徐森磊,顧任鈞,楊雪瑩,卞向宇,徐忻,夏雪峰,孫珂,吳嘉宏,劉雨晨,盧圣鋒,3,張宏如,4,顧一煌

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院·養(yǎng)生康復(fù)學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/江蘇省第二中醫(yī)院,江蘇 南京 210027;3.南京中醫(yī)藥大學(xué)針?biāo)幗Y(jié)合教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023;4.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,江蘇 南京 210023)

心肌梗死(Myocardial infarction,MI)被定義為心肌組織的突然缺血性死亡,是世界范圍內(nèi)死亡和致殘的主要原因[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國心血管疾病流行趨勢顯著,發(fā)病人數(shù)增加,患病率及死亡率仍處于上升階段,嚴(yán)重危害人民健康[2]。遠(yuǎn)端缺血處理(Remote ischemic conditioning,RIC)是使用血壓袖帶反復(fù)充氣/放氣來對(duì)不同的遠(yuǎn)端組織(如上肢)進(jìn)行短暫、可逆的缺血缺氧刺激。多項(xiàng)研究表明RIC能夠觸發(fā)系統(tǒng)性反應(yīng),產(chǎn)生心肌保護(hù)效應(yīng)[3-4]。RIC的機(jī)制研究是當(dāng)前熱點(diǎn),多關(guān)注于血管閉塞復(fù)流引起的周圍感覺神經(jīng)活化和心肌保護(hù)因子釋放,然而多項(xiàng)研究表明一過性缺血并不是觸發(fā)心肌保護(hù)效應(yīng)的必要條件[3]。事實(shí)上,RIC是一種結(jié)合了血管阻斷和組織按壓的復(fù)合刺激[5]?？紤]到不同的遠(yuǎn)端刺激(機(jī)械、化學(xué)及電刺激)均可有效保護(hù)心臟[6],有理由將RIC中的組織按壓與血管阻斷因素相分離,單獨(dú)研究該種機(jī)械刺激對(duì)心臟的遠(yuǎn)端保護(hù)效應(yīng)。

臟腑經(jīng)絡(luò)學(xué)說經(jīng)過長期的臨床實(shí)踐和理論演繹,將人體各部分聯(lián)系起來,形成一個(gè)整體,即“內(nèi)屬臟腑,外絡(luò)肢節(jié)”[7]。具體而言,屬心包經(jīng)絡(luò)穴的內(nèi)關(guān),主治心、心包絡(luò)等疾病,常用于治療心血管疾病,素有“心胸內(nèi)關(guān)謀”之說。課題組前期研究也表明電針內(nèi)關(guān)穴3 d可有效緩解心肌缺血損傷[8]。從中醫(yī)角度來看,多種刺激產(chǎn)生的遠(yuǎn)端心肌保護(hù)效應(yīng)可歸因于臟腑經(jīng)絡(luò)學(xué)說?？紤]到RIC多作用于上臂等遠(yuǎn)端組織[6],本實(shí)驗(yàn)結(jié)合經(jīng)絡(luò)學(xué)說在心肌缺血后使用循環(huán)機(jī)械按壓內(nèi)關(guān)穴,探討機(jī)械刺激的心肌保護(hù)效應(yīng)及其相關(guān)機(jī)制,以完善RIC的機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

成年雄性SPF級(jí)SD大鼠18只,體質(zhì)量260～280 g,由浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(浙)2019-0001。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,自由飲食,晝夜節(jié)律12 h/12 h,環(huán)境溫度(25±2)℃,相對(duì)濕度(50±5)%。采用隨機(jī)數(shù)表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組和機(jī)械刺激組(Mechanical stimuli),每組6只。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處理遵守中華人民共和國科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定，通過南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理號(hào):202005A030。

1.2 主要儀器和試劑

小動(dòng)物呼吸機(jī)(深圳瑞沃德生命科技有限公司),Powerlab電生理記錄儀(澳大利亞AD Instruments公司),BX51T-PHD-J11顯微鏡(日本Olympus公司),RM2016病理切片機(jī)(德國Leica公司),臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),DSHZ-300型恒溫水浴箱(江蘇太倉醫(yī)用儀器廠),MIR-153型干燥箱(日本Sanyo公司),酶標(biāo)儀(美國Biotek公司),可調(diào)壓力機(jī)械按壓儀器(自制)。異氟烷麻醉劑(深圳市瑞沃德生命科技有限公司),IL-1β、IL-6和TNF-α抗體(美國Affinity公司，貨號(hào)：AF5103，DF6087，AF7014),β-actin(美國Sigma公司，貨號(hào)：ABT264),大鼠腺苷ELISA試劑盒(南京金益柏生物科技有限公司，貨號(hào)：JEB-17692),腺苷脫氨酶(ADA)一抗(英國Abcam公司，貨號(hào)：ab175310),兔二抗(北京中杉金橋生物科技有限公司，貨號(hào)：sp-9001),DAB顯色劑(北京中杉金橋生物科技有限公司，貨號(hào)：ZLI-9032)。

1.3 造模方法

模型組和機(jī)械刺激組采用冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)結(jié)扎術(shù)構(gòu)建大鼠心肌缺血模型:術(shù)前大鼠禁食12 h,飲水自由。5%異氟烷+純氧誘導(dǎo)麻醉后,以2%濃度維持,將大鼠仰臥固定在(37±3)℃的實(shí)驗(yàn)板上,插入氣管后連接動(dòng)物呼吸機(jī)(頻率50～60次·min-1,潮氣量2.0 mL)。接Powerlab電生理記錄儀,標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)檢測心電圖。剔除胸前及腋下毛發(fā)并用碘伏消毒,從第4～5肋間打開胸腔,充分暴露心臟,并于左心耳下撕開心包,迅速擠出心臟。持針器持取無菌6-0帶線縫合針于左心耳下緣2 mm處進(jìn)針,縫線穿過LAD并完全阻斷其血流。結(jié)扎線以下心肌缺血發(fā)紺,心電圖ST斷弓背上抬,T波高聳表明缺血形成。結(jié)扎完成后,6-0縫線縫合胸腔開口,抽出空氣,再由內(nèi)向外逐層縫合肌肉和皮膚。術(shù)后觀察大鼠狀態(tài),待蘇醒將其從呼吸機(jī)上取下氣管插管,正常飼養(yǎng)。假手術(shù)組僅從LAD下方穿線但不結(jié)扎,關(guān)閉胸腔。

1.4 干預(yù)方式

機(jī)械刺激組在LAD結(jié)扎術(shù)后第2天開始對(duì)大鼠進(jìn)行3 d的循環(huán)機(jī)械按壓干預(yù)。操作:1%～2%異氟烷維持麻醉,內(nèi)關(guān)穴定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9],采用自制儀器按壓內(nèi)關(guān),按壓面為直徑3 mm圓形硅膠頭,力度為150g,按壓方式為按壓5 min,放松5 min,3次循環(huán)為1組,每天干預(yù)1次,連續(xù)3 d。假手術(shù)組和模型組只接受相同時(shí)間和方式的抓取、固定和麻醉,不接受機(jī)械按壓。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 心臟TTC染色及心肌梗死面積測定 機(jī)械刺激3 d后,實(shí)驗(yàn)大鼠開胸迅速摘取心臟,并用PBS沖洗干凈殘血,-80 ℃冰凍30 min,自心尖向LAD結(jié)扎方向沿心臟橫切面將心臟切為1 mm薄片,置于10 mL的1%三苯基氯化四氮唑(TTC)PBS溶液中,37 ℃孵育10 min,然后將心臟切片置于多聚甲醛中固定,過夜后拍照。在心臟切片上白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū),紅色區(qū)域?yàn)榻】祬^(qū),使用Image J圖像分析軟件測定各區(qū)域面積,以計(jì)算心肌梗死區(qū)占心臟切片總橫截面的百分比。

1.5.2 超聲心動(dòng)圖檢測左室射血分?jǐn)?shù) 造模6 h及循環(huán)機(jī)械刺激3 d后分別使用ESAOTE多普勒超聲儀對(duì)各組大鼠作經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢查。2%異氟烷維持麻醉,剃毛刀和脫毛膏去除大鼠胸前毛發(fā)。取胸骨長軸切面,應(yīng)用M型記錄左心室運(yùn)動(dòng)情況,測量左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)和左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD),計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.5.3 Western blot法檢測大鼠心肌中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá) 機(jī)械刺激3 d后,取左心室結(jié)扎線以下缺血心肌組織,提取總蛋白,每孔蛋白上樣量為40 μg,經(jīng)SDS-PAGE、電泳分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印記、化學(xué)發(fā)光試劑顯色,于凝膠成像系統(tǒng)中對(duì)條帶進(jìn)行成像與分析。

1.5.4 ELISA法檢測大鼠血清腺苷濃度 機(jī)械刺激3 d后,經(jīng)大鼠腹主動(dòng)脈取血,離心后取上層血清,ELISA法檢測血清中的腺苷濃度。

1.5.5 免疫組化(IHC)SP法檢測穴區(qū)ADA表達(dá)情況 機(jī)械刺激3 d后,剪下大鼠內(nèi)關(guān)穴區(qū)皮膚,用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗后置于多聚甲醛溶液中固定。石蠟切片脫蠟入水,修復(fù)并消除內(nèi)源性過氧化物酶,PBS沖洗后,加入一抗,4 ℃過夜,PBS沖洗表面雜質(zhì)和一抗;加入生物素化二抗,37 ℃孵育20 min,PBS清洗;滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,37 ℃孵育20 min,PBS清洗;DAB顯色、復(fù)染并封片,在顯微鏡下觀察。采用免疫組化評(píng)分(HIS)[10]以分析免疫組化結(jié)果,對(duì)陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí):0(陰性)、1(弱陽性)、2(陽性)、3(強(qiáng)陽性),陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行評(píng)分:1～4分為0～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%;分?jǐn)?shù)相乘,再進(jìn)行比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 心肌缺血大鼠造模前后心電圖改變

結(jié)扎大鼠LAD段后同步檢測大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖,可見心電圖ST段弓背上抬,T波高聳,此為心肌缺血形成標(biāo)志,表明造模成功。見圖1。

圖1 造模前后大鼠心電圖Ⅱ?qū)?lián)比較

2.2 各組大鼠心肌梗死面積比較

機(jī)械刺激3 d后,假手術(shù)組無心機(jī)梗死;與假手術(shù)組相比,模型組心肌梗死面積顯著增大(P<0.000 1);與模型組相比,機(jī)械刺激組梗死面積顯著減少(P<0.001)。見圖2。

2.3 各組大鼠LVEF比較

造模6 h后,各組間LVEF比較沒有差異(P>0.05)。機(jī)械刺激后3 d,模型組大鼠心臟LVEF值為(46.67±4.23)%,顯著低于假手術(shù)組(89.00±5.62)%(P<0.000 1);機(jī)械刺激組大鼠心臟LVEF值為(68.17±5.78)%,顯著高于模型組(P<0.000 1)。見圖3。

注:與模型組比較,圖2 各組大鼠心肌梗死面積百分比的比較

2.4 各組大鼠心肌中炎癥因子的表達(dá)水平比較

機(jī)械刺激后3 d,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠心肌中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)明顯增高(P<0.000 1);與模型組相比,機(jī)械刺激顯著降低了大鼠心肌中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)(P<0.000 1)。見圖4。

2.5 各組大鼠血清中腺苷的表達(dá)水平比較

機(jī)械刺激后3 d,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠血清中的腺苷表達(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與模型組相比,機(jī)械刺激組大鼠血清中腺苷表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)。見圖5。

2.6 各組大鼠內(nèi)關(guān)穴區(qū)皮膚中ADA的表達(dá)水平比較

造模后3 d,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠內(nèi)關(guān)穴皮膚中ADA的表達(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與模型組相比,機(jī)械刺激組大鼠內(nèi)關(guān)穴皮膚中ADA的表達(dá)顯著降低(P<0.01)。見圖6。

3 討論

RIC起源自一項(xiàng)數(shù)學(xué)模型,最初僅限于冠狀動(dòng)脈血管床局部的缺血預(yù)處理,推測其能釋放某種保護(hù)因子[11],可被用來緩解心肌缺血再灌注損傷,除此之外還適用于心源性休克和嚴(yán)重的心律失常[3]。后來逐漸發(fā)現(xiàn),不論是空間上的心肌近端和遠(yuǎn)端組織缺血處理,抑或是時(shí)間上的缺血預(yù)處理和后處理,均具有心肌保護(hù)效應(yīng)[3]。數(shù)十個(gè)實(shí)驗(yàn)室均重復(fù)了RIC的心肌保護(hù)功能,發(fā)現(xiàn)其能改善MI后的心臟重構(gòu)和血管新生[12];并且多項(xiàng)臨床試驗(yàn)揭示了RIC可減少M(fèi)I面積的大小,并改善臨床結(jié)局[13]。

注:與模型組比較,圖3 各組大鼠超聲心動(dòng)圖及射血分?jǐn)?shù)比較

如前所述,RIC是由短暫的缺血刺激所引起的;然而一些體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明,短暫性缺血或血流中斷并不是遠(yuǎn)端心肌保護(hù)效應(yīng)的必要觸發(fā)條件[3]。深入分析RIC其實(shí)是一種結(jié)合了血管阻斷和組織按壓的復(fù)合刺激[5];考慮到多種替代因素(電、化學(xué)及機(jī)械刺激[14-16]等)均能觸發(fā)心肌保護(hù)效應(yīng),我們將機(jī)械按壓與血管阻斷因素分離,單獨(dú)研究其在遠(yuǎn)端心肌保護(hù)效應(yīng)中的作用。同時(shí),RIC常通過血管袖帶處理上肢產(chǎn)生遠(yuǎn)端心肌保護(hù)效應(yīng)[6],從中醫(yī)角度來看可納入“內(nèi)屬臟腑,外絡(luò)肢節(jié)”的經(jīng)穴臟腑相關(guān)學(xué)說。具體而言,內(nèi)關(guān)位于上肢,屬手厥陰心包經(jīng)絡(luò)穴,與陰維脈相通,主治心血管疾患,素有“心胸內(nèi)關(guān)謀”之說[7]。課題組前期研究也表明電針內(nèi)關(guān)穴3 d可有效緩解心肌缺血損傷[8]。因此,本研究通過循環(huán)機(jī)械按壓內(nèi)關(guān)穴來處理心肌缺血大鼠,結(jié)果表明該介入手段顯著降低了急性心肌缺血大鼠的心臟梗死面積。本實(shí)驗(yàn)還通過超聲心動(dòng)圖測算EF來評(píng)價(jià)心功能:心肌收縮力越強(qiáng),每搏輸出量越多,EF值也越大。經(jīng)過3 d循環(huán)機(jī)械按壓內(nèi)關(guān),顯著改善了LVEF值,表明該介入手段具有穩(wěn)定的抗心肌缺血損傷的功能。

注:與模型組比較,圖5 各組大鼠血清中腺苷的表達(dá)水平比較

注:與模型組比較,圖6 各組大鼠內(nèi)關(guān)穴區(qū)皮膚中ADA 表達(dá)水平比較

相關(guān)研究表明腺苷是RIC中重要的觸發(fā)因素,也是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的體液因子,其釋放能夠產(chǎn)生心肌保護(hù)作用[5,17]。具體來看,本研究發(fā)現(xiàn)電、化學(xué)和機(jī)械等刺激的共同特點(diǎn)是均活化了周圍感覺神經(jīng);而以一定劑量的腺苷可直接活化局部感覺神經(jīng),減少嚙齒類動(dòng)物的MI面積[18]。更直接的證據(jù)指出,MI面積的減少與動(dòng)脈血漿以及脊柱組織中的腺苷含量有關(guān)[19-20],而使用腺苷受體阻滯劑可以廢除該保護(hù)效應(yīng),提示腺苷能促進(jìn)RIC心肌保護(hù)效應(yīng)的體液轉(zhuǎn)移[21]。此外,心肌缺血后的炎癥反應(yīng)程度與其預(yù)后密切相關(guān),相關(guān)研究表明腺苷可通過下調(diào)炎癥反應(yīng)來促進(jìn)組織的損傷修復(fù)[22]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)機(jī)械刺激組大鼠血清中腺苷的表達(dá)水平顯著增加,表明腺苷與機(jī)械刺激的心肌保護(hù)效應(yīng)密切相關(guān);同時(shí)發(fā)現(xiàn)心肌中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)顯著降低,指出腺苷的心肌保護(hù)效應(yīng)或是通過下調(diào)心肌缺血后的炎癥反應(yīng)達(dá)成的。

腺苷是三磷酸腺苷(ATP)的天然分解產(chǎn)物,廣泛存在于所有組織和體液中。Goldman等指出非對(duì)抗療法如整脊和推拿,涉及對(duì)關(guān)節(jié)和肌肉的機(jī)械操作,可能與細(xì)胞內(nèi)ATP的流出有關(guān),這足以提升細(xì)胞外的腺苷含量[23]。基礎(chǔ)情況下細(xì)胞外腺苷的濃度是恒定的,若是細(xì)胞外腺苷水平過高,其會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi),并被ADA降解為腺苷;而抑制ADA會(huì)引起腺苷釋放增加[24]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)機(jī)械刺激組顯著降低了大鼠內(nèi)關(guān)穴皮膚中ADA的表達(dá),提示ADA的表達(dá)降低或是機(jī)械刺激增加動(dòng)脈中腺苷水平的相關(guān)原因。

綜上所述,循環(huán)機(jī)械按壓內(nèi)關(guān)穴可減少心肌缺血損傷大鼠的梗死面積,改善心功能;其機(jī)制或與機(jī)械刺激抑制穴區(qū)ADA表達(dá),限制腺苷降解,提高動(dòng)脈中的腺苷濃度有關(guān)。外源性腺苷水平的增加能夠緩和促炎細(xì)胞因子的釋放和氧化介導(dǎo)的組織損傷;并且抑制ADA能夠平衡炎性反應(yīng),而非完全抑制,從而保留有穩(wěn)健的免疫反應(yīng),均有利于保護(hù)缺血損傷的心肌[25]。此外,除了腺苷等體液因素外,內(nèi)關(guān)還和心臟存在以同一神經(jīng)階段為基礎(chǔ)的“內(nèi)關(guān)-心臟聯(lián)系的短反射”,該種神經(jīng)聯(lián)系是否也與機(jī)械刺激內(nèi)關(guān)穴產(chǎn)生心肌保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制相關(guān),均需要進(jìn)一步研究。