoid types)

根據(jù)模擬組織器官的類型，類器官模型主要包括皮膚、肝、腎、肺、腦、心臟和生殖類器官等。此外，也有研究報道成功構(gòu)建了腸、乳腺、前列腺、胰腺和視網(wǎng)膜等類器官模型[10, 41]。

3.1 皮膚類器官

歐盟提出從2009年3月開始禁止動物試驗用于化妝品安全性評價[42]，極大地促進了3D皮膚組織模型的發(fā)展。其中較早投入使用的模型有EpiskinTM模型和Epikutis?3D表皮模型。EpiskinTM模型將分離的人表皮細胞接種在特定的生物材料上培養(yǎng)，形成具有3D結(jié)構(gòu)的人表皮模型，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于皮膚腐蝕性體外試驗[43]。張光甫等[44]依據(jù)Epi Derm的構(gòu)建原理采用人皮膚成纖維細胞與鼠尾膠原混合培養(yǎng)模擬真皮層，在真皮層上接種人角化細胞，經(jīng)氣液培養(yǎng)形成表皮層，構(gòu)建人皮膚模型，并利用該模型對10種殺菌類農(nóng)藥的皮膚腐蝕性和刺激性進行檢測，腐蝕性檢測結(jié)果與動物評價測試結(jié)果的一致率為100%，刺激性結(jié)果的一致率達到80%，表明重組人皮膚模型在農(nóng)藥品皮膚毒性評價中具有良好的應(yīng)用前景。Liu等[45]構(gòu)建的由上皮細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞組成的無支架雙膜皮膚模型，與成纖維細胞和內(nèi)皮細胞的共培養(yǎng)以及單一培養(yǎng)相比，3種細胞之間的相互作用上調(diào)了血管化相關(guān)的生長因子VEGF、bFGF和PDGF的表達，形成了更豐富的血管。

3.2 肝臟類器官

肝臟是人體最重要的解毒器官，也是很多外源化學物毒性作用的靶器官，構(gòu)建肝細胞體外3D模型可以對化學物的毒性進行更有效的檢測。2013年，Takebe等[46]將肝細胞、人臍靜脈內(nèi)皮細胞和人間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)，模擬肝臟發(fā)育早期的細胞譜系，并通過內(nèi)皮細胞和間充質(zhì)干細胞的相互作用，產(chǎn)生了類似人肝芽組織的3D聚合物，移植入小鼠體內(nèi)后具有良好的血管生成功能，該研究被Science評為2013年的十大突破之一。不足之處是這些體外培養(yǎng)的肝芽組織缺乏膽管結(jié)構(gòu)。2017年，Vyas等[47]利用肝細胞胞外基質(zhì)支架，使人胎兒肝祖細胞自組織形成了肝類器官，提升了對肝膽器官形成過程的模擬效果，同步形成了分化的肝細胞和膽管結(jié)構(gòu)。Shinozawa等[48]利用多能干細胞構(gòu)建了具有膽汁轉(zhuǎn)運功能的肝臟類器官，含有具有膽管樣結(jié)構(gòu)的極化未成熟肝細胞，建立了膽汁酸的單向轉(zhuǎn)運途徑，通過測試存活率、膽汁淤積和線粒體毒性，對238種市售藥物的肝毒性具有較高的預測能力(敏感性：88.7%，特異性：88.9%)，并將其轉(zhuǎn)化為適用于384微孔板的高速實時成像分析平臺。

3.3 腎臟類器官

原代腎上皮細胞在分離后20 min內(nèi)即喪失細胞特征，在單層培養(yǎng)條件下幾周內(nèi)即完全去分化，因此腎毒性評估通常使用永生化細胞系。但永生化細胞系往往不具備誘發(fā)毒性的基本分子結(jié)構(gòu)，例如攝取化學物的小分子轉(zhuǎn)運體和部分毒性靶標受體，并且存在藥物外排能力低等局限[49-50]。在腎小球類器官模型中，可誘導表達裂隙隔膜、腎臟濾過功能和腎小球發(fā)育相關(guān)基因，而且在阿霉素作用48 h后，MAFB-BFP2強度呈劑量依賴性下降[51]。Astashkina等[52]報道，慶大霉素等4種腎毒性藥物作用于腎小管類器官，藥物擴散較好，而且能夠誘發(fā)和體內(nèi)毒性相似的效應(yīng)，包括尿N-乙酰-β氨基葡萄糖苷酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶升高、炎癥因子升高、腎毒性蛋白和基因標志物升高等，而永生化細胞HEK293和LLC-PK1則無相關(guān)毒性反應(yīng)。此外，在單層培養(yǎng)的腎小管細胞中，細胞色素P450活性迅速喪失，而在3D培養(yǎng)中可持續(xù)表達。

3.4 肺類器官

肺癌的發(fā)病率和死亡率占惡性腫瘤的首位，2018年全球癌癥統(tǒng)計報告顯示，185個國家地區(qū)的肺癌發(fā)病率在36種癌癥中占11.6%，有176.64萬人因肺癌死亡，約占癌癥死亡總?cè)藬?shù)的18.4%[53]，室內(nèi)外環(huán)境空氣污染是呼吸道疾病的主要誘因之一。人體氣道上皮是吸入空氣污染物的主要毒性靶區(qū)，且人呼吸道上皮基底細胞中表達CYP450代謝酶，基于該細胞的肺類器官成為體外吸入毒理學研究的理想模型[17]。氣管結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)是肺類器官構(gòu)建成功的重要標志[10]。Desai等[54]構(gòu)建的肺3D模型，可在培養(yǎng)基中維持100 d以上，并形成組織良好的近端氣道上皮結(jié)構(gòu)，包括基底細胞和纖毛細胞以及少量club細胞。Treutlein等[55]建立的3D肺類器官可以表達遠端肺上皮細胞的標記物Sftpc/Sox9和Hopx/Sox9。Yamamoto等[56]誘導人多能干細胞培育出肺泡類器官，經(jīng)GNE7915和胺碘酮處理后Ⅱ型肺泡上皮細胞的板層小體明顯增大，與體內(nèi)毒性反應(yīng)一致。最近，Takayama[57]利用支氣管類器官，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2病毒的主要靶標是呼吸道上皮基底細胞，并導致I型干擾素信號升高。EpiAirwayTM是一個商品化的肺3D組織模型[58]，具有良好的均一性和重復性，由正常人氣管/支氣管上皮細胞培養(yǎng)形成高度分化的假復層上皮組織模型，包含基底細胞、杯狀細胞和纖毛細胞，其黏液纖毛表型與人類呼吸道上皮組織非常相似[59]。EpiAirwayTM測試預測強吸入毒性化學物質(zhì)與動物測試效果相當，預測中/低毒性呼吸道刺激物的毒性效應(yīng)優(yōu)于動物測試[60]。Chang等[17]比較了不同多環(huán)芳烴類化合物對EpiAirwayTM模型轉(zhuǎn)錄組學特征的影響，指出可利用該方法識別多環(huán)芳烴類化合物的致癌機理。Hild和Jaffe[61]利用Matrigel支架建立了一種不依賴ALI培養(yǎng)的高通量類支氣管模型培養(yǎng)方法，使用384孔細胞培養(yǎng)板即可，在該培養(yǎng)體系中人呼吸道上皮基底細胞可分化為杯狀細胞和纖毛細胞。Liu等[62]進一步考察了該方法的性能，發(fā)現(xiàn)在一定的初始細胞接種數(shù)量和細胞代際范圍內(nèi)，細胞群落形成效率和支氣管模型尺寸變異性較小，具有良好的穩(wěn)定性。

3.5 腦類器官

人腦的復雜性極高，很難采用動物模型研究人類大腦功能，因此迫切需要建立人腦發(fā)育體外模型[20]。腦類器官模型的轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳組學特征和胎兒大腦相似，有利于研究致畸物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的毒性作用和機理。利用單細胞測序比較胎兒大腦和腦類器官皮層細胞組成和譜系關(guān)系，發(fā)現(xiàn)超過80%的皮層疾病或進化相關(guān)的差異表達基因在腦類器官中表達模式相似[63]。2013年，Lancaster等[20]培養(yǎng)出與9～10周胚胎大腦類似的“類大腦”，該模型可以形成分離的但相互依存的不同腦區(qū)，如大腦皮層和腦膜等，極少一部分會分化成海馬體，該腦類器官表現(xiàn)出人大腦皮層發(fā)育的重要特征，即特征性前體區(qū)域組織，其中含有大量的放射狀膠質(zhì)干細胞。2015年，Kirwan等[64]構(gòu)建了人大腦皮層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，能夠模擬體內(nèi)皮質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的發(fā)育和功能，可用于人類前腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)生理學機制的研究。乙醇作用于腦類器官造成祖細胞過早分化、神經(jīng)突生長抑制及細胞死亡，且轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn)一系列新的毒性靶基因和信號轉(zhuǎn)導通路，包括GSX2、RSPO2和Hippo信號通路[65]。尼古丁損害腦類器官的皮層發(fā)育，造成神經(jīng)元分化和遷移異常[66]。類前腦經(jīng)雙酚A暴露，對神經(jīng)祖細胞增殖和腦區(qū)厚度產(chǎn)生劑量依賴性的抑制作用[67]。

3.6 心臟類器官

心臟是外源化學物毒性的重要靶器官之一[14]。Takeda等[68]將3D人工心臟組織用于藥物心臟毒性體外測試，阿霉素誘導細胞釋放乳酸脫氫酶、抑制細胞活力，毒性響應(yīng)較靈敏，且hERG型鉀通道阻滯劑E-4031和異丙腎上腺素呈劑量依賴的方式誘導鈣瞬變和細胞收縮力發(fā)生顯著變化。Lemme等[69]用誘導多能干細胞形成的心肌細胞建立右心房工程心臟組織，與人的肌肉比較，該模型心房的表征指標的mRNA表達水平和蛋白質(zhì)濃度更高、收縮更快、收縮力更小、動作電位持續(xù)時間更短，能夠較為準確地模擬體內(nèi)心臟生理特征。Lu等[70]報道3D培養(yǎng)能夠促進心肌細胞的成熟和收縮，1 μmolL-1的鉀通道阻斷劑E4031顯著降低了3D心臟類器官的收縮速度，當濃度增加到10 μmolL-1時收縮完全停止，而2D培養(yǎng)的單層心肌細胞在1 μmolL-1時收縮停止，2D心臟類器官表現(xiàn)出更強的耐藥性。

3.7 生殖類器官

目前只有少數(shù)研究報道了由睪丸細胞構(gòu)建睪丸類器官。Sakib等[21]建立了豬、小鼠、獼猴和人的3D睪丸類器官，該模型由生殖細胞、支持細胞、睪丸間質(zhì)細胞和管周肌樣細胞組成，形成了明顯的生精上皮和由基底膜分隔的間質(zhì)室。當這些睪丸類器官暴露于鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯后，生殖細胞自噬的水平呈劑量依賴性升高。Pendergraft等[71]用成熟的生殖細胞和永生化的Sertoli-Leydig細胞在懸滴培養(yǎng)系統(tǒng)中培育出人睪丸器類官，并可產(chǎn)生睪酮，4種潛在的促性腺激素化療藥物使該類器官細胞活性明顯下降，凋亡細胞數(shù)量顯著增加，且半數(shù)效應(yīng)濃度值明顯高于相應(yīng)的2D模型。

4 類器官毒理學研究的挑戰(zhàn)與對策(Challenges and strategies of organoid-based toxicology research)

目前類器官模型在化學品皮膚毒性測試方面取得了相對突出的進展，部分模型已在國內(nèi)外毒理學替代法研究機構(gòu)通過驗證形成了標準方法，但在其他靶器官毒理學研究中的應(yīng)用極為有限。對于化學品的毒理學評價，類器官模型有利于模擬化學品在體內(nèi)的動態(tài)分布過程，能夠更準確地預測和評估化學品的毒性效應(yīng)和機理，將顯著促進化學品健康風險防控。此外，由于干細胞在增殖和分化條件下對外源化學物質(zhì)的敏感性不同，基于類器官形成過程的毒理學研究，有利于評價化學品的發(fā)育毒性、識別化學品的敏感時間窗口和分子靶標。利用類器官模型進行化學品的毒理學評價，需要滿足可獲得高產(chǎn)量類器官模型、可測量毒性終點和高通量測試體系等方面的需求[6]，以下幾方面策略有利于推動類器官毒理學的發(fā)展。

4.1 改進類器官構(gòu)建方法體系及其標準化

類器官模型構(gòu)建方法的改進及其標準化是類器官毒理學研究的根本任務(wù)。盡管類器官在模擬體內(nèi)器官形態(tài)和功能上相比2D細胞模型有了極大的提升，但和體內(nèi)組織器官的成熟度和復雜性仍有較大差距。在類器官的培養(yǎng)過程中，隨著細胞的大小和體積的增加，簡單擴散過程使得為核心部分細胞提供的氧氣和營養(yǎng)不足，核心部分細胞代謝廢物排出也受到限制。類器官通常缺乏基底、組織駐留免疫細胞和血管，限制了類器官的發(fā)育和成熟[7]。此外，類器官變化迅速，在不同培養(yǎng)階段所需培養(yǎng)條件不同。優(yōu)化細胞組合類型、培養(yǎng)基組成以及結(jié)合微流控技術(shù)等有望改善類器官模型的功能。類器官的尺寸和細胞組成變異性較大，構(gòu)建方法標準化有助于改善毒理學評價結(jié)果的重現(xiàn)性和準確性。

為滿足化學品毒理學評價的巨大需求，高產(chǎn)量構(gòu)建方法是類器官毒理學的基本要求。基于微孔板的類器官模型構(gòu)建方法，與現(xiàn)有的自動化操作和測試儀器相適應(yīng)，是實現(xiàn)高產(chǎn)量的便捷、有效的方法[62]。此外，Liu等[72]建立了一種基于液滴微流控系統(tǒng)的雜合水凝膠微囊制備體系，該系統(tǒng)支持大規(guī)模的類器官培養(yǎng)。實現(xiàn)類器官凍存且復蘇后仍能夠保持形態(tài)功能的方法體系，也將有效促進其推廣和應(yīng)用。延長類器官的生命周期，可促進通過體外試驗預測長期暴露的毒性效應(yīng)。

4.2 受試物的暴露途徑、劑量和毒代動力學特征

體外毒理學模型有利于研究毒性機理和確定相對毒性潛能，在此基礎(chǔ)上，進一步提升體外暴露途徑的體內(nèi)相關(guān)性，確定體外暴露濃度的體內(nèi)相關(guān)性，將極大地推動類器官毒理學模型的發(fā)展和應(yīng)用。由于類器官模型中的細胞呈3D生長和組織模式，且構(gòu)建體系采用的特殊材料和器件，給類器官毒理學模型的化學品暴露帶來難題。建立與環(huán)境暴露相似的暴露途徑，有助于提升類器官毒理學研究結(jié)果的相關(guān)性。通過類器官及其細胞組分中受試化學物的定量分析，有助于確定靶細胞內(nèi)暴露劑量，建立更精準的劑量-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)合生理毒代動力學模型，借助系統(tǒng)生物學和計算毒理學技術(shù)，可經(jīng)體外濃度估測經(jīng)口濃度，有助于推動基于體外毒理學模型的化學品健康風險評價[42]。

4.3 多層次毒性終點、表征方法和高通量測試體系

建立環(huán)境健康效應(yīng)相關(guān)的、靈敏的毒性效應(yīng)終點以及高通量的定量定性檢測方法，是類器官毒理學研究的核心任務(wù)。建立基于形態(tài)學、組織/細胞功能、生物化學和基因調(diào)控等由宏觀到微觀的多層次毒性效應(yīng)終點和測定方法[73-74]，有利于深入評估化學品的毒性效應(yīng)和機理。由于在類器官培養(yǎng)中使用了骨架材料、Transwell培養(yǎng)板或其他器件和材料，用于單層細胞培養(yǎng)的毒理學表征方法，需經(jīng)改進后應(yīng)用于3D類器官模型，避免基質(zhì)等材料的干擾[10, 75]。利用毒理組學技術(shù)(包括轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學等)有助于全面篩查敏感分子靶標、預測有害效應(yīng)及闡明毒性作用模式。近年來發(fā)展迅速的單細胞測序方法[76]，尤其適合于對類器官中不同類型的細胞進行轉(zhuǎn)錄組學分析，對于揭示細胞特異性的毒性機制、細胞間相互作用和細胞-基質(zhì)間相互作用等毒理學問題具有重要意義。基于細胞培養(yǎng)微孔板的類器官構(gòu)建體系有利于實現(xiàn)毒性高通量評估，可同時進行多種化學品毒性測試，該法僅需少量受試化學品，適合于價格昂貴或處于研發(fā)階段的新化學品。

類器官模型不僅適用于毒性效應(yīng)和機制的基礎(chǔ)研究，還將顯著促進化學品的健康風險評價和管理?；陬惼鞴倌Ｐ偷亩纠韺W研究結(jié)果在化學品健康風險評價中具有以下幾方面重要作用。(1)危害鑒定：利用類器官毒性測試篩選潛在的靶器官毒物，為更深入的毒性評價建立優(yōu)先測試化學品清單，提高化學品毒性測試效率、減少動物實驗。可結(jié)合類器官毒理學評價結(jié)果和其他方面的研究結(jié)果，利用證據(jù)權(quán)重法(weight-of-evidence)進行化學品危害鑒定。(2)識別毒性作用模式(mode of action, MOA)和AOP：類器官毒理學研究有利于識別化學品在分子、細胞和組織水平的毒性效應(yīng)，進而有助于闡明化學品的毒性作用機理、MOA和AOP，為化學品風險評價和管理提供重要依據(jù)。(3)劑量-效應(yīng)關(guān)系評定：利用體外體內(nèi)外推法(invitrotoinvivoentrapolation, IVIVE)[77]，結(jié)合計算毒理學模型，可根據(jù)類器官毒理學研究結(jié)果估測在動物/人體內(nèi)產(chǎn)生毒性效應(yīng)所需的化學品劑量。(4)風險表征：風險表征是化學品風險評價的最后步驟，需綜合分析危害鑒定、暴露評價和劑量-效應(yīng)關(guān)系的結(jié)果，判斷發(fā)生某種危害的可能性，類器官毒理學研究結(jié)果為風險表征提供實驗依據(jù)。此外，類器官毒理學研究結(jié)果有助于建立基于靶器官毒性和MOA的更精準的不確定性系數(shù)，提高風險評價的科學性和準確性。

類器官毒理學的發(fā)展，將顯著提升毒理學基礎(chǔ)研究能力以及對化學品風險評價和管理的支撐作用。目前國內(nèi)外類器官毒理學的研究均處于起步階段，尚有較多關(guān)鍵的科學和技術(shù)問題有待攻克。我國少量研究機構(gòu)在類器官模型的組織工程構(gòu)建方面已取得了較為突出的進展，但在化學品毒理學評價領(lǐng)域的研究極為有限?；瘜W品毒理學評價急需建立高產(chǎn)量、高通量、靈敏的類器官毒理學模型，研究其對化學品暴露的毒性響應(yīng)特征和機理，需要細胞和組織工程、毒理學體外/體內(nèi)實驗研究和計算毒理學等多學科交叉合作，同時急需相關(guān)領(lǐng)域?qū)I(yè)人才培養(yǎng)。