鄭 舒，何 津，單延紅

(吉林大學第一醫(yī)院產(chǎn)科，吉林 長春 130021)

產(chǎn)后抑郁癥(Postpartum depression，PPD)是一種常見的婦科產(chǎn)后疾病。調(diào)查顯示，西方國家的分娩產(chǎn)婦產(chǎn)后PPD病發(fā)率在15%左右[1]。而我國產(chǎn)后患者PPD的發(fā)病率在20%左右[2]。其臨床主要以煩躁、沮喪、悲傷、易激怒以及抑郁等。大部分患者會在經(jīng)歷5個月左右的病程后恢復(fù)，也有60%左右的PPD患者恢復(fù)時間長至1年[3]。PPD不僅僅會對患者婚姻、家庭以及產(chǎn)婦身體健康產(chǎn)生影響，嚴重者還可對孩子的健康成長產(chǎn)生影響[4]。目前臨床上通常采用西醫(yī)進行治療，包含有心理療法、激素補充治療、精神藥物治療等，主要以藥物結(jié)合心理療法綜合治療[5]。但由于長期服用抗抑郁或者激素類藥物具有一定的不良反應(yīng)，而產(chǎn)婦需要撫育和哺乳嬰兒，故部分PPD患者不愿意進行西醫(yī)治療[6]。有關(guān)研究顯示，逍遙散是一種可以調(diào)冶人體情志活動的中醫(yī)經(jīng)典名方，對于產(chǎn)后抑郁具有較好的療效，但具體的臨床作用機制尚未明確[7]。故本文探討逍遙散聯(lián)合維生素D對產(chǎn)后抑郁大鼠行為學及腦組織形態(tài)學的影響，為產(chǎn)后抑郁的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性SD大鼠，體重(198.25±8.54)g，月齡2～4個月，購于南京卡文斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器：大鼠強迫游泳水缸(圓筒狀，水深35 cm、高度60 cm、直徑25 cm)；Digital Sight DS-U2圖像采集系統(tǒng)，購于日本尼康公司；倒置式生物顯微鏡(CKX41S)，購于日本奧林巴斯公司；旋轉(zhuǎn)石蠟切片機(Finesse325型)，賽默飛世爾儀器有限公司。

1.2.2 試劑：黃體酮注射液(國藥準字H33020828)；苯甲酸雌二醇注射液(國藥準字H44022008)；維生素D(國藥準字H20113033)；逍遙散處方為薄荷、炙甘草各40 g，生姜60 g， 茯苓、 白術(shù)、白芍、當歸、柴胡各100 g。7680 ml水煎煮2次，每次1 h，合并煎液，旋蒸煎液濃縮，并經(jīng)過噴霧干燥處理，得干粉171.5 g，臨床使用時將其按照1 g/ml配成干粉0.9%氯化鈉溶液。

1.3 實驗方法

1.3.1 PPD造模方法[8]：對大鼠按照1.5 ml/kg的2%戊巴比妥鈉劑量進行腹腔注射麻醉，無菌條件下，子宮結(jié)扎并將兩側(cè)的卵巢切除，為預(yù)防感染，可在窗口噴涂慶大霉素。術(shù)后2 d進行陰道涂片，觀察大鼠的動情周期改變，動情前期、中期和后期顯微鏡下可見白細胞或者角化細胞；非發(fā)情期顯微鏡下可見少量的上皮細胞。顯微鏡結(jié)果顯示白細胞或者角化細胞，表明卵巢未完全切除，去除。

1.3.2 分組及給藥方法：去除建模不合格的15只大鼠，將其隨機分為空白組、模型組、維生素D組、聯(lián)合組四組，各50只。每組選定治療后1、2、4、6周為觀察點，每個觀察點設(shè)定大鼠10只?？瞻捉M大鼠給予0.5 ml/d 的芝麻油皮下注射，連續(xù)治療16 d，之后0.1 ml/d 的芝麻油皮下注射，連續(xù)治療7 d。模型組、維生素D組以及聯(lián)合組大鼠給予4 mg注射用黃體酮和0.1 mg苯甲酸雌二醇進行治療，連續(xù)治療16 d，之后0.2 mg/d的苯甲酸雌二醇皮下注射治療，從而對懷孕狀態(tài)進行模擬。第24天，對照組和模型組分別給予相應(yīng)容量的0.9%氯化鈉灌胃處理；維生素D組給予0.2 μg/(kg·d)的維生素D灌胃給藥；聯(lián)合組在維生素D組的基礎(chǔ)上外加20 ml/(kg·d)的逍遙散湯劑灌胃給藥。四組大鼠產(chǎn)后均給藥處理30 d。

1.4 觀察指標

1.4.1 糖水消耗[9]：禁水處理24 h，之后讓各組大鼠進行1%蔗糖水自由飲用1 h，對蔗糖水消耗量進行計算。

1.4.2 曠場實驗(OFT)[10]：垂直活動得分為大鼠直立的次數(shù)，水平活動得分為動物穿越方格的數(shù)量為準。每次測定之前將敞箱內(nèi)保持整潔，5 min/次，對每只大鼠的垂直活動和水平活動得分進行記錄。

1.4.3 強迫游泳實驗(FST)[11]：每只大鼠在水溫24～25 ℃條件下進行預(yù)游泳，擦干，28 ℃ 30 min后，置于籠中。1 d后進行正式的FST試驗，記錄大鼠在5 min之內(nèi)，不動狀態(tài)的時間總和。

1.4.4 神經(jīng)遞質(zhì)水平：最后給藥結(jié)束1 d后，斷頭處理，冰浴條件下對雙側(cè)海馬進行剝離，清洗后，稱重，液氮保存。取10大鼠樣本，采用酶聯(lián)免疫吸附法對大鼠海馬組織中多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)神經(jīng)遞質(zhì)的水平，試劑盒購于上海江萊生物，操作方法嚴格按照說明書執(zhí)行。

1.4.5 腦組織病理形態(tài)觀察：每組10只大鼠，在1、2、4、6周時間點對其腦組織形態(tài)學進行觀察。大鼠斷頭處理，立即取出腦，將其置于相同灌注液的瓶中進行2周時間的固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片處理。常規(guī)HE染色后，在光學顯微鏡下對大鼠腦組織形態(tài)學進行觀察。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.00統(tǒng)計學軟件對上述資料進行整理分析，其中計量資料采用正態(tài)性檢驗，行t檢驗，多組組間比較行單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠各時點蔗糖水消耗量 空白組、維生素D組和聯(lián)合組大鼠蔗糖水消耗量呈現(xiàn)上升趨勢，模型組逐漸下降。與空白組相比，相同時間點，模型組、維生素D組和聯(lián)合組的蔗糖水消耗量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，聯(lián)合組、維生素D組第2、4、6周的蔗糖水消耗量明顯升高，且聯(lián)合組大鼠升高更為顯著(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠各時點蔗糖水消耗量(g)

2.2 各組大鼠各時點OFT水平得分 空白組、維生素D組和聯(lián)合組大鼠OFT水平得分呈現(xiàn)上升趨勢，模型組逐漸下降。與空白組相比，相同時間點，模型組、維生素D組和聯(lián)合組的OFT水平得分均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，聯(lián)合組、維生素D組第2、4、6周的OFT水平得分明顯升高，且聯(lián)合組大鼠升高更為顯著(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠各時點OFT水平得分(分)

2.3 各組大鼠各時點OFT垂直得分 空白組、維生素D組和聯(lián)合組大鼠OFT垂直得分呈現(xiàn)上升趨勢，模型組逐漸下降。與空白組相比，相同時間點，模型組、維生素D組和聯(lián)合組的OFT垂直得分均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，聯(lián)合組、維生素D組第2、4、6周的OFT垂直得分明顯升高，且聯(lián)合組大鼠升高更為顯著(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠各時點OFT垂直得分(分)

2.4 各組大鼠各時點FST 不動時間 空白組、維生素D組和聯(lián)合組大鼠FST 不動時間呈現(xiàn)下降趨勢，模型組逐漸上升。與空白組相比，相同時間點，模型組、維生素D組和聯(lián)合組的FST 不動時間均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，聯(lián)合組、維生素D組第2、4、6周的FST 不動時間明顯降低，且聯(lián)合組大鼠升高更為顯著(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠各時點FST 不動時間(s)

2.5 各組大鼠治療完成后海馬中5-HT、NE、DA含量變化 與空白組相比，模型組、維生素D組及聯(lián)合組大鼠海馬組織中5-HT、NE、DA含量均明顯較低(P<0.05)。與模型組相比，維生素D組及聯(lián)合組大鼠海馬組織中5-HT、NE、DA含量均明顯升高，且聯(lián)合組升高更為顯著(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠治療完成后海馬中5-HT、NE、DA含量變化(nmol/L)

2.6 各組大鼠腦組織形態(tài)學觀察 經(jīng)HE染色，切片觀察顯示，空白組大鼠的海馬CA2區(qū)細胞密度大，數(shù)量多，細胞層排列較為緊密整齊，核仁清晰可見，胞漿飽滿，細胞結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠在第6周時，呈現(xiàn)一定程度的損傷，細胞間隙變大，數(shù)量減少，細胞稀疏紊亂，細胞層變薄，結(jié)構(gòu)也相對不完整，且多數(shù)呈現(xiàn)一定萎縮狀態(tài)，部分細胞呈現(xiàn)空泡化，細胞核變小，或可見細胞核碎裂、腫脹、淡染，嚴重者可呈現(xiàn)嗜酸性染色。維生素D組第6周時，細胞核以及其他細胞結(jié)構(gòu)有一定改善，空泡化和核固縮現(xiàn)象減少，核仁清晰，細胞膜相對較為完整。聯(lián)合組大鼠在第6周時，細胞數(shù)量明顯增加，核固縮及細胞空泡化明顯改善，排列基本整齊，病理形態(tài)恢復(fù)狀態(tài)與空白組相似，但與正常狀態(tài)仍有一定差異(圖1)。

圖1 各組大鼠治療第6周時腦組織病理形態(tài)(HE染色，×200)

3 討 論

PPD是一種復(fù)雜情緒障礙型的抑郁癥，但由于其發(fā)病的病理復(fù)雜性和生理特殊性，致使本病的模型建設(shè)方面與傳統(tǒng)意義上的抑郁癥存在一定的差異[12]。目前，臨床上大都公認激素模擬妊娠(HSP)后激素停撤實驗是PPD模型的建立方法，國內(nèi)外研究較為廣泛。其在一定程度上滿足了動物模型的基本要求，即行為表現(xiàn)的模擬性；理論基礎(chǔ)的合理性；藥物治療的有效性；反映人體病理生理學和生物學性狀改變，與人類PPD疾病具有相似性[13-14]。本文通過PPD大鼠模型的建立，為臨床試驗提供平臺，以期對PPD發(fā)病病機病因進行探討。目前，多項臨床研究顯示，PPD患者大都存在一定程度的腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量降低的，受體敏感性降低的現(xiàn)象，遞質(zhì)系統(tǒng)失衡[15-16]。而海馬是大腦的一個重要組織系統(tǒng)，也是一個易受損且對應(yīng)激反應(yīng)較為敏感的結(jié)構(gòu)區(qū)域。海馬腦區(qū)含有豐富的神經(jīng)遞質(zhì)和各種激素，用于調(diào)節(jié)機體的行為、記憶和學習以及情緒等[17]。大鼠海馬組織內(nèi)的相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)水平與PPD的發(fā)病機制關(guān)系密切。DA是一種獨立性的神經(jīng)遞質(zhì)，也是NE的前體。DA除了可以通過神經(jīng)元對軀體運動進行調(diào)節(jié)外，還可調(diào)節(jié)推理、理解、思維、認知以及情感等精神活動，DA的失活會一定程度造成抑郁癥的發(fā)生[18]。NE和5-HT主要調(diào)節(jié)性功能、食欲、記憶、警覺、睡眠以及情感，是與人類行為關(guān)系密切的神經(jīng)遞質(zhì)[19]。文中結(jié)果顯示，逍遙散治療的聯(lián)合組大鼠海馬組織DA、NE、5-HT含量明顯升高，說明了逍遙散可以明顯改善PPD大鼠的海馬組織的神經(jīng)遞質(zhì)水平。這可能主要是由于逍遙散是一種含有茯苓、柴胡、白芍等8味中藥的復(fù)方，作用靶點較多，其中柴胡可以明顯升高肝郁證大鼠的腦內(nèi)DA和NE水平，茯苓可以誘導5-HT的合成分泌，進而對PPD大鼠的海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)水平進行調(diào)節(jié)[20]。

文中行為學研究結(jié)果說明了正常大鼠由于具有較為明顯的蔗糖水飲用快感，消耗量相對較大；FST不動時間則較短；PFT垂直和水平活動得分相對較高。而模型組大鼠蔗糖水消耗量呈現(xiàn)降低趨勢；FST不動時間明顯延長；OFT垂直和水平活動得分顯著降低。而經(jīng)過逍遙散治療的聯(lián)合組大鼠各個方面的行為學指標改善顯著，尤其是在第4周和第6周時，行為學的回復(fù)狀態(tài)更為接近大鼠的正常水平。海馬組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷時，會引起機體相關(guān)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子以及相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的變化，進而誘導抑郁癥的產(chǎn)生，與文中海馬組織DA、NE、5-HT含量變化結(jié)果相符。另外相關(guān)研究表明，PPD模型大鼠海馬組織出現(xiàn)較多的胞核脫失，神經(jīng)元細胞排列紊亂，數(shù)目明顯減少，胞核碎裂、腫脹，甚至出現(xiàn)核固縮。文中結(jié)果表明，正常大鼠海馬組織細胞核仁清晰，胞漿飽滿，細胞數(shù)量多，排列整齊且結(jié)構(gòu)完整；而模型大鼠細胞核縮小，呈現(xiàn)萎縮，有的細胞有核固縮出現(xiàn)，而經(jīng)過逍遙散治療后，尤其是在第4周和第6周時，大鼠腦組織形態(tài)學恢復(fù)較好。這可能是由于逍遙散通過改善海馬組織中相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)，對其行為學和腦組織形態(tài)學進行改善。

綜上所述，逍遙散聯(lián)合維生素D可顯著改善產(chǎn)后抑郁大鼠的各項行為學指標，提高海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)的含量，對腦組織損傷具有一定恢復(fù)效果，具有較高的臨床參考價值。