陳學(xué)泰 劉宇程 范利君 陳立平 申 文△

（1 徐州醫(yī)科大學(xué)江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室，徐州 221004；2 鹽城市第一人民醫(yī)院麻醉科，鹽城 224700；3 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院疼痛科，徐州 221004）

近年來，國內(nèi)越來越多的文獻報道鉑類、紫杉類、長春生物堿類等抗腫瘤藥物在治療腫瘤的同時，可引起病人痛覺過敏或痛覺超敏，部分病人還表現(xiàn)為手套樣或襪套樣感覺異常，臨床上稱為化療藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛 (chemotherapy-induced neuropathic pain, CINP)，簡稱化療痛[1～3]。CINP 嚴(yán)重限制了抗腫瘤藥物的應(yīng)用，影響了腫瘤病人的生活質(zhì)量。然而，目前針對CINP 的有效治療方法有限，CINP 的機制也尚未明確，國內(nèi)外均未發(fā)現(xiàn)能預(yù)防和控制這一并發(fā)癥的有效藥物和方法，所以開展控制化療痛的新藥研究，闡明其分子機制是目前該領(lǐng)域的研究熱點。

最新研究證實，中樞敏化在CINP 的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用，越來越多的研究表明，中樞神經(jīng)膠質(zhì)細胞在CINP 中發(fā)揮重要作用[4～6]。脊髓背角是化療引起痛覺過敏的主要作用部位。在脊髓中，痛覺信息由感覺神經(jīng)元傳遞，然后通過脊髓神經(jīng)元-神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元之間的多種信號通路進行處理。除了神經(jīng)元機制外，脊髓膠質(zhì)細胞，特別是小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞，在化療誘導(dǎo)的痛覺過敏的發(fā)生中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。研究表明，小膠質(zhì)細胞的激活有助于順鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛。被激活的小膠質(zhì)細胞能通過趨化作用介導(dǎo)傷害性信號，并通過小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的相互作用釋放促炎細胞因子[7～9]。

氯吡格雷 (Clopidogrel)是一種有效、口服的靶向血小板P2Y12 的抗血栓化合物[10,11]。有報道氯吡格雷對P2Y12 的作用依賴于其在肝臟代謝過程中產(chǎn)生的活性代謝物，也觀察到其通過血腦屏障轉(zhuǎn)運[12]。近年來，大量的文獻指出，氯吡格雷能夠通過抑制小膠質(zhì)細胞P2Y12 受體產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。有研究指出口服10 mg/kg 氯吡格雷可緩解脊神經(jīng)結(jié)扎所引起的觸覺異常和熱痛覺過敏[13]。也有研究報告稱，更高的劑量 (25 mg/kg) 對緩解觸覺異常具有更持久的影響[14]。然而，氯吡格雷能否緩解順鉑所介導(dǎo)的痛覺過敏以及潛在的細胞和分子機制仍不清楚?；谝陨献C據(jù)，本研究采用順鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛模型，探討氯吡格雷對順鉑介導(dǎo)的化療痛小鼠脊髓背角Iba-1 及促炎因子的影響，為進一步明確氯吡格雷在化療痛中的作用提供研究思路。

方 法

1.實驗動物及試劑

實驗采用SPF 級健康C57BL/6J 8 周雄性小鼠，由徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。所有實驗操作程序均經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利與應(yīng)用委員會批準(zhǔn)，遵守國際衛(wèi)生學(xué)會《實驗動物福利和應(yīng)用指南》。山羊抗Iba-1 (Abcam, USA)，兔抗GAPDH (CST,USA)，TNF-α、IL-1β 及IL-6 ELISA 試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

2. 順鉑介導(dǎo)的化療痛動物模型制備及給藥方法

C57BL/6J 8 周雄性小鼠40 只，采用隨機數(shù)字表法分為4 組（每組10 只）：對照組（Control 組）；氯吡格雷組 （Clopidogrel 組）：氯吡格雷10 mg/kg灌胃連續(xù)5 天；化療痛組（Cisplatin 組）：小鼠進行腹腔注射順鉑 2.3 mg/kg , 連續(xù)注射5 天，休息5天，再連續(xù)注射5 天，再休息5 天；化療痛 + 氯吡格雷組（Cisplatin + Clopidogrel 組）：順鉑最后1 次注射后，開始氯吡格雷10 mg/kg 灌胃，連續(xù)5天。順鉑給藥前、給藥后第 1、5、10、15、20 天使用vonFrey 測痛儀測定大鼠機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)（ 第20天行為學(xué)檢測時間在氯吡格雷腹灌胃4 h 后），采用Western Blot 及免疫熒光方法檢測Iba-1，給藥后采用ELISA 檢測脊髓TNF-α、IL-1β 及IL-6表達。

3.疼痛行為學(xué)檢測

采用MWT 值來反映小鼠的機械痛閾。本實驗使用的vonFrey 細絲包括：0.02、0.07、0.16、0.4、0.6、1.0 和1.4 g。將小鼠放置到10 cm×10 cm×15 cm 的有機玻璃盒中，每次實驗前適應(yīng)約半小時。小心將vonFrey 細絲置于小鼠足底并使其彎曲，保持彎曲3～4 s，且同一只小鼠的同一側(cè)足底相鄰2 次刺激之間需間隔10 min。初次刺激時使用克度為0.16 的vonFrey 細絲。當(dāng)小鼠足底出現(xiàn)敏銳的抬腳反應(yīng)，則為陽性反應(yīng)，在vonFrey 表中記作X。反之，則為陰性反應(yīng)，記作O。從出現(xiàn)陰、陽性反應(yīng)變化開始，共進行6 次試驗。試驗結(jié)束后，用 50%vonFrey 反應(yīng)閾值公式計算出小鼠的MWT 值。

4. Western Blot 檢測

小鼠深麻醉（小鼠腹腔注射 1%戊巴比妥鈉40 mg/kg）后，在冰上迅速取出脊髓腰膨大段 (L4-5)，加入裂解液進行勻漿，4℃下12, 000 rpm 離心20 min，并進行BCA 蛋白定量。配置 12%的分離膠和 5%的濃縮膠，濃縮膠電泳條件為 80 伏恒壓，分離膠電泳條件為100 伏恒壓，當(dāng)溴酚藍染料前端電泳至分離膠末端處時即停止電泳，轉(zhuǎn)膜后 5%脫脂奶粉封閉 2 h，加入GAPDH (兔抗小鼠，1:2000)，IBA-1（羊抗小鼠，1:1000），4℃孵育過夜后 TBST 洗膜 6 次，每次5 min。加入 HRP 標(biāo)記的山羊抗兔 IgG (1:1000)，HRP 標(biāo)記的驢抗山羊IgG (1:1000) 室溫孵育1 h 后TBST 洗膜6 次，每次5 min。ECL 反應(yīng)、顯影、定影后使用圖像分析系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。

5.免疫熒光染色

大鼠經(jīng)心臟灌注生理鹽水沖去血液，再用4℃的4%多聚甲醛溶液（溶于0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液中，pH 7.4）灌注固定。取出L4-5脊髓組織，繼續(xù)后固定 1～3 h，隨后轉(zhuǎn)入 30%蔗糖溶液脫水3 天。用冰凍切片機 (Leica CM1900)將組織切成20 μm薄片用于染色。組織片用3% 驢血清的0.3% Triton X-100 溶液常溫固定1 h，再孵育小膠質(zhì)細胞特異性標(biāo)記物 Iba-1 抗體 4℃過夜，洗滌后常溫避光孵育FITC 偶聯(lián)的 IgG，用熒光顯微鏡和CCD 掃描相機(Leica)拍照。

6. ELISA 檢測

小鼠深麻醉（腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg）后，在冰上迅速取出脊髓腰膨大段 (L4-5)，按組織凈重 (g)：稀釋液體積 (ml) = 1:9 的比例加入預(yù)冷的生理鹽水。勻漿后于4℃，3500 rpm 離心10 min（離心半徑5 cm），提取上清液并在-80℃保存。按試劑盒說明書檢測蛋白并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出脊髓TNF-α、IL-1β 及IL-6 濃度。

7.統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計分析，痛閾值分析采用重復(fù)測量的方差分析，灰度值比較采用單因素方差分析，組間比較方差齊性時采用 LSD 法，計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 氯吡格雷對順鉑介導(dǎo)的化療痛小鼠小鼠MWT的影響

給藥前各組小鼠的MWT 差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與Control 組相比，腹腔注射順鉑 5 次后（第5 天），小鼠 MWT 顯著性降低 (P＜ 0.05)，并且一直持續(xù)到20 天，提示順鉑誘導(dǎo)化療痛小鼠模型成功。與Cisplatin 組相比，Cisplatin + Clopidogrel 組能夠明顯逆轉(zhuǎn)順鉑介導(dǎo)的化療痛小鼠的痛閾降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜ 0.05)。而正常組小鼠氯吡格雷灌胃前后痛閾無明顯差異（見圖1）。以上結(jié)果表明Clopidogrel 能減輕順鉑介導(dǎo)的化療痛小鼠的機械痛覺過敏。

圖1 氯吡格雷灌胃對順鉑介導(dǎo)的化療痛小鼠機械縮足反射閾值的影響(±SD,n =10)*P＜ 0.05，與control 組相比；#P＜ 0.05，與cisplatin 組相比Fig. 1 Effects of clopidogrel on MWT in mice with cisplatininducedpain (±SD, n= 10)*P ＜ 0.05, compared with group control; #P ＜ 0.05,compared with group cisplatin.

2. 氯吡格雷對順鉑介導(dǎo)的化療痛小鼠脊髓Iba-1蛋白表達的影響

Western Blot 結(jié)果顯示：在第20 天，與Control組相比，Cisplatin 組小鼠脊髓Iba-1 表達明顯增多(P＜0.05)，與Cisplatin 組相比，Cisplatin + Clopidogrel 組小鼠氯吡格雷灌胃后，氯吡格雷可以明顯逆轉(zhuǎn)化療痛小鼠脊髓Iba-1 蛋白表達增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，見圖2A），提示氯吡格雷可以抑制順鉑介導(dǎo)的化療痛小鼠脊髓Iba-1 的表達。

免疫熒光結(jié)果顯示：在第20 天，Control 組小鼠脊髓背角小膠質(zhì)細胞數(shù)量較少；Cisplatin 組小鼠脊髓背角小膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯增多(P＜ 0.05)；Cisplatin + Clopidogrel 組小鼠氯吡格雷灌胃后，氯吡格雷可以明顯逆轉(zhuǎn)化療痛小鼠脊髓小膠質(zhì)細胞數(shù)量增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，見圖2B），提示氯吡格雷可以抑制順鉑介導(dǎo)的化療痛小鼠脊髓背角小膠質(zhì)細胞活性。

3.氯吡格雷對順鉑介導(dǎo)的化療痛小鼠脊髓TNF-α、IL-1β 及IL-6 蛋白表達的影響

ELISA 結(jié)果顯示：在第20 天，與Control 組相比，Cisplatin 組小鼠脊髓 TNF-α、IL-1β 及IL-6 表達顯著升高 (P＜ 0.05)，與Cisplatin 組相比，Cisplatin + Clopidogrel 組小鼠氯吡格雷灌胃后，氯吡格雷可以明顯逆轉(zhuǎn)化療痛小鼠脊髓TNF-α、IL-1β 及IL-6 表達增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，見圖3）。提示氯吡格雷可以抑制順鉑介導(dǎo)的化療痛小鼠脊髓TNF-α、IL-1β及IL-6 的表達。

圖3 氯吡格雷對順鉑介導(dǎo)的化療痛小鼠促炎因子TNF-α、IL-1β 及IL-6 表達的影響 (±SD)*P ＜ 0.05，與control 組相比；#P ＜ 0.05，與cisplatin 組相比Fig. 3 Effect of Clopidogrel on the expression of pro-inflammatory factor TNF-α, IL-1β and IL-6 in cisplatin induced chemotherapy pain (±SD)*P ＜ 0.05, compared with group control; #P ＜ 0.05, compared with group cisplatin.

討 論

化療痛(CINP)是化療藥物如鉑類化合物（順鉑）、紫杉烷、長春花生物堿的主要不良反應(yīng)。順鉑作為第一代抗腫瘤藥物廣泛用于治療實體腫瘤，尤其是睪丸癌、卵巢癌和膀胱癌。鉑類藥物能夠與DNA 結(jié)合，影響DNA 復(fù)制，抑制轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)細胞凋亡來發(fā)揮其抗腫瘤活性[15]。但化療痛的機制至今尚未明確。近年來，有關(guān)中樞膠質(zhì)細胞在CINP 中的作用的研究越來越多。研究表明，紫杉醇治療后脊髓中小膠質(zhì)細胞表達明顯增多，以及小膠質(zhì)細胞的抑制劑二甲胺四環(huán)素可以顯著逆轉(zhuǎn)紫杉醇引起的冷痛覺過敏。這些研究證明了脊髓小膠質(zhì)細胞在化療痛中的關(guān)鍵作用。然而，也有證據(jù)表明脊髓星形膠質(zhì)細胞的激活與奧沙利鉑、硼替佐柏和紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛有關(guān)[16,17]。也有相關(guān)研究表明，小膠質(zhì)細胞的激活有助于順鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛。順鉑能夠激活小膠質(zhì)細胞，使其釋放大量促炎因子介導(dǎo)化療痛，并且不激活星形膠質(zhì)細胞。注射小膠質(zhì)細胞抑制劑二甲胺四環(huán)素能減輕順鉑誘導(dǎo)的CINP。而星形膠質(zhì)細胞抑制劑的L-AA 對順鉑誘導(dǎo)的CINP 無明顯改善[7]。造成不同膠質(zhì)細胞激活原因可能與化療藥物的種類和劑量有關(guān)。本研究結(jié)果與報道的一致，順鉑能引起小膠質(zhì)細胞的激活，提示了小膠質(zhì)細胞激活在順鉑誘導(dǎo)的化療痛機制中發(fā)揮了重要作用，但星形膠質(zhì)細胞是否激活及小膠質(zhì)細胞激活調(diào)節(jié)的具體機制還需進一步研究。

氯吡格雷是一種有效的、口服的靶向血小板P2Y12 的抗血栓化合物，其安全性來自廣泛的臨床項目的研究結(jié)果[10,11]。氯吡格雷對P2Y12 的作用依賴于其在肝臟代謝過程中產(chǎn)生的活性代謝物，也觀察到其通過血腦屏障的轉(zhuǎn)運[12]。近年來，大量的文獻指出，氯吡格雷能夠通過抑制小膠質(zhì)細胞P2Y12受體產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[13,14]。臨床上，氯吡格雷的活性代謝物需要連續(xù)幾天給藥才能達到治療效果，因此，本研究連續(xù)5 天給予氯吡格雷，使其有效地抑制P2Y12R。氯吡格雷的鎮(zhèn)痛作用已在脊神經(jīng)結(jié)扎模型[18]、慢性偏頭痛模型[19]中得到證實，但在化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛中應(yīng)用還未見報道，本研究結(jié)果顯示：氯吡格雷能減輕順鉑介導(dǎo)的化療痛小鼠的機械痛覺過敏，并且氯吡格雷抑制了順鉑介導(dǎo)的化療痛小鼠脊髓小膠質(zhì)細胞蛋白的表達。

有文獻報道指出，在疼痛模型中，脊髓中小膠質(zhì)細胞通過激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶和p38 信號通路促進促炎細胞因子TNF-α、IL-1β 及IL-6 的持續(xù)產(chǎn)生。一方面，這些促炎細胞因子通過作用于脊髓小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞自身及周圍相應(yīng)受體，促進膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的“炎癥湯”的形成。另一方面，它們通過作用于突觸前和/或突觸后膜中相應(yīng)的受體，直接介導(dǎo)突觸可塑性和神經(jīng)元興奮性[20,21]。ELISA結(jié)果顯示，順鉑腹腔注射后，促炎因子TNF-α、IL-1β 及IL-6 表達顯著升高，氯吡格雷對抑制了順鉑介導(dǎo)的化療痛小鼠脊髓TNF-α、IL-1β 及IL-6 蛋白表達增多。本研究表明氯吡格雷能夠緩解順鉑介導(dǎo)的化療痛小鼠痛覺過敏，其機制可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)。而氯吡格雷是否能夠通過抑制脊髓小膠質(zhì)細胞活化，減少促炎因子的合成和釋放來緩解化療痛還有待于實驗進一步證實。

綜上所述，在本實驗條件下氯吡格雷能夠抑制順鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛，其作用機制可能與抑制脊髓小膠質(zhì)細胞激活及其炎癥反應(yīng)有關(guān)。這為闡明氯吡格雷調(diào)控化療痛的發(fā)展過程提供了實驗依據(jù)，并為臨床治療化療痛提供了新的思路。