吳娜娜，陳星宇，姚輝華，王忠福

（成都市第一人民醫(yī)院1.腫瘤二科，2.胃腸疝外科，3.介入血管外科，四川成都610041）

原發(fā)性肝癌（primary hepatocellular carcinoma,PHC）惡性程度高，發(fā)病隱匿，大部分患者確診時(shí)已處于中晚期，且有肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移，即便接受腫瘤切除術(shù)，患者術(shù)后5年生存率僅有24%～50%[1-3]。目前臨床針對(duì)PHC 高危人群的篩查主要依賴(lài)于超聲檢查及甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP），但超聲檢查很難發(fā)現(xiàn)微小病灶，且PHC 患者中AFP 輕度升高或呈陰性占比高達(dá)20%～40%，存在一定的漏診率[4-5]。因此，挖掘新的PHC 預(yù)后分子標(biāo)志物，探討新型防治靶點(diǎn)及侵襲轉(zhuǎn)移分子機(jī)制，對(duì)延長(zhǎng)患者生命具有指導(dǎo)性意見(jiàn)。PHC 的發(fā)生、發(fā)展屬于一個(gè)多步驟、多階段過(guò)程，每個(gè)階段均有著不同的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路異常、癌基因及抑癌基因失衡、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)改變等，而miRNA 可作為抑癌基因或癌基因影響細(xì)胞凋亡、增殖、遷移等腫瘤相關(guān)通路，進(jìn)而調(diào)控腫瘤諸多生物學(xué)行為[6-7]。miR-150 是定位于19q13.33的單鏈miRNA，長(zhǎng)度為2 nt，近年來(lái)不斷有研究發(fā)現(xiàn)，miR-150 在系統(tǒng)性硬化病、惡性腫瘤、組織纖維化、肺動(dòng)脈高壓等多種疾病中異常表達(dá)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者血清miR-150 水平下調(diào)，其水平與患者病理學(xué)特征密切相關(guān)，但尚不清楚miR-150與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系[9]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2018年1月在成都市第一人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的PHC 患者80 例作為PHC 組。其中，男性52 例，女性28 例；年齡45～79 歲，平均（63.02±5.11）歲；體重指數(shù)（body mass index, BMI）18.5～24.6 kg/m2，平均（21.59±2.24）kg/m2。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南（2015年版）》[10]中PHC診斷標(biāo)準(zhǔn)；②Child-Pugh分級(jí)A級(jí)、B級(jí)；③檢測(cè)前未接受放療、化療及射頻消融等治療；④首次接受腫瘤切除術(shù)，無(wú)手術(shù)禁忌證。排除標(biāo)準(zhǔn)：①活動(dòng)性肝炎；②藥物或酒精性肝損傷；③既往接受肝移植或肝膽手術(shù)；④腫瘤保留不完整、邊界模糊；⑤凝血功能異常；⑤伴有自身免疫疾病、其他腫瘤或精神疾病。另選取同期本院健康體檢者80 例作為對(duì)照組。其中，男性49例，女性31例；年齡42～80歲，平均（62.94±4.86）歲；BMI 18.95～25.2 kg/m2，平均（22.03±2.15）kg/m2。兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑

Trizol Reagent 試劑盒（德國(guó)凱杰公司），TapMan MicroRNA RT 試劑盒（美國(guó)ABI 公司），miR 特異性TapMan 探針及TapMan Universal PCR Master Mix（美國(guó)ABI 公司）。

1.3 方法

采集PHC 組術(shù)前、術(shù)后3 d 及對(duì)照組體檢當(dāng)日的5 ml 空腹靜脈血，置于含有EDTA 抗凝試管中，室溫下靜置1 h，3 000 r/min 離心10 min，取上清液于干凈離心管中，置入-80℃冰箱冷凍保存。使用Trizol Reagent 試劑盒提取血清中總RNA，通過(guò)TapMan MicroRNA RT 試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體操作參照說(shuō)明書(shū)。使用miR 特異性TapMan 探針及TapMan Universal PCR Master Mix 進(jìn)行miR-150 的qRT-PCR 檢測(cè)，U6作為內(nèi)參基因，其正向序列：5'-GGTATGATGCAGTAGCACC-3'，反向序列 ：5'-AAGTGATCGCAGTACGTAC-3'，長(zhǎng)度分別為121 bp、119 bp；miR-150 正向序列：5'-GTGTATGCAGCAGT AGCTGGA-3'，反向序列：5'-CAGTAGTCAGTACGGA CGAAG-3'，長(zhǎng)度分別為116 bp、118 bp?？偡磻?yīng)體系為20 μl，qRT-PCR 反應(yīng)條件：50℃預(yù)變性2 min，95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，共循環(huán)40 次。根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算miR-150 相對(duì)表達(dá)量。電話(huà)隨訪(fǎng)時(shí)間截止至2021年2月，統(tǒng)計(jì)PHC 患者術(shù)后1年和術(shù)后3年生存率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比表示，比較用χ2檢驗(yàn)；Kaplan-Meier法繪制生存曲線(xiàn)，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)，影響因素的分析用多因素Cox 風(fēng)險(xiǎn)比例模型。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者手術(shù)前后血清miR-150相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)照組、PHC組患者術(shù)前血清miR-150相對(duì)表達(dá)量分別為（0.93±0.15）和（0.42±0.09），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=26.077，P=0.000），PHC組較對(duì)照組低。PHC組術(shù)后血清miR-150相對(duì)表達(dá)量為（0.73±0.12），與術(shù)前miR-150相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.485，P=0.000），術(shù)后較術(shù)前高。

2.2 不同血清miR-150水平患者的臨床病理特征比較

以miR-150 相對(duì)表達(dá)量0.42 作為分界值，將PHC組分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分別有48和32例。兩組患者不同組織分化程度、不同TNM 分期、是否伴有肝硬化及是否伴有轉(zhuǎn)移比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組患者性別比、不同年齡、不同腫瘤直徑、是否伴有肝硬化復(fù)發(fā)、是否伴有乙型肝炎、不同AFP 水平、是否伴有門(mén)脈癌栓比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者臨床病理特征比較 例

2.3 血清miR-150水平與PHC患者預(yù)后的關(guān)系

高表達(dá)組與低表達(dá)組患者3年累積生存率分別為62.50%和21.88%，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.946，P=0.000），低表達(dá)組較高表達(dá)組低。低表達(dá)組、高表達(dá)組中位生存時(shí)間分別為19.4 個(gè)月、29.0 個(gè)月。見(jiàn)圖1。

圖1 高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的生存曲線(xiàn)

2.4 影響PHC患者3年生存率的Cox回歸分析

單因素、多因素Cox 回歸模型分析結(jié)果顯示，miR-150 低表達(dá)、腫瘤直徑≥5 cm、TNM 分期Ⅲ期和Ⅳ期、肝硬化、轉(zhuǎn)移、AFP ≥25 ng/ml 及伴有門(mén)脈癌栓是影響PHC 患者3年生存率的獨(dú)立因素（P＜0.05）。見(jiàn)表2、3。

表2 影響PHC患者3年生存率的單因素Cox回歸分析參數(shù)

表3 影響PHC患者3年生存率的多因素Cox回歸分析參數(shù)

續(xù)表3

3 討論

目前，臨床關(guān)于PHC 的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但多認(rèn)為與乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、吸煙、環(huán)境污染等因素相關(guān)[11]?，F(xiàn)代研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展屬于分子調(diào)控失控過(guò)程，涉及諸多環(huán)節(jié)，包括抑癌基因失活、癌基因激活、細(xì)胞基質(zhì)間黏附障礙及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)異常等[12]。但對(duì)PHC的病理、生理認(rèn)知仍存在一定不足，深入分析其發(fā)病機(jī)制及防治靶點(diǎn)，尤其是借助測(cè)序技術(shù)、分子生物學(xué)等手段探索評(píng)估預(yù)后的新型標(biāo)志物，對(duì)改善PHC 預(yù)后尤為重要。

miRNA 屬于一類(lèi)內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，由22 個(gè)核苷酸構(gòu)成，長(zhǎng)度18～25 nt，其與下游多個(gè)靶基因結(jié)合后可抑制、降解轉(zhuǎn)錄后基因水平，調(diào)節(jié)靶基因蛋白和mRNA 表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞細(xì)胞分化、凋亡及增殖的諸多生物學(xué)特性，同時(shí)參與調(diào)控腫瘤干細(xì)胞、調(diào)節(jié)腫瘤微生物及腫瘤的遷移、侵襲等過(guò)程[13]。ZHANG 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-150 在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)，且可能通過(guò)抑制高遷移率族蛋白A2阻斷細(xì)胞增殖，下調(diào)Cyclin A表達(dá)阻滯細(xì)胞周期。JIANG 等[15]研究報(bào)道，miR-150 在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中顯著上調(diào)，其可能通過(guò)SIRT2/JMJD2A 信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞活力及遷移產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。喬恩奇等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-150在乳腺癌中高表達(dá)，干擾miR-150表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/Akt 信號(hào)、上調(diào)Leaved Caspase 等有關(guān)。以上研究證實(shí)，miR-150 在不同環(huán)境及疾病中可發(fā)揮一定的抑癌或促癌因子作用，但其在PHC 中是否發(fā)揮同樣作用及具體的機(jī)制尚未完全闡明。ZHANG 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-150 在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中呈低表達(dá)，且可能通過(guò)下調(diào)靶標(biāo)c-Myb 參與肝臟干細(xì)胞自我更新。YU 等[18]研究報(bào)道，肝細(xì)胞癌患者血清miR-150水平比健康對(duì)照者低，術(shù)后miR-150水平升高，腫瘤復(fù)發(fā)后降低，診斷慢性乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝細(xì)胞癌的AUC 為0.931，敏感性為82.5%，特異性為83.7%，Kaplan-Meier曲線(xiàn)分析顯示，miR-150水平較低的患者總生存期更短。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-150 表達(dá)可能與PHC 患者組織分化程度、TNM 分期、是否伴有肝硬化及轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示miR-150 水平與PHC 患者發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，miR-150高表達(dá)可能對(duì)抑制癌轉(zhuǎn)移、減輕病情有一定作用。其原因可能在于miR-150過(guò)表達(dá)可能抑制癌細(xì)胞血管生成及轉(zhuǎn)移能力，而下調(diào)miR-150表達(dá)可加速腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲，增強(qiáng)腫瘤血管生成能力，故miR-150 在PHC 患者中發(fā)揮抑癌作用。多因素Cox 回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，miR-150 低表達(dá)、腫瘤直徑≥5 cm、TNM 分期為Ⅲ期和Ⅳ期、肝硬化、轉(zhuǎn)移、高AFP水平及伴有門(mén)脈癌栓是影響PHC患者3年生存率的獨(dú)立因素。

綜上所述，miR-150 在PHC 患者中低表達(dá)，與患者預(yù)后、組織分化程度、TNM 分期等關(guān)系密切，有望成為評(píng)估PHC 患者預(yù)后的新型分子標(biāo)志物。但因本研究存在觀(guān)察時(shí)間短、樣本量少、樣本來(lái)源單一等局限性，有待延長(zhǎng)觀(guān)察時(shí)間、擴(kuò)大樣本量及范圍進(jìn)一步探討。