李美娣，趙锃玨，劉漢清，傅嘉莉，張玲華*，武 力*

(1.廣東華農(nóng)高科生物藥業(yè)有限公司，廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白質(zhì)功能與調(diào)控重點實驗室，廣州 510642；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

富含半胱氨酸的腸蛋白(cysteine-rich intestinal protein，CRIP)是LIM(Lin-1、Isl1、Mec3)蛋白家族的一個亞家族，包含一個保守的LIM結(jié)構(gòu)域以及一個富含半胱氨酸和組氨酸的基序[1]。迄今為止，CRIP2的研究主要集中在腫瘤和細(xì)胞凋亡方面[2-4]。CRIP2是CRIP家族的成員，與其他成員序列具有一定的相似性，CRIP2基因已在許多哺乳動物中被克隆，但在豬中尚缺少相關(guān)研究。與其他成員相比，它缺乏DNA結(jié)合能力，但在蛋白質(zhì)的每個末端包含兩個LIM結(jié)構(gòu)域[5]。在組織表達(dá)分布上也與其他成員相似，廣泛分布于心、卵巢、腦、骨骼肌、脾、前列腺、小腸、胰腺、睪丸和神經(jīng)元神經(jīng)節(jié)[5]。研究指出，CRIP2與腸道免疫系統(tǒng)重要調(diào)節(jié)劑NF-κB緊密相關(guān)，并在腫瘤發(fā)展中起著抑制劑的作用[6-7]，但CRIP2在免疫系統(tǒng)中的作用到目前為止尚無相關(guān)報道。

由于豬胃腸炎臨床表現(xiàn)和致病易感性與人相似，豬模型被廣泛應(yīng)用于人類胃腸道的臨床相關(guān)模型[8]。腸道炎癥的暴發(fā)與病原菌刺激產(chǎn)生的有害信號通路和胃腸上皮的破壞有關(guān)[9]，腸道感染主要病原菌包括銅綠假單胞菌[10]、腸致病大腸桿菌[11]、腸毒性大腸桿菌[12]、金黃色葡萄球菌[13]、腸沙門菌[14]、衣原體[15]和糞腸球菌[16]。

盡管許多哺乳動物的CRIP2序列已被克隆，其在豬中的基因序列至今仍未被報道，poCRIP2在免疫系統(tǒng)特別是腸道黏膜免疫方面的功能尚不明確。本研究利用廣泛用于腸道感染機制研究的IPEC-J2細(xì)胞系探究poCRIP2在豬胃腸道炎癥中的作用[17]，識別poCRIP2基因的全長序列，并在此基礎(chǔ)上研究poCRIP2的有關(guān)特征，同時，對其組織表達(dá)模式進行分析，并建立有效的poCRIP2三維結(jié)構(gòu)模型來解釋其功能，以了解poCRIP2在細(xì)菌感染過程中的免疫作用及其與NF-κB通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RNAiso plus購于TaKaRa公司；ReverTra Ace?qPCR RT Kit(Toyobo，Japan)；pMDTM18-T載體克隆試劑盒(TaKaRa,大連,中國)；IPEC-J2，大腸桿菌MG1655、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌196(ETEC196)、金黃色葡萄球菌29213(S.aureus29213)和銅綠假單胞菌PAO1(P.aeruginosaPAO1)，本實驗室鑒定保存。

1.2 樣品采集

對3頭4日齡長白豬仔豬進行屠宰取樣，將心、腦、肝、脾、肺、腎、氣管、小腸、胃、背最長肌、腦、附睪共12個組織樣品快速液氮冷凍提取RNA。按照華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物倫理委員會(IAEC)批準(zhǔn)的方案(SCAU-AEC-2010-0416)，在受控環(huán)境中飼養(yǎng)仔豬。所有研究均經(jīng)廣東省科技廳批準(zhǔn)。

1.3 總RNA提取與cDNA合成

根據(jù)RNAiso plus說明書，用TRIzol法提取總RNA(Li and Trick，2005)，測量OD260 nm和OD280 nm吸光度，確定提取RNA的濃度和純度。使用ReverTra Ace?qPCR RT Kit(Toyobo，Japan)制備豬組織的cDNA第一鏈：將總RNA在65 ℃下預(yù)熱5 min，然后在冰上加入2 μL 5×RT緩沖液、0.5 μL RT酶混合液、0.5 μL Primer混合液和無核酸酶水，總體積為10 μL。反應(yīng)體系在37 ℃下孵育30 min，在98 ℃下加熱5 min，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 poCRIP2基因的RT-PCR擴增

本研究采用電子克隆方法獲得poCRIP2的全長序列。首先，在GenBank中搜索豬表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)序列數(shù)據(jù)庫，得到3個與人或家鼠CRIP2基因高度同源的EST片段(GenBank注冊號：DT324610.1、BP144826.1和CN156214.1)。然后在CExpress程序中，將所有EST序列拼接，得到推定的全長poCRIP2。然后利用Primer Premier6軟件設(shè)計了一對引物，用于克隆poCRIP2的全長序列。利用引物進行RT-PCR克隆，從豬心cDNA文庫中分離出poCRIP2全長序列。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法采用KOD FX DNA聚合酶(TOYOBO, Osaka, Japan)。反應(yīng)體系包含：2.5 μL cDNA、10 μL 2x PCR緩沖液的KOD FX、0.4 mmol·L-1dNTP、0.3 μmol·L-1的各引物和0.5 U KOD FX。PCR程序如下：94 ℃下初始變性2 min，隨后98 ℃下10 s、65 ℃下30 s、68 ℃下1 min 20 s進行40個循環(huán)，最后68 ℃下延伸10 min。隨后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用TaqDNA聚合酶為PCR產(chǎn)物添加dATP尾，將DNA片段克隆到pMD-18T載體上，由Invitrogen公司測序。

1.5 poCRIP2組織表達(dá)分析

本研究檢測CRIP2基因在豬體內(nèi)的組織分布，利用Primer Premier5.0和NCBI Primer BLAST程序設(shè)計了特異性引物對，參考現(xiàn)有計算方法[18]，采用管家基因β-肌動蛋白(β-actin)對結(jié)果進行歸一化處理，其引物見表1。用商業(yè)試劑盒(Toyobo，Japan)進行基因表達(dá)分析，其程序為為：95 ℃初始變性3 min，95 ℃變性、退火、延伸45個循環(huán)15 s，60 ℃ 延伸1 min，在Bio-Rad CFX96系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)中進行反應(yīng)，poCRIP2在不同組織中的表示為2-ΔΔCt。將poCRIP2的Ct值歸一化為β-肌動蛋白(β-actin)，得到ΔCt值，并將肝的ΔCt設(shè)為對照組。所有試驗均設(shè)置了3個重復(fù)。

表1 本研究中使用到的引物

1.6 生物信息學(xué)分析與系統(tǒng)樹構(gòu)建

采用表2所列的各種生物信息學(xué)方法對poCRIP2的特性進行分析。用于多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的poCRIP2蛋白如表3所示。

表2 生物信息學(xué)分析軟件

表3 本研究使用的其他物種的CRIP2氨基酸序列

1.7 poCRIP2的結(jié)構(gòu)建模

利用ROBETTA服務(wù)器(Protein Homology/Analogy Recognition Engine)(http://www.robetta.org)，以與推導(dǎo)poCRIP2序列高度同源的小鼠LIM-homeodomain protein islet 1(Isl1)(PDB：4 JCJ)為模板，進行poCRIP2的三維結(jié)構(gòu)模擬。用PROCHECK(http://services.mbi.ucla.edu/PROCHECK/)和ProSA(https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php)對模型進行了分析。應(yīng)用Procheck對蛋白質(zhì)折疊進行立體化學(xué)和拓?fù)浞治?，并?yīng)用ProSA對蛋白質(zhì)折疊進行評價。并使用PyMOL程序(www.pymol.org)對建模結(jié)果進行評估，該程序也同時用于分析poCRIP2的保守結(jié)構(gòu)域。

1.8 微生物與IPEC-J2培養(yǎng)

用多種細(xì)菌(表4)體外感染IPEC-J2，包括大腸桿菌MG1655、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌196(ETEC196)、金黃色葡萄球菌29213(S.aureus29213)和銅綠假單胞菌PAO1(P.aeruginosaPAO1)，以上主要生長在Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中，而糞腸球菌FA2-2(E.faecalisFA2-2)主要生長在AC培養(yǎng)基中。感染前，所有細(xì)菌使用新鮮磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH7.4)沖洗3次以去除培養(yǎng)基，并在DMEM/F12中調(diào)節(jié)密度至1×108CFU·mL-1。

表4 本試驗使用到的菌株

本實驗室培養(yǎng)的IPEC-J2細(xì)胞為豬腸道上皮細(xì)胞系，對其進行感染實驗，細(xì)胞生長在Dulbecco’s MEM營養(yǎng)液混合液F12(DMEM-F12)(1∶1)和10%(v/v)FCS中，37 ℃，5% CO2條件下進行培養(yǎng)。在感染前，先用0.25%胰蛋白酶-EDTA的胰蛋白酶消化重懸所有細(xì)胞，然后接種到 24孔板，每孔2×105個細(xì)胞，無抗生素。

1.9 IPEC-J2感染

在感染試驗中，使用各類菌株或新鮮PBS(對照)按固定的感染倍數(shù)(MOI，multiplicity of infection，細(xì)菌與細(xì)胞的比例)處理24孔板培養(yǎng)的IPEC-J2。所有用于感染試驗的菌株在攻毒時均設(shè)定為20 MOI。24孔板中的IPEC-J2均用相同體積的細(xì)菌或PBS處理6 h。最后，按前述方法提取各組總RNA。用公式2-ΔΔCt測定目的基因(poCRIP2、NF-κB、IL-6)和β-肌動蛋白(β-actin)的表達(dá)，ΔCt代表試驗組與PBS組的差異。每個試驗均包含3個重復(fù)組。

1.10 統(tǒng)計分析

RT-qPCR的所有數(shù)據(jù)均展示為3個獨立試驗的平均值，并使用Origin 8軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。通過單向方差分析(ANOVA)或t檢驗確定試驗組與對照組之間的差異。當(dāng)P<0.05時，差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性；此外，P<0.01則被認(rèn)為具有高度顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 poCRIP2基因的克隆與特征分析

為了獲得poCRIP2基因全長cDNA序列，利用人(NM_001270837.1)、家鼠(NM_024223.2)和挪威大鼠(NM_022501.1)等其他物種的cDNA序列對NCBI網(wǎng)站EST數(shù)據(jù)庫進行了匹配。獲得了3個豬 EST序列(DT324610.1、BP144826.1和CN156214.1)。根據(jù)EST序列，克隆了poCRIP2的全長DNA片段，并進行了1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)。利用KOD FX DNA聚合酶和商用試劑盒將該DNA片段與pMD-18T載體連接。然后對重組質(zhì)粒pMD-18T-CRIP2進行測序，得到了 poCRIP2的cDNA序列，長度為1 118 bp，已提交至GenBank，注冊號為KU933587。通過ORF Finder軟件分析，poCRIP2的開放閱讀框長627 bp，A+T=36.20%，C+G=63.80%。翻譯起始位點(ATG)位于36 bp處，TAG停止密碼子位于639 bp處。

1.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；2.poCRIP2基因擴增產(chǎn)物

通過Bio Edit軟件預(yù)測poCRIP2的蛋白序列，可見與其他物種的CRIP2蛋白具有相同的長度，均為208個氨基酸。預(yù)測結(jié)果顯示(圖2)，poCRIP2由31個強堿性(+)氨基酸、20個強酸性(-)氨基酸、47個疏水氨基酸和53個極性氨基酸組成。利用ProtParam服務(wù)器對poCRIP2的等電點和分子量進行了計算，計算結(jié)果分別為9.02和22 629.88 u。由Lasergene 9.0軟件分析得，在pH為7.0時，poCRIP2的電荷量為11.986。ProtParam software服務(wù)器預(yù)測結(jié)果顯示，以水為參比，poCRIP2在280 nm處的消光系數(shù)約為25 285 M-1·cm-1。在消除所有Cys殘基后，消光系數(shù)約減少到24 105 M-1·cm-1。根據(jù)Prot Param服務(wù)器提供的結(jié)果，可以預(yù)測poCRIP2為穩(wěn)定蛋白，脂肪族氨基酸指數(shù)為47.36，親水性均值(GRAVY)為-0.670，表明POCRIP2可能是一種親水蛋白。

A.poCRIP2肽鏈上的氨基酸組成和磷酸化位點。黃色字母代表強堿性(+)氨基酸，綠色字母代表強酸性(-)氨基酸，藍(lán)色字母代表疏水性氨基酸，粉色字母代表極性氨基酸，帶星號的字母代表可能的磷酸化位點。B.poCRIP2中包含的保守域。兩個保守域，LIM-TLP和LIM-CRP，在序列中用黃色標(biāo)出。而保守域中的Zn結(jié)合位點也在序列中以紅色字母標(biāo)出

2.2 poCRIP2基因的序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

利用poCRIP2的氨基酸序列與NCBI蛋白數(shù)據(jù)進行匹配，并在其他物種中找到幾個類似的序列。通過ClustalW軟件分析和DNAMAN7[21]軟件進行可視化，可見poCRIP2與人、小鼠、大鼠、牛、斑馬魚等其他物種的氨基酸序列基本一致。由圖3A可知，poCRIP2與以下物種的特征相似性較高：斑馬魚73.79%，大鼠98.08%，人94.23%，小鼠93.75%。由于poCRIP2與其它物種之間的氨基酸序列差異有限，poCRIP2在豬中也具有類似的生理生化功能。

為了弄清poCRIP2蛋白與其他物種CRIP2蛋白之間的進化關(guān)系，利用MEGA 7.0軟件，基于NJ法，以1 000個引導(dǎo)重復(fù)的方式建立系統(tǒng)發(fā)育樹。和斑馬魚相比，豬、人和小鼠隸屬于同一祖先(圖3B)。而豬和牛的CRIP2具有高度的相似性，并從一個分支上分離出來。幾乎在同一階段，人和類人猿也發(fā)生了分支并且也具有高度相似性。因此，本研究建立的進化樹可以代表真實的生物進化。

A.黑色字母代表100%的相似度，粉色字母代表75%以上的相似度，藍(lán)色字母代表50%以上的相似度，黃色字母代表33%以上的相似度；B.系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 poCRIP2的結(jié)構(gòu)與功能注釋

分別用TMHMM[22]和Signal4.0服務(wù)器[23]對poCRIP2的跨膜域和信號肽進行預(yù)測。結(jié)果表明，poCRIP2可能不含跨膜區(qū)和信號肽，提示poCRIP2可能是一種胞內(nèi)蛋白。iLoc-Animal服務(wù)器[24]的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，poCRIP2可能位于胞漿。因此，poCRIP2可能主要控制細(xì)胞漿內(nèi)的信號通路，這與Wei等[25]報道的小鼠CRIP2的結(jié)果相似。

利用NCBI網(wǎng)站上的保守域服務(wù)器對poCRIP2的保守域進行掃描，結(jié)果如圖2B所示。poCRIP2有兩個LIM鋅結(jié)合域，即LIM-TLP域和LIM-CRP域，這兩個域與鋅原子配位結(jié)合。這兩個結(jié)構(gòu)域具有高度相似的結(jié)構(gòu)，因為它們包含保守的鋅結(jié)合殘基C-X2-C-X17-H-X2-C-X2-C-X2-C-X17-C-X3-C，該結(jié)構(gòu)域同樣存在于如牛、人、大鼠、小鼠、斑馬魚等物種的CRIP2蛋白中(如圖3A)。LIM結(jié)構(gòu)域在器官或腫瘤發(fā)育中被廣泛研究的同時，其在免疫調(diào)節(jié)中的作用也逐漸受到關(guān)注。

2.4 三維結(jié)構(gòu)建模

將poCRIP2的氨基酸序列上傳到ROBETTA[26]服務(wù)器，預(yù)測其三維結(jié)構(gòu)模型。采用多個度量對模型進行分析(圖4A、B)，驗證poCRIP2模型的可靠性。Ramachandran圖(圖5A)由PROCHECK服務(wù)器繪制。結(jié)果表明,100 %的殘基位于允許的區(qū)域內(nèi)，而在較大的允許區(qū)域內(nèi)僅包含0.4 %的殘基。隨后通過ProSA-web檢查了模型結(jié)果(圖5B)，在Z-score圖中顯示了一個完美有序的結(jié)構(gòu)，Z-score為-4.37，在常見類似大小蛋白的有效范圍內(nèi)。此外，還在ProSA-web中繪制了殘基分?jǐn)?shù)圖，結(jié)果表明(圖5B)，模型中的殘基對于poCRIP2的天然結(jié)構(gòu)可能在很大程度上是陰性的，不影響 poCRIP2的活性分析。因此，本研究預(yù)測的poCRIP2三維結(jié)構(gòu)是可靠的。

poCRIP2的二級結(jié)構(gòu)(圖6)由SOPMA服務(wù)器完成[27]，結(jié)果顯示，poCRIP2包含5.77 %的α螺旋，主要位于N末端，有23.08%的延伸鏈(β折疊)，幾乎遍布所有骨架。同時還分布有12.02 % β轉(zhuǎn)角和59.13 %的無規(guī)卷曲，結(jié)果與圖4A和4B所示的三維結(jié)構(gòu)相似，紅色表示的β折疊和無規(guī)卷曲是poCRIP2的主要成分，α螺旋主要存在于N末端。利用保守結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)模型，不難發(fā)現(xiàn)β折疊是蛋白結(jié)構(gòu)的重要部分，分布在該結(jié)構(gòu)域兩側(cè)的α螺旋也可能在蛋白功能中發(fā)揮重要作用。在圖4C和4D中顯示了LIM-TLP和LIM-CRP中的鋅離子結(jié)合位點，每4個鋅離子結(jié)合位點可以捕獲1個 鋅離子，兩種結(jié)構(gòu)域分別可以得到兩個鋅離子。盡管結(jié)合位點主要位于無規(guī)卷曲中，但也需要由β折疊和α螺旋構(gòu)建的構(gòu)象。因此，poCRIP2中包含的功能性結(jié)構(gòu)域大部分通過β折疊和α-螺旋結(jié)構(gòu)實現(xiàn)。

在模型中，鋅離子用白色小球表示，鋅離子的結(jié)合位點在模型中也用黃色或綠色標(biāo)識。A.poCRIP2的骨架結(jié)構(gòu)；B.poCRIP2的表面結(jié)構(gòu)展示，藍(lán)色區(qū)域代表LIM-TLP域，紅色區(qū)域代表LIM-CRP域；C.poCRIP2蛋白中LIM-TLP保守域的三維結(jié)構(gòu)模型；D.poCRIP2蛋白中LIM-CRP保守域的三維結(jié)構(gòu)模型

A.Ramachandran圖由PROCHECK軟件繪制。在左側(cè)，它顯示了該圖的概要。在預(yù)測模型中，幾乎所有殘基都在允許的區(qū)域內(nèi)，并且該模型只有0.14%的殘基具有一般評分。B.ProSA-Web模型結(jié)果評估。在左圖中，通過ProSA-Web進行poCRIP2的Z評分，結(jié)果表明預(yù)測的模型可以識別為天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。右圖殘基得分圖也在ProSA-Web中完成，結(jié)果顯示，在模型中可以找到合適的結(jié)構(gòu)

圖6 使用SOPM服務(wù)器自優(yōu)化預(yù)測方法預(yù)測的poCRIP2的二級結(jié)構(gòu)

2.5 poCRIP2 mRNA表達(dá)的組織分布

以往對人或小鼠的研究表明，CRIP2在附睪、卵巢、腦、脾、小腸、心、睪丸等組織中表達(dá)較高。本研究以豬為研究對象，采用RT-qPCR法分析了豬CRIP2的組織分布，使用管家基因β-actin對RNA樣品進行歸一分析，以肝的Ct為對照，結(jié)果如圖7，可見poCRIP2在所有組織樣本中均有表達(dá)，其中在附睪、肝、腎、皮膚、心和氣管中有較高的表達(dá)，其在氣管中的表達(dá)水平是肝、腎、腦和附睪的10倍。但在小腸、胃、肺、肌肉和脾中表達(dá)較低。這說明，除脾外，poCRIP2的組織分布與人相似。

2.6 poCRIP2蛋白在腸道感染中的作用

本研究以IPEC-J2作為腸道免疫模型，研究poCRIP2與細(xì)菌感染的關(guān)系(圖8)。由圖7可知，poCRIP2在腸道中表達(dá)水平較低。用革蘭陰性菌(MG1655，ETEC 196和PAO1)處理時，poCRIP2表達(dá)水平是PBS對照組的1～2倍，差異顯著(P<0.05，圖8A)，結(jié)果無法揭示共生細(xì)菌和致病細(xì)菌之間的差異。當(dāng)用革蘭陽性細(xì)菌處理細(xì)胞時，與金黃色葡萄球菌29213和糞腸球菌FA 2-2共孵育的組中的表達(dá)水平與PBS對照組相比沒有顯著差異，這說明在革蘭陽性細(xì)菌組中，共生細(xì)菌或致病細(xì)菌之間也沒有差異，但表明poCRIP2可能參與了腸道中的革蘭陰性細(xì)菌感染。

圖7 poCRIP2基因的組織表達(dá)

由于NF-κB/p65亞基主要參與腸道炎癥，故本研究也對NF-κB的表達(dá)水平進行了研究。如圖8B，在革蘭陰性菌(MG1655、ETEC196和PAO1)刺激的細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)水平比對照組高約3～4倍，差異顯著(P<0.01)。使用革蘭陽性細(xì)菌糞腸桿菌FA2-2處理后，細(xì)胞NF-κB的表達(dá)水平也顯著升高。IL-6表達(dá)水平檢測結(jié)果表明，無論革蘭陰性菌還是革蘭陽性菌，用致病菌(ETEC、FA2-2和PAO1)處理的細(xì)胞中IL-6的表達(dá)水平全部一定程度地升高，進一步驗證了NF-κB通路在細(xì)菌感染過程中被激活。NF-κB結(jié)果表明，在革蘭陰性菌組中，poCRIP2表達(dá)較高，同時存在NF-κB的激活；然而對于革蘭陽性菌組，NF-κB激活的同時poCRIP2并無顯著變化。推測，poCRIP2可能與NF-κB通路無關(guān)，在腸道感染中起著新的作用。

*、**表示組間的顯著性差異，* P<0.05，** P<0.01；A.在攻毒試驗中poCRIP2的表達(dá)水平；B.在攻毒試驗中NF-κB和IL-6的表達(dá)水平

3 討 論

腸道環(huán)境中存在著數(shù)千種細(xì)菌、共生細(xì)菌或致病菌，腸道免疫功能復(fù)雜。胃腸炎是人和豬的一種常見疾病。它多數(shù)由致病菌刺激的損傷性信號通路引起。由于細(xì)菌種類的多樣性，很難找到解釋腸道感染或腸道炎癥的共同機制。由于豬模型最近被廣泛用作人類臨床相關(guān)模型，研究豬腸道的感染機制對人類具有重大參考價值。

富含半胱氨酸蛋白2(CRIP2)是LIM結(jié)構(gòu)域蛋白家族的CRIP型亞家族。幾乎所有的CRIPs蛋白在生物體的生理功能和疾病發(fā)展中都具有多種功能。但迄今為止，CRIPs家族在豬、馬、羊等家畜中仍未被克隆。養(yǎng)豬業(yè)是重要的經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)，同時，豬也是重要的人類臨床模型。因此，本研究以獲得poCRIP2的編碼序列為目的，采用電子克隆方法，得到poCRIP2的全長序列。通過結(jié)構(gòu)分析，poCRIP2編碼了208個氨基酸，同時分析了等電點、分子量、氨基酸組成、保守區(qū)和信號肽等理化性質(zhì)。poCRIP2的理化性質(zhì)與人類相似。在此基礎(chǔ)上，本試驗還研究了poCRIP2的組織分布，其在皮膚、心、肝和氣管中高度表達(dá)，而在其他組織，如肌肉、肺、小腸和脾中表達(dá)程度較低，結(jié)果與人和小鼠的趨勢相似，因此，豬的poCRIP2可以很好地代表人CRIP2的作用。

本研究首次對poCRIP2的三維結(jié)構(gòu)進行了分析。利用ROBETTA服務(wù)器，構(gòu)建了poCRIP2的三維結(jié)構(gòu)，并通過PROCHECH和Pro SA驗證了該結(jié)構(gòu)的有效性。在SOPMA服務(wù)器上，poCRIP2的三維結(jié)構(gòu)也與poCRIP2的第二級結(jié)構(gòu)接近。通過Phymol程序處理，分析了poCRIP2的保守區(qū)：LIM-TLP和LIM-CRP。LIM-TLP結(jié)構(gòu)域和LIM-CRP結(jié)構(gòu)域具有相似的氨基酸序列。令人驚訝的是，LIM-TLP結(jié)構(gòu)域和LIM-CRP結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)也非常相似，并且主要位于α-螺旋周圍。而保守域中的重要位點，即鋅離子結(jié)合位點，也建立在β折疊和α螺旋上。因此，poCRIP2中的功能結(jié)構(gòu)主要由β折疊和α-螺旋結(jié)構(gòu)實現(xiàn)。

本研究是首份關(guān)于CRIP2免疫功能的報導(dǎo)，到目前為止，關(guān)于CRIP2的研究主要針對腫瘤[28]，尚未有關(guān)于免疫的報道。已證明CRIP1在免疫中起重要作用，但該報道主要在魚類而不是哺乳動物中進行。同時，CIRP2與NF-κB密切相關(guān)[3]。因此，本研究在克隆了poCRIP2的序列后，對poCRIP2在腸道免疫中的作用進行了深入研究，使用了腸道免疫的通用模型——IPEC-J2細(xì)胞系作為研究材料[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，首先，當(dāng)IPEC-J2細(xì)胞被正常細(xì)菌(大腸桿菌MG1655)感染時，poCRIP2高度表達(dá)，但其表達(dá)水平與其他細(xì)菌組沒有顯著差異，例如金黃色葡萄球菌ATCC29213。其次，poCRIP2在IPEC-J2中能被革蘭陰性菌顯著上調(diào)，但不能被革蘭陽性菌上調(diào)，這是迄今為止的一個重要發(fā)現(xiàn)，由于poCRIP2在腸道中的表達(dá)水平很低，但能被革蘭陰性菌顯著上調(diào)，且與魚類CRIP1相似，也能被革蘭陽性菌調(diào)控，推測poCRIP2是以一種新的機制參與腸道免疫。

由于NF-κB/p65亞基主要參與炎癥反應(yīng)，通常由LPS或LTA誘導(dǎo)，因此，腸感染期間NF-κB途徑的激活也是可預(yù)期的[30]。人CRIP2是NF-κB通路的阻遏劑[5]，本研究發(fā)現(xiàn)，poCRIP2高度表達(dá)時，NF-κB通路也是在同一組中被激活(被革蘭陰性細(xì)菌攻擊)，這表明，poCRIP2通過非NF-κB依賴的其他途徑參與了腸道的免疫。

綜上所述，本研究成功獲得了豬CRIP2基因的全長序列，poCRIP2的組織表達(dá)模式表明，poCRIP2與人CRIP2相似。同時，本研究建立了可靠的三維結(jié)構(gòu)模型，并且基于該模型，推測poCRIP2中包含的功能主要由β折疊和α-螺旋結(jié)構(gòu)實現(xiàn)。本研究首次報道了CRIP2在免疫方面的功能，更為重要的是，研究發(fā)現(xiàn)革蘭陰性菌感染腸道后，poCRIP2能被顯著上調(diào)。因此，poCRIP2應(yīng)不依賴于NF-κB通路，在腸道免疫中起其他作用。到目前為止，關(guān)于CRIP在腸道免疫中的作用的信息還很少，因此，本研究不僅將揭開poCRIP2免疫調(diào)節(jié)功能的面紗，而且還將為增強人類腸道免疫健康提供新的切入點。

4 結(jié) 論

本研究識別了從豬心獲得的poCRIP2 cDNA基因的全長序列為1 118 bp，poCRIP2蛋白與人和小鼠的同源性分別為94.23%和93.75%，它還含有兩個保守區(qū)(LIM-TLP和LIM-CRP)。組織表達(dá)模式研究表明，poCRIP2與人CRIP2相似，在所有組織中均有表達(dá)，但在小腸、肺、肌肉等組織中表達(dá)較低；根據(jù)建立的三維結(jié)構(gòu)模型，推測poCRIP2中包含的功能主要由β折疊和α-螺旋結(jié)構(gòu)實現(xiàn)，且革蘭陰性菌感染腸道后poCRIP2能被顯著上調(diào)，poCRIP2應(yīng)不依賴于NF-κB通路，在腸道免疫中起其他作用。