馮云子，黃梓堃，趙謀明

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640）

醬油是東南亞國家常見的大宗發(fā)酵調(diào)味品，因其特殊的風(fēng)味逐漸受到世界人民的喜愛。其以大豆或豆粕等植物蛋白、面粉或小麥粉等淀粉質(zhì)為原料，經(jīng)微生物接種發(fā)酵而制得的一種具有特殊色、香、味的液態(tài)調(diào) 味品[1]。醬油中含有豐富的初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物，與醬油的風(fēng)味形成和生理功能密切相關(guān)。初級代謝產(chǎn)物包括還原糖、氨基酸、脂肪酸、碳水化合物、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)等[1]，而次級代謝產(chǎn)物則有生物堿、黃酮類、皂苷、酚酸、苯丙素、硫代葡萄糖苷、多胺等[2]。

代謝組學(xué)是研究樣品中所有的低分子質(zhì)量代謝產(chǎn)物的一種技術(shù)，該研究方法比單一指標(biāo)的分析方法更加系統(tǒng)，目前廣泛應(yīng)用于藥物學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、微生物等領(lǐng)域[3]。 近年來，代謝組學(xué)技術(shù)在傳統(tǒng)發(fā)酵食品的研究領(lǐng)域應(yīng)用越來越多，有助于解析發(fā)酵過程復(fù)雜的生物化學(xué)變化，揭示發(fā)酵機(jī)理[4]，涉及的檢測手段主要包括核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術(shù)、離子遷移光譜（ion mobility spectroscopy，IMS）、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)、液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）聯(lián)用等。Wu Xiaohe等[5]采用1H-NMR技術(shù)對清香型、濃香型和醬香型的白酒大曲進(jìn)行非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析，分別鑒定出蘋果酸、甘露醇、異亮氨酸等代表各自類型大曲的生物標(biāo)志物；袁志鷹等[6]采用GC-IMS技術(shù)對發(fā)酵前后百合發(fā)酵乳的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)分析，找出15 種具有明顯差異的揮發(fā)性成分；Feng Yunzi等[7]采用頂空固相微萃取和氣相色譜-嗅覺測定技術(shù)檢測出醬油中2-甲基丁醛、3-甲硫基-丙醛等25 種 揮發(fā)性化合物；Lee等[8]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和LC-MS聯(lián)用技術(shù)對豆醬制作工藝進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)曲霉菌、芽孢桿菌、四聯(lián)球菌和結(jié)合酵母分別與糖、脂肪酸和氨基酸代謝有關(guān)。

超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）與高分辨度四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（quadrupole-time-of-flight-mass spectrometry，Q-TOFMS）技術(shù)聯(lián)用，近年來在代謝組學(xué)研究中的使用頻率越來越高，相對于普通LC-MS技術(shù)具有更高的分辨度和靈敏度，對樣品分析效率和準(zhǔn)確性大大提高[9]。如Cheng Lizeng等[10]采用UPLC-Q-TOF-MS對青磚茶發(fā)酵前后的代謝圖譜進(jìn)行分析，共檢測出102 種關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，證明了微生物發(fā)酵是改變生茶葉滋味的關(guān)鍵過程。Lee等[11]采用GC-TOF-MS和UPLC-Q-TOF-MS系統(tǒng)分析了豆醬整體發(fā)酵過程的代謝途徑及其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析，將豆醬的發(fā)酵過程分為5 個(gè)階段。然而，目前鮮有采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對醬油發(fā)酵過程中代謝物質(zhì)變化進(jìn)行研究的相關(guān)報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)對高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程進(jìn)行對比分析，基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法回歸分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）等多元數(shù)據(jù)分析方法研究醬油發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物，明確醬油發(fā)酵階段間具有顯著性差異的物質(zhì)，并確定其在醬油發(fā)酵過程中的變化趨勢，旨在為改進(jìn)醬油發(fā)酵工藝提供理論基礎(chǔ)及支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝制作，分別于醬醪發(fā)酵第1、5、15、30、60、90天取樣，樣品貯存于密封的醬油瓶中，并貯藏于－20 ℃冰柜待用。

乙醚（分析純，純度≥99.5%） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、甲酸、乙腈（均為色譜純） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EL204/EL3002電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；Sorvall ST 16R臺式離心機(jī) 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海 亞榮生化儀器廠；SHZ-D循環(huán)水式真空泵 鞏義予華儀器有限公司；MTN-2800W氮吹濃縮裝置 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；ACQUITY UPLC高效液相色譜儀、CORTECS UPLC C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm） 沃特世科技（上海）有限公司；MicrOTOF-Q II高分辨串聯(lián)質(zhì)譜儀 布魯克（北京）科技有限公司；Milli-Q超純水機(jī) 美國密理博公司；WH-3微型旋渦混合儀 上海瀘西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 醬油樣品前處理

參考李會(huì)品[12]研究，并基于前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)論優(yōu)化得到如下方法：取20 mL醬油于50 mL離心管中，加入15 mL乙醚后渦旋振蕩3 min，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，用膠頭滴管移取有機(jī)相于另一離心管中。再加入15 mL乙醚于原離心管，重復(fù)上述操作，合并有機(jī)相。40 ℃水浴下，氮吹至干，用1 mL 80%甲醇溶液復(fù)溶，過0.22 μm濾膜備用。

1.3.2 色譜條件

參考Seo[13]和Chang Tesheng[14]等的方法并進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)。色譜柱采用CORTECS UPLC C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm），采用0.1%甲酸（A）和乙腈（B）作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為 0.2 mL/min。梯度洗脫程序?yàn)椋?～1 min，85% A、15% B；1～12 min，85%～20% A、15%～80% B；12～22 min，20%～0% A、80%～100% B；22～26 min，0% A、100% B；26～28 min，0%～85% A、100%～15% B；28～30 min，85% A、15% B。柱溫35 ℃，進(jìn)樣量2 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜掃描模式為正離子模式，掃描范圍m/z50～2 000，電子電離源能量10.0 eV，毛細(xì)管電壓3.5 kV，離子源加熱溫度200 ℃，干燥氣體流量 4.0 L/min，霧化器壓力0.5 bar。

1.4 數(shù)據(jù)分析

流動(dòng)相條件設(shè)定及控制采用Hyphenation Star（version 3.2，Bruker Daltoik GmbH，德國）軟件控制，質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息用高分辨度飛行時(shí)間質(zhì)譜軟件Otofcontrol（version 4.0，Bruker Impact II，德國）采集，基峰圖、總離子流圖和紫外信息采用Bruker Compass Data Analysis軟件（version 4.4，Bruker Daltoik GmbH，德國）進(jìn)行分析。質(zhì)譜信息定性參考數(shù)據(jù)庫包括人類代謝組數(shù)據(jù)庫HMDB 4.0（http://www.hmdb.ca）、METLIN數(shù)據(jù)庫（http://metlin.scripps.edu）和MassBank數(shù)據(jù)庫（http://www.massbank.jp）。數(shù)據(jù)分析采用Microsoft Excel 2019（微軟公司，美國）。柱狀圖繪制采用OriginPro（version 2018C，OriginLab公司，美國），多元數(shù)據(jù)分析采用SIMCA（version 14.1，MKS Umetrics，瑞典）完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬油發(fā)酵過程樣品提取液的UPLC-Q-TOF-MS進(jìn)樣情況

采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，在高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中檢出的所有代謝物質(zhì)的數(shù)量及總峰面積如表1所示。醬油1 d中檢出156 種物質(zhì)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，醬油中的物質(zhì)種類及總峰面積不斷增加，第1個(gè)月增長較快，后期變化減緩；到發(fā)酵終點(diǎn)（90 d）檢出物質(zhì)共228 種，總峰面積達(dá)到2.8×108，物質(zhì)種類及總峰面積分別為第1天樣品的1.47 倍和6.57 倍。

表1 醬油發(fā)酵過程中各樣品提取液代謝物檢出數(shù)量和總峰面積Table 1 Number and total peak area of metabolites detected in soy sauce samples during the fermentation process

圖1統(tǒng)計(jì)了醬油發(fā)酵過程中所有樣品提取液里被檢出的物質(zhì)種類及數(shù)量，共鑒定化合物155 種，種類最豐富的是氨基酸衍生物、脂肪酸和有機(jī)酸，分別為31、28 種和21 種。此外，還共檢出13 種酯類、9 種酰胺類、8 種醇類、7 種氨基酸、7 種多肽、5 種異黃酮、3 種大豆甾醇、2 種生物堿等。

圖1 醬油發(fā)酵過程樣品提取液被檢出的代謝產(chǎn)物種類Fig. 1 Change in composition of metabolites detected in soy sauce samples during the fermentation process

2.2 醬油發(fā)酵過程中樣品提取液的差異代謝物質(zhì)

基于各樣品提取液中所有代謝物的聚類分析結(jié)果（表1），發(fā)酵過程中的樣品可分為兩組，第1、5、15天的醬油樣品為組I（發(fā)酵初期），發(fā)酵30、60、90 d的醬油樣品為組II（發(fā)酵后期），采用OPLS-DA對兩組樣品進(jìn)行差異分析，認(rèn)為變量投影重要性（variable importance projection，VIP）值大于1即為顯著差異代謝物。由表2可知，發(fā)酵階段間呈現(xiàn)顯著性差異的代謝物質(zhì)共39 種，其中已知化合物34 種。可根據(jù)結(jié)構(gòu)分為7 大類，即氨基酸衍生物類（10 種）、脂肪酸類（9 種）、異黃酮類（5 種）、酯類（3 種）、有機(jī)酸類（2 種）、生物堿（2 種）和其他類（3 種）化合物，大部分代謝物含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸增加。

表2 醬油發(fā)酵過程樣品提取液間的差異代謝物質(zhì)（VIP＞1）Table 2 Differential metabolites (VIP > 1) among soy sauce samples during the fermentation process

差異代謝物質(zhì)的總峰面積和大類總峰面積變化趨勢如圖2所示。除有機(jī)酸外，各類物質(zhì)的峰面積在發(fā)酵過程中上升。生物堿、氨基酸衍生物的峰面積在30 d后上升明顯，異黃酮、脂肪酸和酯類的峰面積呈波動(dòng)上升。有機(jī)酸類的峰面積在1～5 d變化較大（5.26 倍），并于第30天達(dá)到峰值，之后稍有下降。李彥[15]對發(fā)酵過程中的總酸含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)其在1～20 d間含量迅速增加，之后趨于平穩(wěn)，其變化趨勢與本模型相似。整體而言，差異代謝物的總峰面積變化與所有化合物總峰面積變化趨勢基本一致，變化較大的階段為1～5 d（3.10 倍）和30～60 d（1.56 倍）。除此之外，發(fā)酵第1天的樣品中氨基酸衍生物、異黃酮和生物堿的峰面積占總峰面積的0.44%、6.82%和0.02%，到第90天，其分別升至20.11%、14.88%和10.81%，是醬油中的關(guān)鍵差異代謝產(chǎn)物。

圖2 各類差異代謝物在醬油發(fā)酵過程中的總峰面積變化Fig. 2 Changes in total peak area of each class of metabolites during soy sauce fermentation

由圖3A所示，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為70.2%和16.2%，表明模型具有較好的代表性。得分圖（圖3A）中，各樣品點(diǎn)分散情況較好，說明不同發(fā)酵時(shí)間的醬油物質(zhì)種類和含量均有差異。而載荷圖（圖3B）反映了醬油中的差異代謝物對PCA樣本分類的貢獻(xiàn)程度。整體上看，可以將醬油階段分成發(fā)酵前期和發(fā)酵后期，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵過程具有從PC1負(fù)半軸往PC1正半軸演變的趨勢。針對各樣品，醬油1 d在第3象限，在對應(yīng)的載荷圖中沒有點(diǎn)落于此，說明醬油1 d各類差異物質(zhì)含量較低。醬油5 d、15 d在第2象限，載荷圖中第2象限有6 個(gè)物質(zhì)，主要包括4 種脂肪酸（9-氧代十八烷酸、(11E)-十八碳烯酸、15-羥基亞油酸、12-羥基油酸）、 8-羅勒烯醇乙酸酯和阿魏酸。這些物質(zhì)在發(fā)酵過程中的變化趨勢是先增后減，其峰面積于第5天或第15天達(dá)到峰值（表2）。醬油30 d、60 d和90 d均在1、4象限的分界線兩側(cè)，載荷圖中則顯示共有33 種物質(zhì)都落于PC1正半軸上。說明隨著發(fā)酵的進(jìn)行，醬油發(fā)酵過程樣品提取液間差異代謝物質(zhì)主要集中于發(fā)酵后期（30 d之后）。

圖3 醬油發(fā)酵過程樣品提取液的差異代謝物質(zhì)的PCA 得分圖（A）和載荷圖（B）Fig. 3 PCA score plot (A) and loading plot (B) of differential metabolites in soy sauce samples during the fermentation process

對于位于PC1正半軸的物質(zhì)，5 種異黃酮落在 第1象限，即大豆素、黃豆黃素、染料木素、羥基大豆素、羥基染料木素。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，異黃酮峰面積不斷增加，在第90天達(dá)到峰值（圖2）。異黃酮是具有高生物活性的一類物質(zhì)，其具有抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等功能[16-17]，是醬油中常見的次級代謝產(chǎn)物。Chang Tesheng等[14]曾在醬油中鑒定出上述異黃酮，并證明了大豆素和染料木素分別是羥基大豆素和羥基染料木素的前體物質(zhì)。另外，脫落酸和3,4-二甲基癸二酸也落在第1象限，其峰面積在前30 d的增長較快，之后趨于穩(wěn)定，在第90天達(dá)到峰值（表2）。

第1、4象限分界線中的物質(zhì)點(diǎn)十分密集，包括9 種氨基酸衍生物。它們的峰面積在發(fā)酵過程中不斷增加，在1～5 d和15～30 d變化較大（5.13 倍和10.62 倍），并第90天達(dá)到峰值（圖2）。其中N-乳酰異亮氨酸、N-乳酰亮氨酸、N-乳酰苯丙氨酸的VIP值為差異代謝物前3，分別為5.66、4.22和3.71，表明其增長最為明顯。含有乳?；陌被嵫苌镌谂翣栺R干酪（用脫脂乳制成的意大利干酪）和日式醬油中均有被發(fā)現(xiàn)[18-19]，其中乳酰谷氨酸已經(jīng)被證實(shí)對奶酪的鮮味具有貢獻(xiàn)[19-20]。乳酰氨基酸的生成與乳酰轉(zhuǎn)換酶有關(guān)，推測其含量與乳酸菌的作用可能相關(guān)[20]，且乳酰氨基酸的生成可能對醬油發(fā)酵后期濃厚味的不斷增強(qiáng)具有一定貢獻(xiàn)。此外，還包括系列乙?；被岷铜h(huán)狀二肽，如N-乙酰異亮氨酸、N-乙酰亮氨酸、環(huán)-(L-脯氨酸-D-苯丙氨酸)和環(huán)-(L-脯氨酸-L-亮氨酸)。有研究表明在大豆種子和日式醬油中曾檢測到乙酰基谷氨酸[19,21]。對于環(huán)狀二肽，有文獻(xiàn)曾在煙曲霉培養(yǎng)液和鏈球菌培養(yǎng)液中鑒定出環(huán)-(脯氨酸-亮氨酸)和環(huán)-(脯氨酸-苯丙氨酸)[22]，李會(huì)品[12]以XOD抑制活性為導(dǎo)向，在乙酸乙酯提取得到的醬油有機(jī)相中分離得到了另一種二肽，即環(huán)-(L-脯氨酸-L-丙氨酸)，是醬油中的活性物質(zhì)。但有研究表明，含L-脯氨酸的環(huán)肽是N端含有L-脯氨酸-L-X序列的肽在酶的作用下形成的，這些含L-脯氨酸的環(huán)肽可能主要呈苦味[23]。

酒渣堿及脫羥甲基酒渣堿也落于PC1正半軸周圍。其峰面積在發(fā)酵前中期較低，從15 d開始變化差異顯著（5.41～7.04 倍），第90天達(dá)到峰值（圖2）。酒渣堿已被證實(shí)是醬油中的活性物質(zhì)，其對于醬油的抗氧化活性具有卓越的貢獻(xiàn)[12]，并能抑制黃嘌呤氧化酶活性，能降低高尿酸血癥小鼠的血清尿酸水平[24]。脫羥甲基酒渣堿也屬于駱駝蓬生物堿的一種，在水果和黑醋栗中曾被檢出[25]。此外，4 種脂肪酸在第4象限（(10E,12Z)-9-氧代-10,12-十八碳二烯酸、(9Z,11E)-13-氧代-9,11-十八碳二烯酸，9,12,15-亞麻酸、(9Z)-十八碳烯酸）。其中(9Z)-十八碳烯酸與(11E)-十八碳烯酸互為順反異構(gòu)體。

其他類物質(zhì)中，如色胺、萘胺等也落于第4象限。于金芝等[26]研究有發(fā)現(xiàn)在高鹽稀態(tài)醬油生產(chǎn)過程中，色胺含量隨發(fā)酵的進(jìn)行先升后降，在第60天達(dá)到最大，其變化趨勢與本研究結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

醬油發(fā)酵過程中的樣品共被鑒定出155 種代謝物質(zhì)，其總峰面積在發(fā)酵1～5 d和30～60 d變化幅度較大，并于發(fā)酵末期（60～90 d）達(dá)到峰值。通過多元數(shù)據(jù)分析鑒定出34 種已知差異代謝產(chǎn)物（VIP＞1）。氨基酸衍生物、異黃酮及生物堿等物質(zhì)在醬油發(fā)酵過程中峰面積變化較大，均隨發(fā)酵過程的進(jìn)行而升高，并于發(fā)酵第90天達(dá)到峰值，分別占總峰面積的20.11%、14.88%和10.81%。而脂肪酸和酯類分別從18.16%和17.72%下降至15.17%和6.13%。另外，VIP值前3的物質(zhì)分別為N-乳酰異亮氨酸、N-乳酰亮氨酸、N-乳酰苯丙氨酸，這些代謝物均為含乳?；陌被嵫苌?。差異代謝物質(zhì)的明確為醬油產(chǎn)品的調(diào)控及開發(fā)提供了重要理論基礎(chǔ)和方向，具有顯著差異的代謝物質(zhì)對風(fēng)味及活性貢獻(xiàn)值得進(jìn)一步的研究探討。