宋 超，謝 育，王 冶，蒲勁松，陳 林，郭浩然，崔瀚文

0 引言

骨關節(jié)炎是一種多因素疾病，具有較高的致殘率，尚無有效的治療方法[1]。骨關節(jié)炎病理機制復雜，主要有炎性細胞因子的分泌、關節(jié)軟骨的機械性損傷以及軟骨細胞的凋亡，這些因素均能夠引起氧化應激反應[2]。核因子NF-E2相關因子(Nrf2)作為機體的關鍵氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子，對改善機體氧化應激狀態(tài)、促進細胞存活以及維持細胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)具有關鍵意義。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關酶1(SIRT1)是一種高度保守的NAD+依賴的蛋白去乙酰化酶類，具有調(diào)節(jié)有絲分裂、炎癥反應、氧化應激和抗凋亡等多種效應。有報道，Nrf2和SIRT1參與骨關節(jié)炎的病理發(fā)展，兩者激活是骨關節(jié)炎治療的潛在信號通路。

玫瑰樹堿提取于夾竹桃科植物，是一種生物堿，具有抗腫瘤和抗HIV活性[3]。玫瑰樹堿對神經(jīng)母細胞瘤和膀胱癌在內(nèi)的多種腫瘤均有活性，并且與細胞周期和凋亡信號有關[4-5]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰樹堿也具有抗炎活性，可以減弱脂多糖誘導的巨噬細胞活化和敗血性休克[6-7]。但玫瑰樹堿的抗骨關節(jié)炎活性研究較少，故本研究探討玫瑰樹堿對骨關節(jié)炎的治療作用及對Nrf2和SIRT1信號活化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 Nrf2、HO-1、SIRT1、p-AMPK和AMPK及β-actin抗體(Abcam，英國)；IL-6、IL-1β、TNF-α大鼠ELISA試劑盒(聯(lián)科，中國)；電子自動爪觸覺測試儀(瑞沃德，中國)；雙氯芬酸鈉腸溶片(北京諾華制藥有限公司，國藥準字H11021640)；玫瑰樹堿(上海陶術生物科技有限公司，中國)。

1.2 動物分組與給藥 根據(jù)文獻報道[8-9]，60只SPF級別雄性SD大鼠(220～250 g)隨機分為假手術組、模型組、玫瑰樹堿低劑量組(5 mg/kg)、中劑量組(10 mg/kg)、高劑量組(20 mg/kg)和陽性對照組(雙氯芬酸鈉腸溶片，4 mg/kg)，每組10只。術后2周灌胃給予玫瑰樹堿，模型組和假手術組大鼠給予等體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥3周。

1.3 骨關節(jié)炎大鼠模型建立 有報道，大鼠隔夜禁食12 h，使用右膝關節(jié)前交叉韌帶切斷術建立骨關節(jié)炎大鼠模型。腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，固定于操作臺，將右膝關節(jié)刮毛備皮后，用碘伏消毒，在無菌條件下于膝關節(jié)內(nèi)側(cè)切約1 cm縱向切口，然后用鑷子將韌帶拉到一側(cè)，切開內(nèi)側(cè)副韌帶以打開關節(jié)腔，同時小心切斷前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶和內(nèi)側(cè)半月板，縫合膝蓋皮膚和關節(jié)囊，術后連續(xù)肌肉注射4 d氨芐青霉素(4×104U/d)，假手術組大鼠切開并縫合膝蓋的皮膚和關節(jié)囊。

1.4 骨關節(jié)炎大鼠機械性異常疼痛 用電子自動爪觸覺測試儀測量大鼠PWT值，每周1次。簡要操作如下：將刺激針對準大鼠的足底，隨后逐漸增加刺激力量，待大鼠感到疼痛后，移開刺激針，設備將記錄并顯示刺激針瞬間移開的最大值，即PWT，測量時每5分鐘1次，連續(xù)3次，計算平均值。機械性異常性疼痛通過測量撤回閾值來校準的von Frey細絲進行評估。

1.5 骨關節(jié)炎大鼠關節(jié)炎評分 根據(jù)以下標準對大鼠的關節(jié)炎進行評分(0～4分)：無關節(jié)炎計0分；關節(jié)輕度發(fā)紅腫脹計1分；關節(jié)中度發(fā)紅腫脹計2分；關節(jié)嚴重發(fā)紅腫脹計3分；關節(jié)嚴重發(fā)炎，并且負重困難計4分。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測量炎癥因子含量 待給藥結(jié)束后，大鼠腹主動脈取血，隨后于室溫條件下靜置0.5 h，然后置于4 ℃離心機3 000 r/min離心15 min，吸取并收集上清，分裝置于-80 ℃冰箱，或采用大鼠ELISA試劑盒檢測大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量。

1.7 組織病理學觀察 大鼠脫頸椎處死，分離并收集大鼠膝關節(jié)滑膜組織，將組織切一小塊放入10%福爾馬林溶液，在室溫下固定24 h。清洗大鼠組織標本，隨后轉(zhuǎn)移至EDTA脫鈣液(0.5 M，pH 8)，在37 ℃條件下脫鈣6周，脫鈣期間隔3 d換1次液，將脫鈣的組織石蠟包埋，使用石蠟切片機將包埋組織切成4 μm薄片，最后蘇木精-伊紅(HE)和番紅固綠染色，顯微鏡觀察并拍照。

1.8 蛋白免疫印跡(Western blot)法 大鼠脫頸椎處死，分離并收集大鼠膝關節(jié)滑膜組織，稱一定量置于1.5 ml EP管，隨后加入少許蛋白裂解液，研磨儀組織勻漿，置于4 ℃離心機12 000 r/min離心15 min，吸取上清，BCA法蛋白定量，加入loading buffer(4×)于100 ℃煮沸，分裝儲存于-20 ℃冰箱或直接上樣用SDS-PAGE電泳分離蛋白，首先用80 V電壓跑膠30 min，待樣品進入分離膠后，用120 V電壓跑膠60 min。根據(jù)分離蛋白分子量不同，采用適當轉(zhuǎn)膜條件將分離后的蛋白從膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBS緩沖液(含0.1%吐溫)室溫洗滌3次，5 min/次，隨后使用稀釋后的一抗(Nrf2、HO-1、SIRT1、AMPK和β-actin，按1∶1 000稀釋；p-AMPK，按1∶500稀釋)4 ℃孵育過夜，TBS緩沖液(含0.1%吐溫)洗膜5次，5 min/次，用HRP標記山羊抗兔IG和HRP標記山羊抗鼠IG(按1∶20 000稀釋)室溫條件下置于搖床孵育90 min，最后用增強型化學發(fā)光試劑顯影反應，并置于成像系統(tǒng)獲取目的條帶圖像。

2 結(jié)果

2.1 玫瑰樹堿對骨關節(jié)炎大鼠關節(jié)炎評分和機械性痛閾的影響 模型組大鼠的關節(jié)炎指數(shù)較假手術組明顯增加；玫瑰樹堿中劑量、高劑量和陽性對照組大鼠的關節(jié)炎指數(shù)較模型組均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖1A)。PWT結(jié)果表明，模型組大鼠的機械性痛閾值較假手術組明顯降低，玫瑰樹堿各劑量組和陽性對照組大鼠的機械性痛閾值較模型組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖1B)。

圖1 玫瑰樹堿對骨關節(jié)炎大鼠關節(jié)炎指數(shù)和機械性痛閾值的影響注：A.骨關節(jié)炎大鼠的關節(jié)炎評分；B.骨關節(jié)炎大鼠的機械性痛閾值。與假手術組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 玫瑰樹堿對骨關節(jié)炎大鼠血清中炎癥細胞因子的影響 模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；玫瑰樹堿各劑量組和陽性對照組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 玫瑰樹堿對骨關節(jié)炎大鼠血清中炎癥細胞因子的影響注：A.骨關節(jié)炎大鼠血清中IL-1β含量；B.骨關節(jié)炎大鼠血清中IL-6含量；C.骨關節(jié)炎大鼠血清中TNF-α含量。與假手術組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

2.3 玫瑰樹堿對骨關節(jié)炎大鼠骨關節(jié)病理學形態(tài)的影響 見圖3。模型組大鼠的關節(jié)軟骨較假手術組薄，軟骨細胞的數(shù)量顯著減少，番紅固綠染色發(fā)現(xiàn)軟骨聚糖有所損失。與模型組比較，玫瑰樹堿各劑量組和陽性對照組大鼠的關節(jié)軟骨較模型組增厚，并且軟骨細胞和蛋白聚糖增加。

2.4 玫瑰樹堿對骨關節(jié)炎大鼠滑膜組織中Nrf2信號蛋白表達的影響 模型組大鼠滑膜組織中Nrf2和HO-1蛋白表達水平高于假手術組(P<0.05)；玫瑰樹堿各劑量組和陽性對照組大鼠滑膜組織中Nrf2和HO-1蛋白表達水平高于模型組(P<0.05)。見圖4、表1。

圖4 玫瑰樹堿對骨關節(jié)炎大鼠滑膜組織中Nrf2信號蛋白表達的影響

表1 蛋白免疫印跡條帶統(tǒng)計結(jié)果

2.5 玫瑰樹堿對骨關節(jié)炎大鼠滑膜組織中SIRT1信號蛋白表達的影響 模型組大鼠滑膜組織中SIRT1和p-AMPK/AMPK蛋白表達水平較假手術組明顯減少；玫瑰樹堿各劑量組和陽性對照組大鼠滑膜組織中SIRT1和p-AMPK/AMPK蛋白表達水平較模型組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5、表1。

圖5 玫瑰樹堿對骨關節(jié)炎大鼠滑膜組織中SIRT1信號蛋白表達的影響

3 討論

骨關節(jié)炎的臨床癥狀特點主要為慢性關節(jié)疼痛、腫脹以及活動受限，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[10-11]。膝關節(jié)前交叉韌帶術能夠建立骨關節(jié)炎動物模型，表現(xiàn)骨關節(jié)炎的臨床特點，因此被廣泛應用于骨關節(jié)炎的病理和藥物研究[11]。本研究首先采用膝關節(jié)前交叉韌帶術建立骨關節(jié)炎大鼠模型，結(jié)果表明,模型組大鼠關節(jié)炎癥狀明顯，主要是關節(jié)腫脹和疼痛。此外，玫瑰樹堿對骨關節(jié)炎大鼠的關節(jié)腫脹和疼痛具有緩解效應，說明玫瑰樹堿是一種潛在的治療骨關節(jié)炎的藥物。

骨關節(jié)炎的病理特點主要表現(xiàn)為軟骨基質(zhì)降解、滑膜炎和軟骨細胞減少等[12]。本研究病理染色發(fā)現(xiàn)，骨關節(jié)炎大鼠出現(xiàn)了明顯的關節(jié)炎癥狀，包括基質(zhì)降解，表現(xiàn)為軟骨表面侵蝕、較薄的軟骨和蛋白聚糖損失。玫瑰樹堿治療后，軟骨表面完整，軟骨細胞和蛋白多糖減少明顯緩解，表明玫瑰樹堿能夠緩解骨關節(jié)炎大鼠的軟骨基質(zhì)降解。滑膜炎與骨關節(jié)疾病的疼痛和腫脹直接相關，病理條件下，炎性細胞能夠大量浸潤關節(jié)滑膜，進而釋放大量的炎癥細胞因子、趨化因子以及蛋白酶，引起關節(jié)基質(zhì)降解和骨質(zhì)破壞，促使關節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展[13]。骨關節(jié)炎病理變化過程涉及大量的促炎細胞因子，IL-1β、TNF-α和IL-6尤為關鍵[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰樹堿能夠抑制骨關節(jié)炎大鼠血清中炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6的釋放。

Nrf2信號通路主要負責細胞抵抗氧化應激和生理上維持細胞氧化還原平衡。一些研究表明，Nrf2信號在調(diào)節(jié)炎癥反應中起關鍵作用，其功能障礙表現(xiàn)為對炎癥疾病的易感性[16]。Nrf2是調(diào)節(jié)抗氧化基因(包括HO-1)表達的轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2/HO-1信號在炎癥疾病的病理變化過程中具有重要影響[17]。Nrf2敲除小鼠的關節(jié)基質(zhì)出現(xiàn)嚴重損傷，提示Nrf2/HO-1信號是骨關節(jié)炎治療的潛在靶點[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰樹堿能夠上調(diào)Nrf2和HO-1蛋白表達，激活骨關節(jié)炎大鼠滑膜組織中Nrf2信號。有報道，SIRT1能夠抑制炎癥反應，還能夠調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號活化[19]。同時，SIRT1的激活可以增加骨關節(jié)炎患者軟骨細胞中軟骨特異性基因SOX9的表達、聚集蛋白聚糖和膠原蛋白[20]。SIRT1還可以通過下調(diào)蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)或增加Bcl-2的表達來調(diào)節(jié)人軟骨細胞的凋亡[21]。SIRT1能夠通過使蛋白激酶RNA樣的ER激酶(PERK)脫乙?；p弱PERK-eIF-2α-CHOP軸，促進軟骨形成和骨縱向生長，SIRT1的激活和抑制也可以調(diào)節(jié)AMPK的活性[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰樹堿上調(diào)SIRT1蛋白的表達以及AMPK磷酸化，激活SIRT1信號通路。上述結(jié)果表明，玫瑰樹堿能夠調(diào)節(jié)骨關節(jié)炎大鼠滑膜組織中SIRT1-Nrf2信號活化，參與骨關節(jié)炎的治療作用。

綜上所述，玫瑰樹堿能夠緩解骨關節(jié)炎癥狀和病理損傷，并且可能與激活滑膜組織中SIRT1-Nrf2信號通路有關。但玫瑰樹堿對SIRT1-Nrf2信號通路激活是否是直接作用，仍需進一步研究。

致謝：感謝川北醫(yī)學院基礎醫(yī)學院吳旦老師在動物實驗上給予的支持和幫助