茍萬(wàn)曉，范延超，胡元森，任曉輝

1.義馬煤業(yè)集團(tuán)煤生化高科技工程有限公司，河南 義馬 472300;2.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

0 引言

甲醇蛋白是一類以甲醇和無(wú)機(jī)鹽為主要原料，經(jīng)液態(tài)通風(fēng)發(fā)酵生產(chǎn)的單細(xì)胞蛋白[1].甲醇蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，在食品、飼料等行業(yè)都有著廣闊的應(yīng)用前景[2-5]，聯(lián)產(chǎn)酶制劑是甲醇蛋白的重要應(yīng)用方向之一[6].將表達(dá)酶分子的目的基因通過(guò)基因工程手段構(gòu)建生產(chǎn)甲醇蛋白的工程菌，經(jīng)微生物發(fā)酵，可在生產(chǎn)甲醇蛋白的同時(shí)聯(lián)產(chǎn)木聚糖酶.從發(fā)酵液中分離酵母菌體和上清液，將酵母菌體噴霧干燥后可制得單細(xì)胞蛋白，而上清液經(jīng)一系列工藝提取后可制得酶制劑[7].

甲醇蛋白聯(lián)產(chǎn)酶制劑的生產(chǎn)工藝水平?jīng)Q定了酶制劑最終產(chǎn)品中有效成分的含量、衛(wèi)生程度、產(chǎn)品品質(zhì)及產(chǎn)品穩(wěn)定性.而發(fā)酵培養(yǎng)基的配方?jīng)Q定了生產(chǎn)工藝水平的高低，進(jìn)而影響酶制劑最終產(chǎn)品的生產(chǎn)成本、生產(chǎn)效率，以及生產(chǎn)過(guò)程中的環(huán)境保護(hù)、應(yīng)用范圍等[8].畢榮宇等[9]分別以玉米粉和豆粕為碳源和氮源生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，可有效提高單細(xì)胞蛋白的產(chǎn)量.H.L.Wang等[10]采用提高外源蛋白產(chǎn)量的連續(xù)培養(yǎng)策略，顯著提高了重組畢赤酵母生產(chǎn)堿性果膠酶的活性及細(xì)胞活力.杜少平等[11]比較了不同碳源、不同氮源對(duì)重組畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響，并在50 L發(fā)酵罐中采用間歇流加策略對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行調(diào)控，實(shí)現(xiàn)了重組畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)β-甘露聚糖酶.魏濤等[12]構(gòu)建了重組畢赤酵母工程菌，分析了金屬離子對(duì)果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT酶活性的影響.李昆太等[13]以甜高粱秸稈汁為基礎(chǔ)發(fā)酵原料，優(yōu)化生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基，相較原發(fā)酵培養(yǎng)基，熱帶假絲酵母SG-1的單細(xì)胞蛋白產(chǎn)量提高了42.8%.因此，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及配比進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)酶制劑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要的價(jià)值[14-15].在前期工作中，筆者以畢赤酵母為出發(fā)菌株對(duì)甲醇蛋白生產(chǎn)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，有效提高了甲醇蛋白的產(chǎn)量[16].基于此，本研究擬在100 L發(fā)酵罐中，對(duì)影響甲醇蛋白聯(lián)產(chǎn)木聚糖酶的培養(yǎng)基組分及其質(zhì)量濃度等因素進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基，為高效生產(chǎn)木聚糖酶及甲醇蛋白聯(lián)產(chǎn)木聚糖酶的開發(fā)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株巴斯德畢赤酵母原始菌株，保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏號(hào)CCTCC NO:MC2013519)，經(jīng)課題組誘變選育，獲得了優(yōu)良菌株畢赤酵母菌hgd-xm-301(Pichiapastorishgd-xm-301).該菌株能夠在利用常規(guī)工業(yè)甲醇生產(chǎn)甲醇蛋白的同時(shí)，高效表達(dá)木聚糖酶.該菌株于4 ℃條件下采用斜面培養(yǎng)基保存，供日常實(shí)驗(yàn)使用，于-196 ℃液氮中采用甘油管保存?zhèn)溆?

1.1.2 主要試劑酵母浸粉、蛋白胨，均為生化級(jí)，葡萄糖、H3PO4、K2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、CaSO4·2H2O、NaCl、K2SO4、MgSO4·7H2O等，均為分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)；其他常規(guī)分析純?cè)噭?，洛?yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司產(chǎn).

1.2 主要儀器與設(shè)備

DGG-101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱、HP-9052型恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)；ADVENTURER型電子天平，奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)；TDL-40B型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)；HZQ-X100型振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)；T-6型可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)，北京新世紀(jì)電子技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)；BH-2 Olympus型顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)；100 L發(fā)酵罐，上海百倫生物科技有限公司產(chǎn).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 種子培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件選擇YEPD復(fù)合培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基：酵母浸粉1 g/L，蛋白胨2 g/L、葡萄糖2 g/L，KH2PO40.4 g/L，MgSO4·7H2O 0.05 g/L，pH值為5.0.培養(yǎng)條件：在250 mL搖瓶中裝入50 mL種子培養(yǎng)基，畢赤酵母接種量為1%，于30 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)24 h[17].

1.3.2100L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件選擇畢赤酵母常用的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基BSM為100 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基，分別以H3PO4、K2HPO4、NH4Cl、CaSO4·2H2O、NaCl、K2SO4、MgSO4·7H2O的質(zhì)量濃度作為單因素，研究培養(yǎng)基不同組分對(duì)菌體濕重和木聚糖酶活力的影響，并進(jìn)行正交試驗(yàn).培養(yǎng)條件：定容60 L，畢赤酵母接種量為1%，培養(yǎng)溫度30 ℃，pH值4.5～5.0，空氣流量4～8 m3/h.

1.3.3 菌體濕重的測(cè)定以100 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行5組平行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以BSM培養(yǎng)基為對(duì)照.發(fā)酵過(guò)程中每隔8 h取樣檢測(cè)菌體濕重，當(dāng)濕重不再增長(zhǎng)或略微下降時(shí)結(jié)束發(fā)酵，并記錄最終菌體濕重.菌體濕重的測(cè)定方法為：首先將離心管干燥并稱重，取50 mL菌懸液置于該離心管內(nèi)，于4500 r/min條件下離心10 min，棄上清液，固形物(菌體)用去離子水洗滌、離心2次后，稱重[17].

1.3.4 木聚糖酶活力的測(cè)定采用GB/T 23874—2009[18]方法測(cè)定發(fā)酵液木聚糖酶活力.以100 L罐發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行5組平行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以BSM培養(yǎng)基為對(duì)照.發(fā)酵過(guò)程中每隔8 h取樣檢測(cè)木聚糖酶活力，當(dāng)酶活力不再增加或略微下降時(shí)結(jié)束發(fā)酵，并記錄最終酶活力結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1H3PO4質(zhì)量濃度不同H3PO4質(zhì)量濃度對(duì)菌體濕重和木聚糖酶活力的影響如圖1所示.由圖1可以看出，隨著H3PO4質(zhì)量濃度的增加，發(fā)酵液的最終菌體濕重和木聚糖酶活力均呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)H3PO4質(zhì)量濃度為25 g/L時(shí)，發(fā)酵液的最終菌體濕重和木聚糖酶活力均達(dá)到最大值(分別為358 g/L、33 800 U/mL)，即此時(shí)甲醇蛋白和酶制劑的綜合產(chǎn)量最大.這可能是因?yàn)殡S著培養(yǎng)基中H3PO4質(zhì)量濃度的增加，培養(yǎng)基的酸度逐漸提高，pH值逐漸降低，而培養(yǎng)基的pH值對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝有顯著的影響，適宜的pH值有利于微生物的生長(zhǎng)代謝，過(guò)低的pH值則將抑制微生物的生長(zhǎng)代謝[19].因此，培養(yǎng)基中H3PO4的最適質(zhì)量濃度為25 g/L.

圖1 不同H3PO4質(zhì)量濃度對(duì)菌體濕重 和木聚糖酶活力的影響Fig.1 Effect of different phosphoric acid concentrations on the wet cell weight and enzyme activity

圖2 不同K2HPO4質(zhì)量濃度對(duì)菌體濕重 和木聚糖酶活力的影響Fig.2 Effect of different concentrations of dipotassium hydrogen phosphate on the wet cell weight and enzyme activity

2.1.3NH4Cl質(zhì)量濃度不同NH4Cl質(zhì)量濃度對(duì)菌體濕重和木聚糖酶活力的影響如圖3所示.由圖3可以看出，隨著培養(yǎng)基中NH4Cl質(zhì)量濃度的增加，發(fā)酵液的最終菌體濕重和木聚糖酶活力均呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)NH4Cl質(zhì)量濃度為0.30 g/L時(shí)，發(fā)酵液的最終菌體濕重和木聚糖酶活力均達(dá)到最大值(分別為369 g/L、35 000 U/mL)，即此時(shí)甲醇蛋白和酶制劑的綜合產(chǎn)量最大.這可能是因?yàn)镹H4Cl作為無(wú)機(jī)氮源能夠?yàn)楫叧嘟湍傅纳L(zhǎng)提供氮元素.然而，氮源不足或者過(guò)量均不利于微生物的正常生長(zhǎng)和代謝，因此還需優(yōu)化培養(yǎng)基中氮源與碳源的比例, 從而提高微生物發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量和品質(zhì)[22].因此，培養(yǎng)基中NH4Cl的最適質(zhì)量濃度為0.30 g/L.

圖3 不同NH4Cl質(zhì)量濃度對(duì)菌體濕重 和木聚糖酶活力的影響Fig.3 Effect of different ammonium chloride concentration on the wet cell weight and enzyme activity

2.1.4CaSO4·2H2O質(zhì)量濃度不同CaSO4·2H2O質(zhì)量濃度對(duì)菌體濕重和木聚糖酶活力的影響如圖4所示.由圖4可以看出，隨著CaSO4·2H2O質(zhì)量濃度的增加，發(fā)酵液的最終菌體濕重和木聚糖酶活力均呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)CaSO4·2H2O質(zhì)量濃度為0.20 g/L時(shí)，發(fā)酵液的最終菌體濕重和木聚糖酶活力均達(dá)到最大值(分別為373 g/L、35 650 U/mL)，即此時(shí)甲醇蛋白和酶制劑的綜合產(chǎn)量最大.這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中添加適量的Ca2+對(duì)培養(yǎng)基的產(chǎn)酶能力具有較大的促進(jìn)作用.研究表明[20-21]，添加一定質(zhì)量濃度的CaSO4·2H2O能夠在一定范圍內(nèi)促進(jìn)酶活力的提升;但CaSO4·2H2O質(zhì)量濃度過(guò)大會(huì)改變培養(yǎng)基的pH值，不利于畢赤酵母的生長(zhǎng)和繁殖.因此，培養(yǎng)基中CaSO4·2H2O的最適質(zhì)量濃度為0.20 g/L.

圖4 不同CaSO4·2H2O質(zhì)量濃度對(duì)菌體 濕重和木聚糖酶活力的影響Fig.4 Effect of different concentrations of calcium sulfate dihydrate on the wet cell weight and enzyme activity

2.1.5NaCl質(zhì)量濃度不同NaCl質(zhì)量濃度對(duì)菌體濕重和木聚糖酶活力的影響如圖5所示.由圖5可以看出，隨著NaCl質(zhì)量濃度的增加，發(fā)酵液的最終菌體濕重和木聚糖酶活力均呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為0.5 g/L時(shí)，發(fā)酵液的最終菌體濕重和木聚糖酶活力均達(dá)到最大值(分別為380 g/L、36 050 U/mL)，即此時(shí)甲醇蛋白和酶制劑的綜合產(chǎn)量最大.這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的Na+與維持細(xì)胞滲透壓有關(guān)，一定質(zhì)量濃度的NaCl可以改善培養(yǎng)基的滲透壓，有利于菌體的生長(zhǎng)；但當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，培養(yǎng)基滲透壓過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)外滲透壓失衡，不利于其生長(zhǎng)代謝.因此，培養(yǎng)基中NaCl的最適質(zhì)量濃度為0.5 g/L.

圖5 不同NaCl質(zhì)量濃度對(duì)菌體濕重 和木聚糖酶活力的影響Fig.5 Effect of different sodium chloride concentration on the wet cell weight and enzyme activity

2.1.6K2SO4質(zhì)量濃度不同K2SO4質(zhì)量濃度對(duì)菌體濕重和木聚糖酶活力的影響如圖6所示.由圖6可以看出，隨著K2SO4質(zhì)量濃度的增加，發(fā)酵液的最終菌體濕重和木聚糖酶活力均呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)K2SO4質(zhì)量濃度為3.0 g/L時(shí)，發(fā)酵液的最終菌體濕重和木聚糖酶活力均達(dá)到最大值(分別為383 g/L、36 900 U/mL)，即此時(shí)甲醇蛋白和酶制劑的綜合產(chǎn)量最大.這可能是由于K2SO4能夠提供豐富的K+，維持細(xì)胞滲透壓平衡，在培養(yǎng)基中添加適量K2SO4對(duì)畢赤酵母的產(chǎn)酶能力具有較大促進(jìn)作用;但當(dāng)培養(yǎng)基中K2SO4質(zhì)量濃度過(guò)大時(shí)，細(xì)胞的滲透壓增大，不利于畢赤酵母的生長(zhǎng)繁殖[20-21].因此，培養(yǎng)基中K2SO4的最適質(zhì)量濃度為3.0 g/L.

圖6 不同K2SO4質(zhì)量濃度對(duì)菌體 濕重和木聚糖酶活力的影響Fig.6 Effect of different potassium sulfate concentration on the wet cell weight and enzyme activity

2.1.7MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度不同MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度對(duì)菌體濕重和木聚糖酶活力的影響如圖7所示.由圖7可以看出，隨著MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度的增加，發(fā)酵液的最終菌體濕重和木聚糖酶活力均呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度為2.0 g/L時(shí)，發(fā)酵液的最終菌體濕重和木聚糖酶活力均達(dá)到最大值(分別為390 g/L、37 700 U/mL)，即此時(shí)甲醇蛋白和酶制劑的綜合產(chǎn)量最大.這可能是由于Mg2+對(duì)培養(yǎng)基的產(chǎn)酶能力具有一定的激活作用，添加一定質(zhì)量濃度的MgSO4·7H2O能夠在一定程度上促進(jìn)木聚糖酶活力的提升；但是，當(dāng)MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度過(guò)大時(shí)，也會(huì)改變培養(yǎng)基的pH值，不利于畢赤酵母的生長(zhǎng)繁殖[20-21].因此，培養(yǎng)基中MgSO4·7H2O的最適質(zhì)量濃度為2.0 g/L.

圖7 不同MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度對(duì)菌體 濕重和木聚糖酶活力的影響Fig.7 Effect of different concentrations of magnesium sulfate heptahydrate on the wet cell weight and enzyme activity

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)上述單因素對(duì)菌體濕重和木聚糖酶活力的影響，初步確定培養(yǎng)基配方為：H3PO4質(zhì)量濃度25 g/L、K2HPO4質(zhì)量濃度0.5 g/L、NH4Cl質(zhì)量濃度0.30 g/L、CaSO4·2H2O質(zhì)量濃度0.20 g/L、NaCl質(zhì)量濃度0.5 g/L、K2SO4質(zhì)量濃度3.0 g/L、MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度2.0 g/L.在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行七因素三水平L18(37)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2.

表1 正交試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Orthogonal test factors and levels Table g/L

由表2可知，菌體濕重和木聚糖酶活力兩個(gè)指標(biāo)的正交分析結(jié)果相同，即不同因素對(duì)兩個(gè)指標(biāo)的影響程度相同.綜合分析，7個(gè)因素中極差越大,說(shuō)明該因素對(duì)發(fā)酵水平影響越大.因此，按照各個(gè)因素對(duì)發(fā)酵水平的影響從大到小依次排序?yàn)镃>F>A>B>D>G>E，即影響最大的為NH4Cl質(zhì)量濃度，其他依次為K2SO4、H3PO4、K2HPO4、CaSO4·2H2O、MgSO4·7H2O和NaCl的質(zhì)量濃度.各個(gè)因素中k值最大的水平即為最佳水平值，因此，最優(yōu)方案為A2B2C2D3E3F2G3，即最優(yōu)培養(yǎng)基配方為H3PO4質(zhì)量濃度25 g/L、K2HPO4質(zhì)量濃度0.5 g/L、NH4Cl質(zhì)量濃度0.30 g/L、CaSO4·2H2O質(zhì)量濃度0.25 g/L、NaCl質(zhì)量濃度0.6 g/L、K2SO4質(zhì)量濃度3.0 g/L、MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度2.2 g/L.

表2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Orthogonal test plan and results

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

按最優(yōu)培養(yǎng)基配方進(jìn)行100 L發(fā)酵罐驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，通過(guò)6次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，菌體濕重和木聚糖酶活力結(jié)果見(jiàn)表3.由表3可知，在最優(yōu)培養(yǎng)基配方下，菌體濕重和木聚糖酶活力均達(dá)到較高水平，其中菌體濕重達(dá)到409～417 g/L，木聚糖酶活力達(dá)到40 915～41 428 U/mL.

表3 最優(yōu)培養(yǎng)基配方重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of repeated validation test of optimal medium formula

3 結(jié)論

本文采用100 L發(fā)酵罐，研究了甲醇蛋白聯(lián)產(chǎn)木聚糖酶培養(yǎng)基的組分及其質(zhì)量濃度對(duì)菌體濕重和木聚糖酶活力的影響，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出最優(yōu)培養(yǎng)基配方為H3PO4質(zhì)量濃度25 g/L、K2HPO4質(zhì)量濃度0.5 g/L、NH4Cl質(zhì)量濃度0.30 g/L、CaSO4·2H2O質(zhì)量濃度0.25 g/L、NaCl質(zhì)量濃度0.6 g/L、K2SO4質(zhì)量濃度3.0 g/L、MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度2.2 g/L.進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在最優(yōu)培養(yǎng)基配方下，菌體濕重達(dá)到409～417 g/L，木聚糖酶活力達(dá)到40 915～41 428 U/mL.本研究可為實(shí)驗(yàn)室誘變選育高產(chǎn)甲醇蛋白畢赤酵母菌高效表達(dá)木聚糖酶，為實(shí)現(xiàn)甲醇蛋白聯(lián)產(chǎn)木聚糖酶奠定重要基礎(chǔ).