周帥，韓戰(zhàn)營，遲驍瑋

(1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院心內科，河南 450052；2.國家衛(wèi)生健康委員會醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心，北京 100044)

急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)主要是由動脈粥樣硬化斑塊破裂導致組織因子和膠原蛋白的暴露引發(fā)血小板活化與聚集而引起，最終形成血栓[1-2]。作為冠心病中發(fā)病率、死亡率最高的類型，主要包括不穩(wěn)定性心絞痛、非ST段抬高型心肌梗死和ST段抬高型心肌梗死[3]。血小板在ACS血栓形成的過程中發(fā)揮著重要的作用，故抗血小板藥是目前抗血栓形成的主要治療策略[4-5]。

替格瑞洛是環(huán)戊基三唑嘧啶類新型口服抗血小板藥物，可逆性地與P2Y12受體結合，于2012年通過原國家食品藥品監(jiān)督管理局(NMPA)審批正式進入中國市場[6]。PLATO研究表明，替格瑞洛可顯著降低心血管死亡、心肌梗死及腦卒中發(fā)生率及死亡率，不良反應較小[7]。與傳統(tǒng)P2Y12受體拮抗劑比較，替格瑞洛具有起效迅速，停藥后恢復較快，不受年齡、性別、飲食影響等優(yōu)勢[8]。研究表明，替格瑞洛口服后吸收迅速，主要分布于血液，可與血漿蛋白廣泛結合(>99%)[9-10]；該藥大部分經CYP3A5代謝生成活性代謝產物AR-C124910XX，部分經CYP3A4代謝生成AR-C133913XX，此外，替格瑞洛主要由P糖蛋白(P-gp)等轉運體進行外排[11]。食物及藥物等同服均可影響其體內的代謝清除，HOLMBERG等[12]研究發(fā)現連續(xù)服用西柚汁可抑制CYP3A進而使替格瑞洛的血藥峰濃度(Cmax)及血藥濃度-時間曲線下面積(AUC)增加65%和121%，使消除半衰期延長1.1倍。而與利福平同服后，健康志愿者體內替格瑞洛的Cmax、AUC和t1/2分別降低73%，86%和67%[13]。

復方丹參膠囊主要由丹參、三七及冰片組成，其中酚酸類具有提高機體纖溶及抗凝活性、抗血栓、抗血小板聚集、抗氧化、保護心臟微血管內皮細胞、改善微循環(huán)障礙等作用[14]；皂苷類可顯著改善血管內皮細胞功能、抑制血管平滑肌細胞增殖、抗血栓形成、擴張血管及保護心肌[15]。有研究發(fā)現丹參提取物可顯著增強抗血小板聚集活性[16]。復方丹參膠囊也可顯著提高氯吡格雷的抗血栓、抗血小板聚集、抗氧化等作用[17]，故常與替格瑞洛合用于心血管疾病治療中。研究發(fā)現，丹參提取物可調控CYP3A活性[18]，但復方丹參膠囊對替格瑞洛藥動學的影響未見報道，因此，筆者研究了復方丹參膠囊對替格瑞洛在大鼠體內藥動學的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1儀器 液質聯用系統(tǒng)(AB ScieX Qtrap 4000三重四級桿質譜儀；安捷倫1100高效液相色譜系統(tǒng)；Analyst TF 1.5 Software數據采集分析軟件)；冷凍高速離心機(美國Thermo Fish公司)；超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；超微量電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，感量：0.1 mg)；微量移液器(德國Eppendorf公司)。

1.2藥品與試劑 復方丹參膠囊(規(guī)格：每粒30 mg，批號：D17A005，云南白藥集團股份有限公司)；替格瑞洛片(規(guī)格：每片90 mg，批號：TDKT，阿斯利康制藥有限公司)；替格瑞洛對照品(批號：L1613016，含量：99.5%，上海阿拉丁公司，貨號：T125095)；咪達唑侖對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量：99.8%，貨號：130557，批號：130557-201604)；CYP3A2抗體(美國Abcam公司，批號：ab195627)；RNAiso Plus(Takara公司，批號：9108)；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技，批號：KR106-03)；SuperReal PreMix熒光定量PCR試劑盒(天根生化科技，批號：FP205)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；醋酸銨(分析純，美國Fisher公司)；甲酸(分析純，上海阿拉丁有限公司)，所有其他溶劑和化學試劑均為分析純或以上。

1.3實驗動物 Sprague-Dawley大鼠，SPF級，雄性，體質量200～240 g，購自北京維通利華技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2017-0028，飼養(yǎng)于河南省實驗動物中心。大鼠的飼養(yǎng)、使用、操作等均符合中國《實驗動物管理條例》。大鼠于室溫18～24 ℃，相對濕度(65±5)%，明暗交替12 h的條件下環(huán)境適應性飼養(yǎng)7 d后用于實驗。本研究中動物實驗方案獲得鄭州大學實驗動物管理與使用委員會批準。

1.4方法

1.4.1藥動學實驗 采用平行對照實驗，16只雄性大鼠適應性飼養(yǎng)后隨機分為兩組，對照組與復方丹參膠囊組，分別連續(xù)7 d每天灌胃給予等量0.9%氯化鈉溶液、復方丹參膠囊(將18 mg復方丹參膠囊溶于0.9%氯化鈉溶液1 mL中，制備成復方丹參膠囊灌胃用制劑18 mg·mL-1，按大鼠體質量每200克給予1 mL復方丹參膠囊灌胃用制劑，即給藥劑量為90 mg·kg-1)。第8天給藥前12 h禁食不禁水，第8天分別給予兩組大鼠0.9%氯化鈉溶液、復方丹參膠囊30 min后，灌胃給予兩組大鼠替格瑞洛(將4 mg替格瑞洛溶于0.9%氯化鈉溶液1 mL中制成替格瑞洛溶液灌胃用制劑4 mg·mL-1，按大鼠體質量每200克給予1 mL替格瑞洛灌胃用制劑。即給藥劑量為20 mg·kg-1，i.g.)，并在給藥前、給藥后0.08，0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，6，8，10，24及36 h于大鼠眼內眥采血0.25 mL，置于肝素鈉抗凝的離心管中，3000 r·min-1離心10 min(r=10 cm)，取血漿置于-80 ℃保存待測。

1.4.2肝微粒體的制備 大鼠藥動學實驗完成后，采用烏拉坦(50%，W/V)腹腔注射麻醉，取出肝臟，用預冷的沖洗液沖洗肝臟2或3次至土黃色并用濾紙吸干，剪取同部位肝臟組織在冰浴條件下切碎，按1：4加入的Tris-HCl(0.05 mol·L-1)制備肝勻漿液。采用差速離心法制備大鼠肝微粒體，9000×g4 ℃離心20 min，小心取上清液后100 000×g4 ℃離心60 min，棄上清液，沉淀用Tris-HCl(0.15 mol·L-1)洗滌，100 000×g4 ℃離心60 min，所得肝微粒體均勻混懸于蔗糖(250 mmol·mL-1)中，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用考馬斯亮藍法測定肝微粒體總蛋白濃度。

1.4.3復方丹參膠囊對大鼠肝臟CYP3A mRNA表達的影響 藥動學實驗結束后采取腹主動脈采血并處死各組大鼠，分別取出兩組大鼠的肝臟置于干冰中。用RNA提取試劑盒提取肝組織中總RNA，將RNA用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒反轉錄成cDNA模板，取稀釋后的cDNA 4 μL，分別加入CYP3A1及CYP3A2的引物和熒光標記探針，利用SuperReal PreMix熒光定量PCR試劑盒，在iQ5熒光定量PCR儀(Bio-Rad Laboratories)上進行擴增反應(反應參數見表1)，檢測mRNA表達水平?；虮磉_數據用內參β-actin進行校正，相對表達差異采用熒光定量PCR實驗中常用的ΔΔCt的方法。

表1 CYP3A1和CYP3A2基因引物序列

1.4.4復方丹參膠囊對大鼠肝臟CYP3A2蛋白表達的影響 提取肝組織中總蛋白，采用SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，采用5%BSA封閉2 h后孵育一抗，加入一抗(1：600)、β-actin(1：3000)，4 ℃孵育過夜。在室溫條件下采用搖床將二抗孵育2 h。采用Tris-HCl與吐溫等滲緩沖鹽溶液(TBST)將PVDF膜洗滌3次，每次15 min，加入化學發(fā)光顯色試劑(ECL)顯色劑。應用凝膠成像系統(tǒng)檢測，分析目的條帶/對應內參的相對表達量。

1.4.5復方丹參膠囊對大鼠肝臟CYP3A酶活性的影響 采用CYP3A特異性探針底物咪達唑侖(midazolam，MDZ)來檢測酶活性。肝微粒體孵育反應體系為100 μL，在大鼠肝微粒體(0.3 mg·mL-1)中分別加入MDZ(20，50，100 μmol·L-1)，磷酸鹽(PBS)緩沖液(0.1 mol·L-1，pH值7.4)，于37 ℃預孵育5 min，加入NADPH(1 mmol·L-1)啟動反應，孵育20 min后將樣品迅速置于冰浴中，并立即加入冰乙腈終止反應，渦旋振蕩2 min，15 000×g離心10 min，取上清液20 μL進樣。代謝消除率=(加入探針底物的量-測得探針底物的量)/加入探針底物的量。

1.4.6測定方法 按照文獻中大鼠血漿中替格瑞洛的測定方法[19-20]，對所采用的方法分別進行了專屬性、線性、精密度與回收率、基質效應及穩(wěn)定性等驗證，結果均符合《中華人民共和國藥典》2020年版生物樣品定量分析要求。具體條件如下。

(1)色譜條件。色譜柱為Phenomenex C18(2.1 mm×50 mm，2.1 μm)；進樣量：5 μL；流動相：甲醇-0.1%甲酸(80：20)；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；內標：硝苯地平。替格瑞洛在大鼠血漿中的線性范圍為5～2000 ng·mL-1。

(2)質譜條件。采用負離子電噴霧離子源多反應模式進行監(jiān)測，替格瑞洛和內標(硝苯地平)的離子對分別為m/z521.4→361.1，內標528.3→368.1。替格瑞洛的去簇電壓(DP) 和碰撞能(CE) 值分別為-99.26 V和-32.56 V；內標的去簇電壓(DP) 和碰撞能(CE) 值分別為-55.35 V和-42.85 V；掃描時間100 ms，碰撞氣壓95.05 kPa，氣簾氣325.90 kPa，離子源噴射電壓5500 V，離子源溫度600 ℃，源內氣體1(GS1)425.30 kPa，源內氣體2(GS2) 385.05 kPa。

(3)血漿樣品處理。采用蛋白沉淀法處理血漿樣品。取血漿樣品100 μL，加入含內標的沉淀劑(甲醇：乙腈=1：1)400 μL，渦旋1 min，14000 r·min-1離心10 min(r=10 cm)，取上清液5 μL進樣分析。

1.4.7方法學驗證

(1)專屬性。分別取空白血漿、空白血漿及替格瑞洛、大鼠給藥后血漿樣品，按“2.5”項下方法處理。結果顯示，血漿內源性物質基本對替格瑞洛和內標的測定無干擾。替格瑞洛與內標的峰形良好，分離良好，保留時間分別為2.42，3.49 min，表明方法學專屬性好，可滿足生物樣品的測定要求。

(2)線性范圍。采用加權(W=1/x2)最小二乘法，以待測物與內標的峰面積比值(Y)分別對替格瑞洛的濃度(X)進行線性回歸，替格瑞洛的回歸方程為：Y=7.63×10-4X-4.28×10-4(r=0.998 8)。線性范圍為5～2000 ng·mL-1，最低定量下限為5 ng·mL-1，說明方法靈敏度較高。

(3)精密度與回收率。分別精密量取對照品溶液與空白血漿渦旋混勻，制成低、中、高3種質量濃度(10，100，1000 ng·mL-1)，按“2.5”項下方法處理，連續(xù)3 d進行測定，替格瑞洛日內精密度RSD分別為7.2%，5.9%，3.4%，日間精密度RSD分別為9.6%，7.1%，3.5%，回收率分別為(90.3±2.4)%，(91.7±3.6)%，(94.6±4.5)%。內標的回收率為(92.8±1.9)%。

(4)穩(wěn)定性。制備中濃度(100 ng·mL-1)的替格瑞洛標準血漿樣品，按“2.5”項下方法處理，分別置于室溫下4 h、4 ℃自動進樣器中10 h、-20 ℃反復凍融3次及-20 ℃放置30 d，考察不同存放條件下樣品的穩(wěn)定性。4種條件下RSD均<8.7%。表明處理后的樣品在上述4種條件下穩(wěn)定性符合生物樣本的分析要求。

(5)基質效應。分別取空白血漿，按“1.4.5”項下方法處理，分別加入低、中、高濃度的標準品溶液，渦旋后進行測定(A)，同時測定相同濃度的對照品溶液(B)，以兩者峰面積比值(A/B)求得基質效應。替格瑞洛的基質效應分別為85.2%，89.3%和92.1%。內標溶液經同法處理，計算得基質效應為91.7%。表明本方法基質效應符合生物樣本的分析要求。

2 結果

2.1復方丹參膠囊對替格瑞洛大鼠體內藥動學的影響 兩組大鼠血漿中替格瑞洛的時間-藥物濃度曲線見圖1，相應的藥動學參數見表2。由結果可知，與對照組比較，復方丹參膠囊組大鼠血漿中替格瑞洛Cmax、AUC0-t及AUC0-∞顯著降低32.03%，30.65%及30.89%(P<0.01)，而CL/F、Vz/F顯著升高至1.43及1.37倍(P<0.01)。

2.2復方丹參膠囊對大鼠肝臟CYP3A1及CYP3A2 mRNA表達的影響 與對照組比較，復方丹參膠囊組的CYP 3A1及 CYP 3A2 mRNA表達水平均增加至對照組(1.23±0.57)及(3.33±1.19)倍(P<0.05)。結果表明，復方丹參膠囊可能誘導CYP3A2 mRNA表達，但對CYP3A1 mRNA表達無顯著性影響(P>0.05)。見圖2。

圖1 替格瑞洛在大鼠體內的血藥濃度-時間曲線

2.3復方丹參膠囊對大鼠肝臟CYP3A2蛋白表達的影響 與對照組比較，復方丹參膠囊組肝臟CYP3A2蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

2.4復方丹參膠囊對大鼠CYP3A酶活性的影響 對照組及復方丹參膠囊組大鼠肝微粒體CYP3A底物MDZ的代謝消除率如表3所示。由此可知，復方丹參膠囊可誘導大鼠CYP3A酶活性。

3 討論

研究表明，復方丹參膠囊可提高抗血小板聚集，抗血栓形成、抗氧化等藥理活性，具有顯著降低心血管不良事件，且常與抗血小板藥物合用[8]。本實驗所選用復方丹參膠囊及替格瑞洛的劑量為80及20 mg·kg-1，均為所對應的臨床等效劑量，且選用平行對照多劑量給藥，更符合臨床用藥規(guī)律。藥動學結果顯示，單次灌胃給予大鼠替格瑞洛(20 mg·kg-1)后替格瑞洛在大鼠體內約1.13 h達到峰濃度，吸收速度較快；消除半衰期也較短，表觀分布容積較大。此結果與文獻[10]中研究結果相似。

連續(xù)7 d灌胃給予復方丹參膠囊后，大鼠體內替格瑞洛的Cmax、AUC0-t及AUC0-∞顯著降低(P<0.05)，

且使替格瑞洛的CL/F、Vz/F顯著升高(P<0.05)。暴露量的降低可能由吸收減少、代謝增多、分布增多所致。因替格瑞洛在人體內主要經CYP3A5代謝生成活性代謝產物AR-C124910XX，并經CYP3A4催化生成AR-C133913XX，而在大鼠體內CYP3A1/CYP3A2為人體內CYP3A4/CYP3A5的同工酶。因此，筆者測定了連續(xù)7 d灌胃給予復方丹參膠囊后兩組大鼠CYP3A1及CYP3A2 mRNA表達的影響，結果發(fā)現CYP3A2 mRNA表達顯著升高。進一步檢測CYP3A2蛋白表達，結果發(fā)現大鼠肝臟中CYP3A2表達顯著升高，提示大鼠體內替格瑞洛暴露量的降低可能是因為復方丹參膠囊誘導肝臟CYP3A2表達，從而使其代謝增多。這與ZHOU等[17]的研究結果相似，他們發(fā)現復方丹參膠囊可誘導CYP3A，導致氯吡格雷體內暴露量減少。本研究結果表明，連續(xù)7 d灌胃給予復方丹參膠囊后可使大鼠體內替格瑞洛的暴露量降低，清除率加快，但半衰期無顯著性變化。由藥動學結果可知，復方丹參膠囊可致大鼠體內替格瑞洛清除率增加，表觀分布容積也增加，而半衰期無顯著性變化，其原因可能與復方丹參膠囊可調控大鼠體內的轉運體活性有關。

研究結果表明，連續(xù)7 d灌胃給予復方丹參膠囊(90 mg·kg-1)后大鼠肝臟的CYP3A2 mRNA及蛋白表達水平均顯著升高。筆者進一步探索了復方丹參膠囊對CYP3A酶活性的影響。為進一步觀察CYP3A活性表達水平，分別將對照組及復方丹參膠囊組(90 mg·kg-1)大鼠處死制備肝微粒體，采用肝微粒體孵育體系測定CYP3A活性，所選用復方丹參膠囊的劑量與臨床使用劑量等效。結果顯示，復方丹參膠囊組CYP3A探針底物MDZ的代謝消除率顯著增加，說明復方丹參膠囊可顯著升高CYP3A 酶活性，也進一步驗證了復方丹參膠囊可誘導CYP3A2酶表達活性，這與部分文獻報道一致[21-22]。但是，WANG等[18]研究發(fā)現丹參提取物對CYP3A表達無影響，且WANG等[23]發(fā)現隱丹參酮可抑制CYP3A活性，其原因可能與所采用的濃度不同有關。復方丹參膠囊主要由丹參、三七、冰片經提取精制而成，其中丹參的主要活性成分為丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ等；三七的主要活性成分為人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1等皂苷類化合物[14，24]。馬靜等[25]研究報道隱丹參酮、丹參酮ⅡA可誘導人肝HepG2細胞CYP3A4酶活性及蛋白的表達。陳艷進等[26]發(fā)現三七總皂苷等可顯著誘導CYP3A mRNA表達。因此，復方丹參膠囊誘導大鼠體內CYP3A酶可能主要與隱丹參酮、丹參酮ⅡA、三七皂苷可誘導大鼠CYP3A活性與表達有關。

表2 替格瑞洛在大鼠體內的主要藥動學參數

①與對照組比較，P<0.05。

①與對照組比較，P<0.05。

表3 兩組大鼠肝微粒體MDZ的消除率

綜上所述，本研究證實了連續(xù)灌胃給予大鼠復方丹參膠囊可顯著降低其體內替格瑞洛的暴露量，其作用機制可能與誘導CYP3A2活性及蛋白表達有關。故在臨床合用時應關注此問題，及時監(jiān)測替格瑞洛的血藥濃度以達到最佳治療效果。此外，筆者將進一步選用健康志愿進行臨床試驗來驗證復方丹參膠囊與替格瑞洛藥動學/藥效學的相互作用，以期為替格瑞洛的臨床合理應用奠定理論和實驗基礎。