韓福新，馬善波，張 蕊

(1.西安市人民醫(yī)院·西安市第四醫(yī)院，陜西 西安 710004；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，陜西 西安 710032)

膠質(zhì)瘤是成人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其臨床特點是侵襲性生長，惡性程度高，預(yù)后差[1]。臨床常規(guī)手術(shù)治療無法徹底切除膠質(zhì)瘤組織，而殘存的腫瘤對放化療敏感性低，故膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[2-3]。因此，尋找高效、低毒的新型抗膠質(zhì)瘤藥物極為必要。研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)辨證論治在改善癌癥患者癥狀、延長患者生存期方面效果較好[4]。橙皮素(Hesperetin，HES)是來自于蕓香科柑橘類植物果實的二氫黃酮類化合物，是多種中藥如枳實、枳殼、陳皮、佛手等的活性成分，具有降血壓、降血脂、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等生物學(xué)活性，其中抗腫瘤作用最為突出，是當(dāng)前抗腫瘤藥物研究熱點之一[5]。已有研究證實，HES在肺癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞中均具有抗癌活性，其通過抗氧化、抗炎和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等途徑發(fā)揮抗癌作用[6-7]。但HES對膠質(zhì)瘤的作用效果及作用機(jī)制尚未見報道。本研究旨在探討HES在體外對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抗癌活性及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，以期為膠質(zhì)瘤的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細(xì)胞株：人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251購自上海奧陸生物科技有限公司。

1.1.2 實驗試劑：HES(成都德斯特生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(Fetal bovine serium，F(xiàn)BS)、青霉素、鏈霉素均購自杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；脂質(zhì)體Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染試劑(上海生工生物工程股份有限公司)；siRNA-CHOP及其陰性對照siRNA-NC購自上海吉凱基因科技有限公司；4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4-PBA)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；CCK-8試劑盒(美國GlpBio公司)；細(xì)胞裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Hoechst 33258染色試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自南京凱基公司；反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒(日本Ta Ka Ra公司)；ECL發(fā)光試劑(美國Bio-Rad公司)；分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose-regulated protein 78，GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)、X盒結(jié)合蛋白1(X-box blinding protein 1，XBP-1)、激活轉(zhuǎn)錄因子6(Activating transcription factor 6，ATF6)、真核起始因子2α(Eukaryotic initiationfactor 2α，eIF2α)、磷酸化eIF2α(p-eIF2α)、Caspase-3、剪切Caspase-3(Cleaved-Caspase-3)、多聚ADP核糖聚合酶(Poly ADP-ribose polymerase,PARP)、剪切PARP(Cleaved-PARP)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、兔抗人單克隆抗體、辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.1.3 實驗儀器：Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；LH-AA9626紫外分光光度計(北京連華永興科技發(fā)展有限公司)；恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Lter Epics XL流式細(xì)胞儀(美國Beckman-Coulter公司)；臺式離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；天能化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；DYY-8C電泳儀、CFX96實時熒光定量PCR儀、擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞培養(yǎng)于添加10%的FBS、100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，2 d更換1次培養(yǎng)基，選取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力：取對數(shù)生長期的U251細(xì)胞，按每孔1×104/ml濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，設(shè)置100、200、400、600、800 μmol/L不同終濃度的橙皮素組、陰性對照組和空白對照組，每組設(shè)置5個重復(fù)孔，分別在培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞2 h，采用酶標(biāo)儀測定450 nm波長下各孔的吸光度值(OD值)，計算細(xì)胞活力，實驗重復(fù)3次。細(xì)胞活力=(橙皮素組OD值-陰性對照組OD值)/(陰性對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.2.3 Hoechst 33258染色法檢測細(xì)胞凋亡：取對數(shù)生長期的U251細(xì)胞，以5×104個/孔的密度接種于6孔板中培養(yǎng)細(xì)胞制作細(xì)胞爬片，設(shè)置陰性對照組、200 μmol/L橙皮素組和400 μmol/L橙皮素組，處理24 h后，棄掉原培養(yǎng)液，加入800 μl的4%多聚甲醛固定1 h，PBS洗滌3次，5 min/次，加入600 μl的Hoechst 33258染液，放入37 ℃搖床孵育20 min，PBS洗滌2遍，取出細(xì)胞爬片，置于載玻片上，滴加抗熒光猝滅封片液進(jìn)行封片，每組隨機(jī)選取5個視野在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。細(xì)胞核致密、深染或碎裂、塊狀即為陽性細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)，細(xì)胞凋亡率=陽性細(xì)胞/總細(xì)胞×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：取對數(shù)生長期的U251細(xì)胞，按每孔1×105/ml濃度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度約80%，更換培養(yǎng)基，設(shè)置陰性對照組、200 μmol/L橙皮素組和400 μmol/L橙皮素組，每組設(shè)置3個重復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入500 μl預(yù)冷的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，每孔加入5 μl的Annexin V-FITC染液，室溫避光孵育15 min，再加入5 μl的PI染液，室溫避光孵育5 min，采用流式細(xì)胞儀檢測分析。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期的U251細(xì)胞懸液接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時，PBS洗滌細(xì)胞2次，更換無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，將稀釋好的Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑和siRNA-CHOP(或siRNA-NC)混合液加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)染48 h后檢測轉(zhuǎn)染效率，并進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.6 qRT-PCR法檢測CHOP mRNA相對表達(dá)量：取對數(shù)生長期的U251細(xì)胞，設(shè)置轉(zhuǎn)染對照組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA)、CHOP低表達(dá)組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染CHOP的特異性siRNA)、橙皮素加轉(zhuǎn)染對照組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA后采用200 μmol/L的HES處理)、橙皮素加CHOP低表達(dá)組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染CHOP的特異性siRNA后采用200 μmol/L的HES處理)、陰性對照組(常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞)、4-苯基丁酸組(5 mmol/L的4-PBA處理細(xì)胞)、橙皮素組(200 μmol/L的HES處理細(xì)胞)、橙皮素加4-苯基丁酸組(200 μmol/L 的HES和5 mmol/L的4-PBA共同處理細(xì)胞)。細(xì)胞處理24 h后，收集各組U251細(xì)胞，加入Trizol試劑，提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR實驗。引物序列：CHOP：上游序列為5’-TCTTCCTCCTCTTCCTCCTG-3’，下游序列為5’-CACTCTTGACCCTGCTTCTC-3’；Gapdh：上游序列為5’-CCACTCCTCCACCTTTG-3’，下游序列為5’-CACCACCCTGTTGCTGT-3’。qRT-PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，2×Sybgreen PCR Master Mix 10 μl，ddH2O加至20 μl。qRT-PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行40個循環(huán)。以Gapdh為內(nèi)參，根據(jù)2-△△Ct計算目的基因mRNA相對表達(dá)量。

1.2.7 Western blot檢測凋亡相關(guān)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)相關(guān)蛋白表達(dá)量：取對數(shù)生長期的U251細(xì)胞，同“1.2.6”設(shè)置分組，同時設(shè)置200 μmol/L橙皮素組和400 μmol/L橙皮素組。細(xì)胞處理24 h后，收集各組U251細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，4 ℃，12000 r/min，離心10 min，收集上清液，以BCA法進(jìn)行蛋白定量，取一定量的蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法將凝膠電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5 %脫脂牛奶的緩沖液室溫封閉1 h，TBST緩沖液洗膜，加入CHOP、GPR78、XBP-1、ATF6、eIF2α、p-eIF2α、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP、Gapdh一抗稀釋液(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗稀釋液(1∶5000)，室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗膜，用ECL試劑顯影，以Gapdh作為內(nèi)參，分析目的蛋白灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖活力的影響 CCK-8實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，經(jīng)過不同濃度HES處理24、48 h的U251細(xì)胞增殖活力受到明顯抑制，并呈劑量和時間依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表1。

表1 各組對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖活力的影響(%)

2.2 各組對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡的影響 見表2(圖1～3)。與陰性對照組比較，200 μmol/L橙皮素組和400 μmol/L橙皮素組細(xì)胞凋亡率均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與陰性對照組比較，200 μmol/L橙皮素組和400 μmol/L橙皮素組的凋亡蛋白Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP相對表達(dá)量均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且400 μmol/L橙皮素組各項蛋白相對表達(dá)量均高于200 μmol/L橙皮素組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。圖1中紅色箭頭表示凋亡細(xì)胞；圖3應(yīng)用Western blot法檢測凋亡細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況。

圖3 各組細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)量

表2 各組對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡的影響

圖1 Hoechst 33258染色檢測各組細(xì)胞凋亡(×200)

圖2 Annexin V-FITC/PI 雙染檢測各組細(xì)胞凋亡

2.3 各組對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 4-苯基丁酸組的CHOP、GPR78、XBP-1、ATF6蛋白表達(dá)量和p-eIF2α/eIF2α與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。與陰性對照組比較，橙皮素組上述ERS相關(guān)蛋白表達(dá)量均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；橙皮素加4-苯基丁酸組上述ERS相關(guān)蛋白表達(dá)量均低于橙皮素組，但高于4-苯基丁酸組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表3(圖4)。

表3 各組對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖4 各組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4 ERS參與HES誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡 4-苯基丁酸組的Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP蛋白表達(dá)量與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。橙皮素組上述凋亡蛋白表達(dá)量均高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。橙皮素加4-苯基丁酸組的上述凋亡蛋白表達(dá)量均低于橙皮素組，但高于4-苯基丁酸組(P<0.05)。見表4(圖5)。4-苯基丁酸組的Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP蛋白表達(dá)量與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。橙皮素組Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP蛋白表達(dá)量均高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。橙皮素加4-苯基丁酸組的Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP蛋白表達(dá)量均低于橙皮素組，但高于4-苯基丁酸組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

圖5 ERS參與HES誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡

表4 ERS參與HES誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡

2.5 CHOP參與ERS介導(dǎo)的HES誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡 見表5(圖6)。qRT-PCR和West ern blot實驗結(jié)果顯示，CHOP的特異性siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，CHOP低表達(dá)組CHOP蛋白和mRNA表達(dá)量均低于轉(zhuǎn)染對照組(P<0.05)。橙皮素加轉(zhuǎn)染對照組CHOP蛋白和mRNA表達(dá)量均高于轉(zhuǎn)染對照組(P<0.05)。橙皮素加轉(zhuǎn)染對照組的凋亡蛋白Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP表達(dá)量均高于轉(zhuǎn)染對照組(P<0.05)。橙皮素加 CHOP低表達(dá)組的CHOP蛋白和mRNA表達(dá)量、凋亡蛋白Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP表達(dá)量均低于橙皮素加轉(zhuǎn)染對照組，但高于CHOP低表達(dá)組(均P<0.05)。

圖6 CHOP參與ERS介導(dǎo)的HES誘導(dǎo)

表5 CHOP參與ERS介導(dǎo)的HES誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡

3 討 論

近年來，隨著中藥現(xiàn)代化的研究和發(fā)展，臨床發(fā)現(xiàn)多數(shù)中藥單體成分在惡性腫瘤的治療中表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，其中天然產(chǎn)物單體HES因具有抗炎、抗氧化和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用在癌癥治療及預(yù)防中受到廣泛關(guān)注[8-9]。Zhang等[10]研究表明，HES通過增加ROS激活線粒體途徑，抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，且其對胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用呈劑量和時間依賴性，同時，HES顯著抑制胃癌細(xì)胞異種移植瘤的生長。Wu等[11]研究證實，HES通過增加細(xì)胞內(nèi)活性氧類激活線粒體途徑誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡。Shirzad等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌PC3細(xì)胞中，HES通過刺激IL-6和pSTAT3蛋白及基因表達(dá)誘導(dǎo)G0/G1期阻滯，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。

本研究CCK-8檢測結(jié)果顯示，HES可呈劑量及時間依賴性的抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖。Hoechst 33258 染色和Annexin V-FITC/PI 雙染結(jié)果顯示，HES能夠有效提高膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡率。而在凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP的表達(dá)中，Western blot檢測結(jié)果顯示，HES能夠上調(diào)Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP蛋白的表達(dá)，并且隨著HES濃度的增加，上述凋亡蛋白的表達(dá)量呈上升趨勢，提示HES可通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡。

ERS持續(xù)發(fā)生時，會激活PERK、IRE1α、ATF6三條信號通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，上調(diào)XBP-1、ATF6、eIF2α、p-eIF2α關(guān)鍵分子蛋白的表達(dá)[13-14]。Tungkum等[15]研究表明，甲基苯丙胺(Methamphetamine，METH)介導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞ERS中，METH通過增加ATF6、GRP78、CHOP、p-eIF2α、XBP-1基因和蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)ERS相關(guān)的膠質(zhì)細(xì)胞毒性，而褪黑素能夠濃度依賴性地降低ATF6、GRP78、CHOP、p-eIF2α、XBP-1基因和蛋白的表達(dá)，從而降低METH毒性引起的ERS。異硫氰酸芐酯通過促進(jìn)GRP78、XBP-1、ATF-6β表達(dá)激活ERS，從而誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤GBM8401細(xì)胞凋亡[16]。上述研究表明，ERS相關(guān)因子GRP78、XBP-1、ATF6、eIF2α、p-eIF2α蛋白表達(dá)變化程度可反映ERS的發(fā)生情況。本研究證實4-PBA可抑制HES誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞ERS發(fā)生。此外，ERS參與了HES誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡；該結(jié)果與汪超等[17]的研究結(jié)果一致。

CHOP是ERS過程中非常關(guān)鍵的促凋亡因子，其在細(xì)胞正常狀態(tài)下表達(dá)量極低，ERS激活后則會大量表達(dá)，特異性較強(qiáng)[18-19]。王巍松[20]研究報道，ERS中CHOP通路參與了腦膠質(zhì)瘤的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果提示HES誘導(dǎo)的ERS可能通過CHOP介導(dǎo)發(fā)生，并且CHOP通路參與HES誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，HES可抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與ERS途徑中CHOP信號通路的活化相關(guān)。