李婷婷，王書夢，項 艷

0 引言

膿毒血癥是一種死亡率極高的全身性炎癥反應疾病，嚴重威脅著患者的生命健康[1]。嚴重膿毒血癥患者可出現(xiàn)多器官功能衰竭，而腎臟是最容易受損的臟器之一[2]。因此，緩解膿毒血癥引起的腎臟損傷具有重要的臨床意義。穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide，AG)是從中藥穿心蓮中提取分離得到的一種二萜內(nèi)酯類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[3-5]。近年來研究顯示，AG對膿毒血癥大鼠肝損傷具有保護作用，該作用與抑制NF-κB信號通路有關[6]。但由于AG口服生物利用度較差，很難應用于臨床。

近年來，納米給藥系統(tǒng)在醫(yī)藥領域得到了廣泛發(fā)展，因其可提高藥物的溶解度和生物利用率，解決了許多難溶性或難吸收藥物的給藥問題。脂質(zhì)聚合物納米粒(Lipid-polymer hybrid nanoparticles，LPNs)是納米給藥系統(tǒng)的一種，目前已應用于遞送藥物和診斷成像劑等領域[7]。為了解決AG的口服生物利用度，本研究通過納米沉淀法制備載穿心蓮內(nèi)酯脂質(zhì)聚合物納米粒(AG-LPNs)并對其進行表征，通過建立膿毒血癥大鼠模型，觀察AG-LPNs對膿毒血癥腎損傷的保護作用。

1 材料

1.1 動物 雄性清潔級SD大鼠60只，180～200 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，[SCXK(京)2016-0001]，動物飼養(yǎng)于清潔級動物房中，每籠3～4只，自由飲水、攝食，12 h光照/12 h黑暗，溫度20～25℃，相對濕度40%～70%。

1.2 試劑 穿心蓮內(nèi)酯原料藥(分子式：C20H30O5；含量>98%)和聚乳酸-羥基乙酸共聚物購自大連美侖生物科技有限公司；穿心蓮內(nèi)酯標準品購自中國藥品生物制品檢定所；大豆卵磷脂購自德國Lipoid公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇購自上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司；血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)和腎損傷分子-1(KIM-1)檢測試劑盒購自深圳邁瑞生物公司；乙腈購自德國Merck公司；無水乙醇購自國藥集團上海化學試劑公司；RPMI裂解液，BCA蛋白定量試劑盒，TUNEL、HE染色試劑盒購自北京索萊寶公司。Bcl-2抗體、Bax抗體、Caspase-3抗體、GAPDH抗體、抗兔IgG-HRP二抗購自上海愛必信公司。

1.3 實驗儀器 SIGMA 2-16K離心機(美國Sigma公司產(chǎn)品)；Agilent1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司產(chǎn)品)；Nano ZS 90激光粒度儀(英國Malvern公司產(chǎn)品)；R206型旋轉蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司產(chǎn)品)；JEM-2100場發(fā)射透射電子顯微鏡(日本電子株式會社產(chǎn)品)；AI600凝膠成像儀(美國GE公司產(chǎn)品)。

2 方法

2.1 AG-LPNs的制備 采用納米沉淀法制備AG-LPNs。將23 mg磷脂用250 μl無水乙醇溶解，分散到20 ml去離子水中，65 ℃水浴，300 r/min攪拌30 min，此為水相備用。將60 mg 聚乳酸-羥基乙酸共聚物和10 mg AG用10 ml乙腈溶解，作為有機相。將有機相與水相混合，100 r/min攪拌2 h。37 ℃旋轉蒸發(fā)，除去乙腈。將得到的溶液4 000 r/min離心10 min，除去未包載的AG沉淀，得到AG-LPNs，冷藏備用。

包封率測定：將AG-LPNs分散液中加入乙腈，超聲破乳，0.45 μm針式濾器過濾，取濾液經(jīng)高效液相色譜測定AG含量。同時取AG-LPNs于超濾離心管中，3 000 r/min離心10 min，用高效液相色譜測定其AG含量。

粒徑和電位測定：采用激光粒度儀測定AG-LPNs粒徑和Zeta電位。

形態(tài)觀察：取制備的AG-LPNs，去離子水稀釋，將樣品滴加到銅網(wǎng)上，自然干燥，利用透射電鏡觀察納米粒的形態(tài)。

2.2 膿毒血癥模型建立和分組給藥 參考文獻[6]，采用盲腸結扎法制備膿毒血癥大鼠模型。用異氟烷將大鼠麻醉并仰臥位固定于手術臺面上，剪開腹部，暴露盲腸并結扎。假手術組進行手術，但不結扎。將模型大鼠隨機分為模型組、AG組、AG-LPNs組。同時以只進行手術，但不結扎的大鼠作為假手術組。術后12 h開始灌胃給藥。AG組和AG-LPNs組給予AG量50 mg/kg，假手術組和模型對照組給予等體積生理鹽水，每12小時給藥1次，連續(xù)給藥3 d。

2.3 血液中Scr和BUN測定 取大鼠靜脈血，室溫下靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA試劑盒進行檢測，檢測波長為450 nm，記錄吸光度值，參考說明書制作標準曲線，計算樣品Scr和BUN濃度。

2.4 尿液中NGAL和KIM-1的測定 收集大鼠尿液，尿液靜置后1 500 r/min離心5 min，取上層液進行檢測，計算NGAL和KIM-1濃度。

2.5 TUNEL染色檢測腎臟細胞凋亡情況 將腎臟組織置于10%中性福爾馬林中固定，而后修剪、脫水、透明、石蠟包埋，制作切片，加入細胞通透液處理8 min，冰浴孵育，按說明書進行TUNEL染色，滴加50 μl TUNEL染色液37 ℃濕盒內(nèi)孵育1 h，PBS洗2遍，熒光顯微鏡下觀察和拍照。

2.6 HE染色檢測腎臟組織病理變化 將腎臟組織制成切片，經(jīng)梯度二甲苯脫蠟，梯度酒精至水，自來水沖洗，切片分別以伊紅和蘇木素染色，自來水沖洗，酒精脫水，二甲苯透明，稍晾干后，中性樹膠封片，顯微鏡觀察并拍照。

2.7 蛋白印記實驗檢測腎臟組織Bcl-2、Bax及Caspase-3表達水平 腎臟組織經(jīng)RPMI裂解液提取總蛋白，以BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，然后制備蛋白樣品，樣品經(jīng)PAGE電泳分離蛋白，后將分離的蛋白轉印至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉4 h，4 ℃孵育Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶2 000)及caspase-3(1∶1 000)抗體過夜。TBST洗膜后孵育抗兔IgG-HRP二抗1 h。膜經(jīng)TBST洗后淋ECL發(fā)光液，置于凝膠成像儀下成像。

3 結果

3.1 AG-LPNs體外表征 如圖1所示，AG-LPNs的平均動力學直徑分別為(180±23) nm，Zeta電位為(-18±2.6) mV，其包封率和載藥量分別為86%和12%。透射電鏡下，AG-LPNs外觀呈均一的球形，可見明顯的核殼結構。

圖1 AG-LPNs體外表征圖注：A.AG-LPNs粒徑，B.AG-LPNs電位，C.透射電鏡下AG-LPNs形態(tài)

3.2 大鼠血清和尿液指標檢測 如表1所示，與假手術組相比，模型組大鼠血清Scr和BUN升高，尿液中NGAL和KIM-1升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；相較于模型組，AG組和AG-LPNs組Scr、BUN、NGAL、KIM-1均下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與AG組相比，AG-LPNs組Scr、BUN、NGAL、KIM-1下調(diào)更為顯著,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠Scr、BUN、NGAL、KIM-1水平比較

3.3 大鼠腎臟細胞凋亡分析 如圖2所示，與假手術組相比，模型組細胞凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，AG組和AG-LPNs組細胞凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.01)，其中AG-LPNs組細胞降低更為明顯(P<0.01)。

圖2 各組大鼠腎臟組織細胞凋亡水平注：與假手術組相比，## P<0.01；與模型組相比，## P<0.01；與AG組相比，△△P<0.01

3.4 大鼠腎臟組織HE染色 如圖3所示，與假手術組相比，模型組腎臟組織可見廣泛腎小管擴張，腎小管上皮細胞空泡、變性、脫落，同時腎臟組織還可見明顯的炎性細胞浸潤和核質(zhì)分離現(xiàn)象。AG和AG-LPNs組出現(xiàn)明顯改善，其中AG-LPNs組改善更為明顯。

圖3 各組大鼠腎臟組織HE染色

3.5 大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax及Caspase-3表達水平 如圖4所示，與假手術組相比，模型組腎臟組織Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.01)。與模型組相比，AG和AG-LPNs組Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達顯著下調(diào)，Bcl-2蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01)。與AG組相比，AG-LPNs組Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達顯著下調(diào)，Bcl-2蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01)

圖4 各組大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax及Caspase-3表達水平注：與假手術組相比，## P<0.01；與模型組相比，## P<0.01；與AG組相比，△△P<0.01

4 討論

近年來，納米技術在醫(yī)學中的應用取得了進步，極大地改善了小分子藥物、大分子生物藥品及診斷顯像劑等的臨床應用效果[8]。納米載體具有眾多優(yōu)勢，如改善藥物的整體藥代動力學、增強藥物的溶解性和生物利用度、增強藥物的靶向性、規(guī)避固有生物學障礙、遞送不同化學性質(zhì)的藥物等[9-10]。在眾多納米載體中，最突出的兩種為脂質(zhì)體和聚合物納米粒[11]。脂質(zhì)體具有良好的生物相容性，但其靶向分布欠佳[11-12]。而聚合物納米粒能夠有效控制藥物釋放，并在一定程度上提高藥物穩(wěn)定性，但其生物相容性較差[11-12]。因此，二者的應用都受到了一定的限制。LPNs具有殼核結構，兼有脂質(zhì)體和聚合物納米粒兩者的優(yōu)點[13]，具有較好的發(fā)展前景。

AG作為天然化合物，在抗炎、抗病毒及抗腫瘤等方面發(fā)揮一定作用[3-5]。但AG的口服生物利用度不高，為了解決這一問題，本研究制備了AG-LPNs。結果顯示，AG-LPNs外觀呈均一的球形，可見明顯的核殼結構。檢測AG-LPNs直徑、Zeta電位、包封率和載藥量，確定其可滿足實驗要求。本研究進一步構建了膿毒血癥模型大鼠，并發(fā)現(xiàn)模型大鼠血清Scr和BUN、尿液中NGAL和KIM-1明顯升高。研究證實，血清Scr、BUN以及尿液NGAL、KIM-1升高與腎損傷相關[14]。組織學檢測發(fā)現(xiàn)，模型組腎臟組織可見廣泛腎小管擴張、腎小管上皮細胞空泡變性以及脫落，并有明顯的炎性細胞浸潤和核質(zhì)分離現(xiàn)象。這提示本研究構建的膿毒血癥大鼠伴隨腎損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，AG和AG-LPNs治療均可降低模型大鼠血清Scr和BUN，以及尿液中NGAL和KIM-1水平，且AG-LPNs效果更為顯著。組織學分析結果顯示，AG和AG-LPNs均明顯改善了膿毒血癥大鼠腎臟組織細胞的病理變化，同樣AG-LPNs效果更佳。提示以LPNs載AG可增強后者對腎損傷的保護作用。TUNEL染色觀察腎臟組織凋亡情況發(fā)現(xiàn)，模型大鼠腎臟組織細胞凋亡增多，而AG和AG-LPNs可降低細胞凋亡水平，并且AG-LPNs的作用更具優(yōu)勢。在分子水平上，本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠腎臟組織Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達上調(diào)，以及Bcl-2蛋白表達下調(diào)，而AG和AG-LPNs可抑制模型大鼠腎臟組織上述3種蛋白表達變化，并且AG-LPNs的抑制作用更強。Bax和Bcl-2分別是促凋亡和抗凋亡蛋白中的代表成員；而Caspase-3作為凋亡的執(zhí)行者，其剪切體Cleaved Caspase-3增多與凋亡明顯相關[15-16]。提示AG-LPNs可調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2及Cleaved Caspase-3蛋白表達，從而抑制膿毒血癥腎損傷大鼠腎細胞凋亡。

與傳統(tǒng)脂質(zhì)體和聚合物納米粒相比，LPNs在藥物包封、控制藥物釋放及增強藥物攝取方面顯示出明顯優(yōu)勢[16]。這些可能是本研究AG-LPNs對膿毒血癥大鼠腎損傷具有較好保護作用的原因。但AG-LPNs在體內(nèi)的吸收轉運過程和作用機制仍需進一步研究。綜上所述，與AG相比，AG-LPNs對膿毒血癥大鼠腎損傷保護方面具有明顯優(yōu)勢，這一優(yōu)勢可能與AG-LPNs較強的抗凋亡作用有關。