曹躍鵬，劉東方，陶勇，武鴻彪，吳愛華

近年來，結(jié)直腸癌（CRC）的發(fā)病率與死亡率呈逐年上升趨勢，成為我國最常見的、發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一[1]。盡管手術(shù)方式和輔助治療手段不斷發(fā)展，但是其總體療效仍不盡人意，約50%的患者術(shù)后因局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而最終死亡[2]。CRC 的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，有多個(gè)基因及其相關(guān)的腫瘤信號通路分別或同時(shí)調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，目前研究較多的通路機(jī)制包括錯(cuò)配修復(fù)（MMR）蛋白功能缺失、基因突變（BRAF、KRAS、p53、PIK3CA 等）和CpG 島甲基化表型（CIMP）等[3-5]。隨著分子檢測技術(shù)尤其是二代測序（NGS）極大的拓展了對結(jié)直腸癌特征基因的認(rèn)識，臨床研究表明針對特定靶點(diǎn)的分子靶向藥物可以改善患者預(yù)后并提高其生存周期，為發(fā)展新的靶向藥物和個(gè)體化免疫治療奠定了基礎(chǔ)[5-6]。筆者通過分析128 例CRC 患者基因突變位點(diǎn)和新發(fā)位點(diǎn)突變情況，探討高頻突變基因與臨床病理特征及MMR 基因突變的相關(guān)性，旨在為臨床CRC患者個(gè)體化治療提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019 年1 月至2020 年12 月在寧波市第一醫(yī)院收治的經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的CRC患者的臨床資料，最終納入臨床資料完整、腫瘤組織標(biāo)本采用NGS 檢測18 項(xiàng)基因位點(diǎn)突變的128 例患者。128 例CRC 患者中男81例，女47 例；年齡31 ～85 歲，平均（63.6±9.9）歲。腫瘤位于右半結(jié)腸者30例，位于左半結(jié)腸者35 例，位于直腸者63 例。腫瘤直徑≥5 mm 者為53 例，＜5 mm 者為75 例。TNM 分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期9 例，Ⅲ期53 例，Ⅳ期62 例。發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者69 例，發(fā)生脈管浸潤者65 例。本研究已獲得寧波市第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 二代測序檢測及突變分析 用于檢測的組織為石蠟包埋（FFPE）或新鮮組織。FFPE 樣本組織塊先切片再提取DNA，新鮮組織樣本直接提取DNA。DNA 提取采用QIAamp DNA FFPE 試劑盒，依據(jù)試劑盒操作手冊進(jìn)行DNA提取。DNA 定量采用Qubit dsDNA HS Assay 測定各標(biāo)本DNA 濃度。高通量檢測基于Illumina Next-seq 500 檢測平臺，體細(xì)胞突變平均測序深度不小于1 000X，突變比例的檢測下限為5%。檢測的變異類型包括單核苷酸變異（SNV）、小片段插入/缺失（InDel），拷貝數(shù)變異（CNV）、基因融合（Gene Fusion），但不包括染色體數(shù)目異常以及特殊類型的突變。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)或Fisher’s 精確概率法分析基因突變狀態(tài)與臨床病理特征及MMR基因突變的關(guān)系。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基因突變NGS 檢測結(jié)果分析 本研究選擇的18 個(gè)CRC相關(guān)基因包括KRAS、NARS、BRAF、PIK3CA、APC、TP53、FBXW7、PTEN、ERBB2、EGFR、HRAS、MET、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、AKT1 和NTRK1。6 例（4.7%）患者檢測的基因均未發(fā)生突變，其余122 例（95.3%）患者檢測到至少1個(gè)基因發(fā)生突變。本研究共檢測出341次突變，APC 基因的突變率為77.3%（99/128），TP53 基因的突變率為73.4%（94/128），KRAS基因的突變率為42.2%（54/128），F(xiàn)BXW7 基因的突變率為16.4%（21/128），PIK3CA 基因的突變率為15.6%（20/128），其他12 個(gè)基因的突變率均低于10%；此外，HRAS基因未檢測到有意義的突變位點(diǎn)（圖1）。

圖1 患者基因突變NGS 檢測結(jié)果分布

2.2 分析熱點(diǎn)突變和新發(fā)突變的分布 本研究共檢測出17 個(gè)基因的224 種突變，其中包括191 種熱點(diǎn)突變（體細(xì)胞突變癌癥目錄（COSMI）數(shù)據(jù)庫已收錄）和33 種新發(fā)突變（COSMIC數(shù)據(jù)庫未收錄）（圖2）。這33 種新發(fā)突變位點(diǎn)對應(yīng)的基因共14 個(gè)，包括APC、TP53、FBXW7、PIK3CA、KRAS、PTEN、EGFR、ERBB2、MET、NRAS、PMS2、NTRK1、MSLH1 和AKT1。其中TP53基因的新發(fā)突變有6種，其次為ERBB2、MET 和PMS2 各4 種（表1）。錯(cuò)義突變?yōu)樽畛Ｒ姷耐蛔冾愋停?4/33），其次分別為移碼突變（4/33）、整碼缺失突變（3/33）、整碼插入突變（1/33）、剪接區(qū)域突變和內(nèi)含子突變（1/33）。

表1 高頻突變基因新發(fā)突變位點(diǎn)及功能預(yù)測

圖2 熱點(diǎn)突變和新發(fā)突變的分布

2.3 基因新發(fā)突變的致病性分析 筆者采用PhyloPhen2 及SIFT（sorts intolerant from tolerant）軟件來探究新發(fā)突變的致病性。SIFT 軟件預(yù)測結(jié)果顯示，在24 個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)中，有13 個(gè)位點(diǎn)顯示有害的，11 個(gè)位點(diǎn)顯示可容忍。PolyPhen2 軟件預(yù)測結(jié)果顯示，在24 個(gè)位點(diǎn)中，有9 個(gè)位點(diǎn)顯示很可能有害，有4 個(gè)位點(diǎn)顯示可能有害，有11 個(gè)位點(diǎn)顯示良性。綜合這兩個(gè)軟件的分析結(jié)果，有7 個(gè)位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果都顯示良性或者影響較小，有8 個(gè)位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果都顯示有影響或有害，有9 個(gè)位點(diǎn)至少在某一個(gè)軟件的預(yù)測結(jié)果顯示有影響或者有害。

2.4 高頻突變基因與臨床病理特征的關(guān)系 TP53 基因突變率與脈管浸潤有關(guān)（P ＜0.05）。APC 基因突變在左半結(jié)腸癌的患者中突變率較高（P ＜0.05）。KRAS基因突變率與腫瘤原發(fā)部位有關(guān)（P ＜0.05）。PIK3CA 基因在女性、腫瘤直徑≥5 mm 及未發(fā)生脈管浸潤的患者中具有較高的突變率（均P ＜0.05）。FBXW7 基因在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中突變率較高（P ＜0.05）。見表2。

表2 高頻突變基因與臨床病理特征及MMR 基因突變的相關(guān)性分析

2.5 高頻突變基因與MMR 基因突變的相關(guān)性分析 錯(cuò)配修復(fù)基因（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6）均未發(fā)生突變被歸類為MMR 未突變，至少一個(gè)錯(cuò)配修復(fù)基因發(fā)生突變被歸類為MMR 突變。在128 例CRC 患者中，MMR 基因的突變率為7.8%（10/128），其中PMS2 的突變率為3.9%（5/128），MSH2 的突變率為2.3%（3/128），MLH1 和MSH6 的突變率均為0.78%（1/128），發(fā)生突變的類型均為錯(cuò)義突變。TP53、APC、KRAS、PIK3CA、FBXW7 基因突變率與MMR基因的突變率沒有相關(guān)性（P ＞0.05）。

3 討論

CRC 是最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，我國CRC 的總體發(fā)病率躍居惡性腫瘤發(fā)病率的第二位，死亡率位居第五位，均較過去明顯升高[7]。大量研究表明CRC 的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因、多步驟、多途徑的過程，與多個(gè)癌基因的激活或抑癌基因的失活有關(guān)[2]。近年來，表皮生長因子受體（EGFR）單抗在晚期CRC 的治療中取得了較好的療效[8]。KRAS、NRAS、PIK3CA 和BRAF基因是EGFR 依賴的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要基因，也是目前CRC 最常見的治療靶點(diǎn)基因[9]。當(dāng)RAS 家族或BRAF 或PIK3CA 等基因發(fā)生突變時(shí)，易導(dǎo)致EGFR單抗治療無效；因此，評估基因突變狀態(tài)有助于觀察結(jié)直腸癌的治療效果[10]。由于一代測序檢測的基因有限，以及EGFR通路存在多個(gè)下游基因，是否有其他基因?qū)χ委熜Чa(chǎn)生影響尚不清楚。曾有文獻(xiàn)報(bào)道SMAD4 和FBXW7 等基因突變、ERBB2 基因擴(kuò)增、MMR或微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）等亦對CRC的預(yù)后判斷及治療有影響[6,11]。隨著NGS 在臨床上的廣泛應(yīng)用，對于CRC 的基因及位點(diǎn)的突變的了解為臨床CRC 的靶向藥物的精準(zhǔn)化治療提供了可靠的理論基礎(chǔ)。

本研究中，納入了128 例CRC 組織樣本共檢測了CRC相關(guān)熱點(diǎn)基因18個(gè)，KRAS 基因是突變率（42.2%）最高的致癌基因，APC基因是突變率（77.3%）最高的抑癌基因，和報(bào)道數(shù)據(jù)基本相符[12]。本研究統(tǒng)計(jì)了33 種新發(fā)突變的具體情況，新發(fā)突變率最高的基因?yàn)門P53。通過生物信息學(xué)軟件分析新發(fā)突變的致病性，至少17位點(diǎn)存在重大影響或者有害，這些新發(fā)突變基因的突變、缺失或擴(kuò)增，反應(yīng)了每種突變狀態(tài)與腫瘤存在可能的致病風(fēng)險(xiǎn)，很有可能是導(dǎo)致CRC 發(fā)生的原因，也為后續(xù)研究CRC 致病機(jī)制以及探究新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

APC和TP53 是CRC中最常見的突變基因，也是重要的抑癌基因[13]。本研究發(fā)現(xiàn)TP53 基因突變率與腫瘤脈管浸潤相關(guān)，這與文獻(xiàn)[14] 報(bào)道結(jié)果一致。KRAS 和PIK3CA 是CRC 中常見的原癌基因。有研究表明單純PIK3CA 突變與患者的生存期無明顯相關(guān)性，約70%轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌PIK3CA 基因突變常合并KRAS 突變或其他突變，而KRAS 基因突變與患者性別、組織學(xué)類型，原發(fā)部位、分化程度等臨床病理特征有關(guān)[15]。本研究中20 例PIK3CA 的突變患者中，合并KRAS基因突變者13 例，因此多基因的聯(lián)合檢測對臨床治療方案至關(guān)重要。

綜上所述，本研究共完成了對128例CRC 組織的18 個(gè)基因的高通量測序分析，重點(diǎn)關(guān)注了高頻突變基因的突變分布及與臨床病理特征的相關(guān)性，為篩選最適宜靶向治療的患者個(gè)體化用藥提供了新的檢測思路及途徑。本研究對CRC 的臨床診治具有一定的指導(dǎo)意義，但仍需進(jìn)一步大樣本數(shù)據(jù)的驗(yàn)證。