○劉殿如 宮子慧

我縣臨淮鎮(zhèn)2個(gè)塘口的養(yǎng)殖戶河蟹出現(xiàn)了死亡的現(xiàn)象，病蟹主要表現(xiàn)為活力差、吃食減少甚至不吃食、肝胰腺病變、鰓發(fā)黑。筆者通過對(duì)病蟹肝胰腺進(jìn)行細(xì)菌分離、鑒定和藥物敏感試驗(yàn)等研究，以期為河蟹養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病的病原和防控提供科學(xué)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)，有效地防止藥物的濫用和誤用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

來(lái)自泗洪縣臨淮鎮(zhèn)的2個(gè)發(fā)病的養(yǎng)殖塘口，采集的病蟹用采樣箱加冰低溫運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。

腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）（英文名API 20E）、氧化酶試劑購(gòu)自梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司，動(dòng)物用藥敏分析試劑板購(gòu)自南京菲恩醫(yī)療科技有限公司，營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)自北京路橋。

1.2 方法

（1）病原菌的分離。用滅菌棉簽蘸取河蟹肝胰腺，均勻涂于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)18-24h后，觀察菌落形態(tài)，并挑取可疑單個(gè)菌落劃線接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，置于28℃恒溫培養(yǎng)18-24h。

（2）生理生化特性。采用腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）系統(tǒng)測(cè)定各分離菌株生理生化特性。具體方法為用滅菌吸管挑取單菌落至0.85%NaCl中，制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，并用吸管將菌懸液加到API 20 E試劑條的20個(gè)含干燥底物的微量小管中，使小管內(nèi)底物溶解。CIT、VP、GEL小管，菌液需充滿管部和杯部，其他管僅充滿管部，ADH、LDC、ODC、H2S、URE小杯內(nèi)加入礦物油以形成厭氧環(huán)境。蓋上培養(yǎng)盒，于36±2℃孵育18-24h，同時(shí)做氧化酶反應(yīng)構(gòu)成第21個(gè)試驗(yàn)。孵育后，根據(jù)判讀表判讀各反應(yīng)結(jié)果，參照生化譜檢索手冊(cè)，得到鑒定結(jié)果。

（3）病原菌的藥敏試驗(yàn)。挑取單菌落于5mL生理鹽水中制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海ˋ管），從中吸取0.1mL，加入到10mL無(wú)菌生理鹽水中混勻（B管）。將B管菌液倒入經(jīng)滅菌的V形槽內(nèi)制備成B液。利用微量移液器吸取B液，加入藥敏板所有的微孔中，每孔0.1mL，分別測(cè)定細(xì)菌分離株對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、紅霉素、鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸土霉素、強(qiáng)力霉素共8種常見藥物的敏感程度。蓋好試劑板，置于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24h，經(jīng)肉眼觀察證實(shí)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)試管中的最低藥物濃度，即為藥物的最小抑菌濃度（minimum in‐hibitory concentration，MIC）。

2 結(jié)果

2.1 病原菌分離及形態(tài)特征觀察

從病蟹肝胰腺分離到的細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上為光滑、濕潤(rùn)、微凸、乳白色或淡黃色菌落。

2.2 病原菌的氧化酶實(shí)驗(yàn)和生理生化鑒定

對(duì)分離得到的5株細(xì)菌進(jìn)行生理生化檢測(cè)，結(jié)果判定：分別為嗜水氣單胞菌-1(細(xì)菌編碼：7247124)、嗜水氣單胞菌-2(細(xì)菌編碼：7247165)、嗜水氣單胞菌-3(細(xì)菌編碼：7246105)、腐敗希瓦菌、解藻朊酸弧菌，具體生理生化特性見表1。

表1 鑒定試劑條檢測(cè)結(jié)果

2.3 病原菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

參照2013年抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，5株細(xì)菌對(duì)8種抗菌藥物的最小抑菌濃度如表2所示。

表2 5株細(xì)菌對(duì)8種抗菌藥物的最小抑菌濃度（MIC）對(duì)照 mg/L

3 討論與分析

從2個(gè)塘口的病蟹分離到5個(gè)細(xì)菌分離株，根據(jù)其培養(yǎng)后的菌體形態(tài)特征、生理生化特性，分別確定為致病性嗜水氣單胞菌3株、腐敗希瓦菌、解藻朊酸弧菌。通過藥敏試驗(yàn)，嗜水氣單胞菌-1、腐敗希瓦菌對(duì)紅霉素耐藥，對(duì)其余7種抗菌藥物敏感；嗜水氣單胞菌-2對(duì)硫酸新霉素、強(qiáng)力霉素敏感，對(duì)恩諾沙星、鹽酸土霉素中敏，對(duì)甲砜霉素、氟苯尼考、紅霉素、鹽酸環(huán)丙沙星耐藥；嗜水氣單胞菌-3對(duì)恩諾沙星、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸土霉素、強(qiáng)力霉素敏感，對(duì)硫酸新霉素中敏，對(duì)紅霉素耐藥；解藻朊酸弧菌對(duì)甲砜霉素耐藥，對(duì)其余7種抗菌藥物敏感。在水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥過程中，通過藥敏試驗(yàn)，選擇合理的抗菌藥物種類，對(duì)建立正確合理用藥機(jī)制具有實(shí)際意義。

（通聯(lián)：223935，江蘇省泗洪縣臨淮鎮(zhèn)政府手機(jī)：13815762979）