彭瓊琳，黃 敏，孫 敏

1鄂鋼醫(yī)院，湖北 鄂州436000；2十堰市太和醫(yī)院/湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院

“當(dāng)歸芍藥散”出自漢代張仲景的《金匱要略》，由芍藥、當(dāng)歸、茯苓、川芎、澤瀉及白術(shù)六味中藥組成，為治療“婦人雜病腹中諸疾痛”及“婦人妊娠諸疾痛”等婦科疾病之良藥，可緩解痛經(jīng)癥狀［1］。已有研究表明，該方可抑制子宮平滑肌收縮、松弛子宮平滑?。?-3］。另有研究表明，該方可通過降低腦內(nèi)一氧化氮含量、改善腦缺血/再灌注小鼠血腦屏障通透性并恢復(fù)腦缺血/再灌注損傷所致小鼠脾臟萎縮、顯著改善小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，對腦缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用［4-5］。因子宮腫瘤、卵巢腫瘤、產(chǎn)科各種手術(shù)等過程中均有可能發(fā)生生殖系統(tǒng)（子宮）缺血/再灌注損傷［6-7］。故研究已有藥物或挖掘經(jīng)典驗(yàn)方的可靠成分，防治子宮缺血/再灌注損傷、確保適齡孕產(chǎn)婦生命及生殖安全，已應(yīng)成為目前婦產(chǎn)科醫(yī)師的重要工作之一。本研究以中醫(yī)學(xué)經(jīng)典方劑“當(dāng)歸芍藥散”為研究對象，重點(diǎn)觀察和分析其對子宮缺血/再灌注損傷模型小鼠子宮生理特性的影響，并分析可能機(jī)制，為臨床醫(yī)師治療該類疾病提供理論參考依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF級小鼠共60只，雌性，體質(zhì)量18.0～20.0 g，由湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物繁育中心提供，飼養(yǎng)于鄂鋼醫(yī)院科研中心標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室設(shè)施合格證：SYXK（鄂）2017-031，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證：SCXK（鄂）2017-020。按3 R原則給予實(shí)驗(yàn)動物動物福利：給予人道關(guān)懷、自由進(jìn)食和飲水、動物飼養(yǎng)間保持22～24℃、相對濕度保持65%～75%并12 h交替照明。

1.2 試劑與儀器戊巴比妥鈉（北京化學(xué)試劑公司，批號：060222）；線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性測試盒（上海哈靈生物科技有限公司，批號：HL-C-C300）；BW-MD3000型生物信號采集系統(tǒng)（上海軟隆科技發(fā)展有限公司）；iCE 3300 AAS型原子吸收光譜儀（賽默飛世爾科技）；721型分光光度計(jì)（上海奧析科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 當(dāng)歸芍藥散預(yù)處理 當(dāng)歸芍藥散由鄂鋼醫(yī)院藥房自制：取當(dāng)歸9 g、芍藥30 g、茯苓12 g、白術(shù)12 g、澤瀉15 g、川芎9 g，上六味、杵為散。然后加水500 mL，浸泡30 min后文火煮沸30 min，用濾紙過濾，加雙蒸水調(diào)至100 mL，使藥液相當(dāng)于生藥8.7%。因缺乏當(dāng)歸芍藥散對小鼠的使用劑量相關(guān)文獻(xiàn)，在開展實(shí)驗(yàn)前，經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)后參考人與動物用藥體表面積換算公式，經(jīng)計(jì)算得出小鼠的用藥劑量約為生藥8.7 mg/（kg·d）。

1.3.2 分組及給藥60只雌性小鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法均分為空白對照組，模型組，中藥高、中、低劑量組，每組12只。灌胃時抓取以上各組小鼠，按每鼠每天早晚各0.5 mL灌胃，連續(xù)灌胃7天。中藥高、中、低劑量組分別給予當(dāng)歸芍藥散17.4、8.7、4.35 mg/（kg·d）劑量的藥物灌胃，空白對照組和模型組均灌胃給予等體積生理鹽水作對照，預(yù)處理后2 h手術(shù)建立子宮缺血/再灌注損傷動物模型。

1.3.3 模型制備 除空白對照組外，其余各組小鼠用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定、手術(shù)區(qū)域剃毛、消毒下腹部至恥骨聯(lián)合處皮膚后縱形切開皮膚和腹白線，打開腹腔暴露小鼠膀胱，子宮在膀胱下，呈粉紅色Y型結(jié)構(gòu)。抽取500 U的肝素鈉注射液，從大隱靜脈注射0.1 mL，分離小鼠腹腔動脈和髂總動脈并在兩者交叉處以上0.5 cm處用無創(chuàng)微動脈夾夾閉腹主動脈，阻斷子宮血供30 min，然后松開無創(chuàng)微動脈夾恢復(fù)血液供應(yīng)，再灌注60 min，關(guān)閉腹腔即可成模［8］。再灌注2 h游離左右兩側(cè)子宮角，在陰道與子宮匯合處剪斷（注意不要摘取陰道部分），然后將左右2條子宮置于4℃的95%O2和5%CO2飽和樂氏液中備用。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 采用紫外分光光度法檢測復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ 取右側(cè)10 mg子宮組織，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，步驟如下：加入1 mL試劑一、10 μL試劑三，研磨后制成組織勻漿液、加入離心管，將離心力調(diào)到3000 r/min，離心5 min。取上清50 μL，分別加入200 μL試劑二及2 μL試劑三后超生波破碎，編號保存待測。將721紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，波長設(shè)定340 nm，蒸餾水調(diào)零。37℃孵育5 min，然后取40 μL加入比色皿比色，根據(jù)吸光值A(chǔ)1和A2計(jì)算樣本吸光度值（ΔA），線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ計(jì)算公式：ΔA=A1-A2［9］。Ca2+濃度采用原子吸收光譜法，檢測時取10 mg子宮組織，火焰法燒灼，研碎，加10 mL雙蒸水混勻，用iCE 3300 AAS原子吸收光譜儀檢測Ca2+濃度。

1.4.2 子宮生理特性指標(biāo) 取左側(cè)子宮，用眼科剪將兩端修剪45°角以利于灌流時藥物成分進(jìn)行子宮管腔內(nèi)，平滑肌條長度以3 cm為宜，兩端用絲線捆好并分別與傳感器和灌流槽通氣鉤固定，然后置于95%O2和5%CO2的飽和樂氏液的灌流槽中，灌流槽溫度調(diào)到32℃，傳感器與BW-MD3000生物信號采集系統(tǒng)相連，通氣鉤通95%O2和5%CO2混合氣體并調(diào)整到5個氣泡/min，給子宮平滑肌條加1 g前負(fù)荷平衡30 min后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時用加樣器準(zhǔn)確吸取0.2 U的縮宮素100 μL，加入灌流槽內(nèi)使子宮平滑肌條出現(xiàn)節(jié)律性舒縮，記錄子宮平滑肌條收縮力和收縮頻率，其中張力變化取每次收縮所達(dá)到的峰值，以（g）表示，收縮頻率取子宮平滑肌每分鐘收縮的次數(shù)，以（次/min）表示，根據(jù)收縮力和收縮頻率計(jì)算子宮活動力［收縮力×收縮頻率（g·次/min）］［10］。子宮活動力為子宮生理特性的重要觀察指標(biāo)，其數(shù)值越大，對藥物如縮宮素、崔產(chǎn)素或體內(nèi)激素越敏感，說明子宮的生理功能越活躍。

1.4.3 氧化應(yīng)激指標(biāo) 取小鼠離體子宮平滑肌條10 mg，研磨后制成組織勻漿液，4℃、離心半徑10 cm，4000 r/min，離心15 min，取上清液嚴(yán)格按試劑盒說明書，采用可見分光光度法在520 nm處檢測乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）。采用黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），采用硫代巴比妥酸法檢測丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)或LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體指標(biāo)模型組和中藥低劑量組離體子宮平滑肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均明顯升高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。中藥中、高劑量組線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ變化呈劑量依賴性，其含量明顯降低，與模型組和中藥低劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且中藥中、高劑量組組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體指標(biāo)比較（±s） nmol/L

表1 各組線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體指標(biāo)比較（±s） nmol/L

注：a表示與空白對照組比較，P＜0.05；b表示與模型組比較，P＜0.05；c表示與中藥低劑量組比較，P＜0.05；d表示與中藥中劑量組比較，P＜0.05

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2.2 子宮平滑肌生理特性指標(biāo)模型組和中藥低劑量組收縮力、收縮頻率、Ca2+濃度及子宮活動力均升高（P＜0.05），與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。中藥中、高劑量組收縮力、收縮頻率、Ca2+濃度及子宮活動力均低于模型組和中藥低劑量組（P＜0.05），中藥高劑量組變化較中劑量組更明顯，變化呈劑量依賴性，且兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組子宮平滑肌生理特性指標(biāo)比較（±s）

表2 各組子宮平滑肌生理特性指標(biāo)比較（±s）

注：a表示與空白對照組比較，P＜0.05；b表示與模型組比較，P＜0.05；c表示與中藥低劑量組比較，P＜0.05；d表示與中藥中劑量組比較，P＜0.05

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2.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)模型組和中藥低劑量組SOD水平明顯降低，MDA、LDH則明顯升高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。中藥中、高劑量組SOD水平明顯升高，MDA、LDH則明顯降低，SOD、MDA和LDH均接近空白對照組水平，且與模型組和中藥低劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SOD、MDA、LDH變化呈劑量依賴性，中藥中、高劑量組組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較（±s）

表3 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較（±s）

注：a表示與空白對照組比較，P＜0.05；b表示與模型組比較，P＜0.05；c表示與中藥低劑量組比較，P＜0.05；d表示與中藥中劑量組比較，P＜0.05

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3 討論

當(dāng)歸芍藥散為《金匱要略》記載的著名方劑，該方偏重于婦科止痛。適用于婦人腹痛，對辨證屬陰證、虛、寒、瘀血的原發(fā)性痛經(jīng)、絕經(jīng)期前婦女的鎮(zhèn)痛作用明顯，并可明顯緩解子宮痙攣性疼痛［11］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸芍藥散對經(jīng)麥角新堿、縮宮素、乙酰膽堿或普萘洛爾等灌流離體子宮平滑肌條均具有濃度依賴性緩解痙攣的作用［12］。在對圍絕經(jīng)期模型大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)其具有增加子宮腺體數(shù)量的作用，這一作用可調(diào)節(jié)子宮腔上皮及基質(zhì)中ERβ表達(dá)水平，為治療圍絕經(jīng)期綜合征提供了理論依據(jù)［13］。還可用于治療慢性盆腔炎、羊水過多等［14-15］、子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢巧克力囊腫［16］、子宮肌瘤等［17］。

應(yīng)激反應(yīng)是機(jī)體應(yīng)對強(qiáng)烈有害刺激引起的一種非特異性緊張狀態(tài)，是機(jī)體逃避有害刺激的正常反應(yīng)。而缺血/再灌注后也會產(chǎn)生類似的反應(yīng)——氧化應(yīng)激反應(yīng)，但這種反應(yīng)屬病理性反應(yīng)，會造成組織器官損傷。研究表明，缺血本身不是缺血/再灌注損傷的主因，而是組織器官在恢復(fù)血液供應(yīng)后，缺血/再灌注組織產(chǎn)生過量的自由基攻擊重新獲得血液供應(yīng)的細(xì)胞而發(fā)生的病理損傷過程，故這一現(xiàn)象又名組織缺血/再灌注損傷。目前在子宮腫瘤、有創(chuàng)檢查、正常分娩、子宮破裂、胎盤早期剝離、引產(chǎn)、流產(chǎn)和剖宮產(chǎn)等的臨床研究中，發(fā)現(xiàn)有部分患者會出現(xiàn)生殖系統(tǒng)缺血/再灌注損傷，并因此造成嚴(yán)重的子宮損傷性后遺癥，嚴(yán)重影響患者生命及生殖健康［18］。因此，防治子宮缺血/再灌注損傷的重點(diǎn)應(yīng)為及時恢復(fù)組織血流、減輕血液復(fù)流后氧化應(yīng)激反應(yīng)這一重要環(huán)節(jié)，而如何干預(yù)這一環(huán)節(jié)也是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究用當(dāng)歸芍藥散干預(yù)性治療，發(fā)現(xiàn)與模型組比較，當(dāng)歸芍藥散預(yù)處理的中、高劑量組離體子宮收縮力、頻率、子宮活動力均明顯降低，并恢復(fù)到空白對照組水平，反映缺血/再灌注后氧化應(yīng)激反應(yīng)的LDH、MDA明顯降低，SOD則明顯升高，說明線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及與細(xì)胞收縮相關(guān)的重要離子Ca2+濃度均明顯降低并恢復(fù)到空白對照組水平，且這種效應(yīng)存在劑量依賴性，高劑量組以上作用較中劑量組更加明顯。這一作用說明當(dāng)歸芍藥散預(yù)處理對子宮缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用。本研究證實(shí)，當(dāng)歸芍藥散預(yù)處理可抑制線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的活性，這有利于將細(xì)胞代謝維持在一個較低的水平，降低子宮術(shù)后缺血/再灌注后子宮的進(jìn)一步損傷。子宮的興奮性有賴于細(xì)胞內(nèi)外Ca2+和K+水平的平衡，當(dāng)Ca2+通道開放后，K+外流、Ca2+內(nèi)流，子宮平滑肌興奮性增強(qiáng)、收縮力增強(qiáng)。缺血/再灌注損傷的離子基礎(chǔ)為Ca2+通道開放過多，Ca2+內(nèi)流過多導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外Ca2+和K+水平失衡。當(dāng)歸芍藥散可能作用于這一環(huán)節(jié)來抑制Ca2+通道，使K+外流和Ca2+內(nèi)流減少，子宮平滑肌興奮性降低。故實(shí)驗(yàn)中觀察到離體子宮收縮力、頻率、子宮活動力均明顯降低并恢復(fù)到空白對照組水平，這有利于減輕缺血/再灌注后產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)，其直接結(jié)果是引起LDH、MDA明顯降低、SOD則明顯升高。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，歸芍藥散可能通過抑制線粒體呼吸鏈酶這一細(xì)胞能量代謝途徑，阻礙Ca2+內(nèi)流而降低離體子宮平滑肌對縮宮素的敏感性，這會使子宮活動力降低，在一定程度上促進(jìn)了缺血/再灌注子宮生理功能的恢復(fù)。