江光熙，高 福，陳 蕓，趙思明

(1.湖北省公安縣公共檢驗(yàn)檢測中心，湖北 荊州 434300； 2.江蘇微康生物科技有限公司，江蘇 蘇州 215200； 3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070)

綠豆是我國常見的豆類之一，其營養(yǎng)豐富，具有良好的食用價值和藥用價值。中醫(yī)認(rèn)為，綠豆味甘性寒，可以清熱解毒，消暑利水[1]?，F(xiàn)代研究表明，綠豆具有抗菌抑菌[2]、降血糖[3]、降血脂[4]、抗腫瘤[5]、抗氧化[6]、提高免疫力等功效[7]。新近研究發(fā)現(xiàn)，食用綠豆可有效緩解高脂飲食小鼠的體重增加和脂質(zhì)代謝紊亂，并調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系的結(jié)構(gòu)[8]。綠豆經(jīng)萌發(fā)后其營養(yǎng)組成發(fā)生改變，容易被人體吸收，同時該過程還可富集酚類、異黃酮和γ-氨基丁酸等對人體有生理功能的活性物質(zhì)，減少或消除抗?fàn)I養(yǎng)因子[9-12]。

隨著人們健康意識逐漸增強(qiáng)，消費(fèi)觀念隨之轉(zhuǎn)變。谷物飲料因具有天然、綠色、營養(yǎng)、健康的特點(diǎn)，符合飲料市場發(fā)展潮流和趨勢，從而受到越來越多人的青睞。益生菌發(fā)酵不僅可以改善產(chǎn)品的風(fēng)味、口感等，還可以促使結(jié)合態(tài)活性成分的釋放，從而發(fā)揮更好的營養(yǎng)和健康效益[13-15]。我們以萌發(fā)的綠豆為原料，利用課題組篩選的卡斯特酒香酵母和植物乳酸桿菌對其進(jìn)行發(fā)酵，主要研究復(fù)合菌種發(fā)酵工藝條件對綠豆?jié){品質(zhì)的影響，以期為發(fā)酵綠豆?jié){的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠豆，中綠1號，購于湖北省種子管理局商業(yè)中心；卡斯特酒香酵母(Brettanomycescustersii)ZSM-001(專利號：ZL2007100536112)和植物乳酸桿菌(Bourdichonplantarum)ZSM-002(專利號：ZL2009100638581)均由中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。

LRH-150B型生化培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械；HD-1360型水平流超凈工作臺，哈爾濱東聯(lián)儀器公司；722S型可見光分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDL-S-A型臺式離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)用菌種的制備

取冷藏的酵母和乳酸菌株，在無菌操作臺中分別從斜面中取2～3環(huán)接種到土豆液體培養(yǎng)基和MRS液體培養(yǎng)基中30℃下培養(yǎng)24 h，其中酵母菌在搖床中培養(yǎng)。液體培養(yǎng)結(jié)束后，分別從液體培養(yǎng)基中鉤出1環(huán)接種到相應(yīng)的固體平板中，在30℃下培養(yǎng)48 h使菌活化。取活化菌種2～3環(huán)接種到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，在30℃下培養(yǎng)48 h，其中酵母菌在搖床中培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，將菌液在4 000 r/min下離心5 min，離心結(jié)束后倒去培養(yǎng)液，收集菌泥(乳酸菌水分約為72.3%，酵母菌水分約為66.7%)備用。

1.2.2發(fā)酵綠豆?jié){的制備

稱取一定量無破損綠豆，用自來水沖洗干凈后用0.1%的次氯酸鈉浸泡10 min進(jìn)行消毒，再用自來水沖洗干凈，加入3倍體積的硫酸鋅溶液(濃度150 mg/L)浸泡5 h，瀝干后置于已消毒的發(fā)芽器中發(fā)芽16 h (發(fā)芽溫度25℃，濕度90%～99%)，發(fā)芽結(jié)束后用蒸餾水清洗2次，按照液豆重量比1∶2加入營養(yǎng)液(10 mmol/LL-谷氨酸鈉，0.2 mmol/L CaCl2)，用碎冰機(jī)磨漿2 min。將經(jīng)過2次活化2次擴(kuò)大培養(yǎng)的ZSM-001酵母菌與ZSM-002植物乳酸菌按照一定比例和添加量加入到綠豆?jié){中于一定溫度下發(fā)酵。

1.2.3發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.3.1單因素試驗(yàn)

分別研究乳酸菌和酵母菌菌種比例、接種量、糖添加量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度對綠豆?jié){感官品質(zhì)的影響。

1.2.3.2正交試驗(yàn)

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，以復(fù)合菌比例、接種量、加糖量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度為因素，選取4個水平，以發(fā)酵綠豆?jié){的pH值、酸度、GABA含量、植酸含量、感官評定為指標(biāo)進(jìn)行五因素四水L16(45)正交試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵條件。

1.2.4品質(zhì)評價指標(biāo)的測定

1.2.4.1感官評定

由5位食品專業(yè)人員組成感官評定小組，對綠豆?jié){的組織狀態(tài)、色澤、氣味分別進(jìn)行評價后再對綠豆?jié){進(jìn)行綜合評定，感官評定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 發(fā)酵綠豆?jié){感官評定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4.2酸度的測定

稱取攪拌均勻樣品5.0 g于150 ml三角瓶中，加入 40 ml 新煮沸并已冷卻至約 40℃的蒸餾水混勻，再加入5滴酚酞指示劑，用濃度為0.1 mol/L氫氧化鈉滴定至微紅色，30 s內(nèi)不消失為滴定終點(diǎn)，記錄消耗氫氧化鈉體積V。酸度=V×20(°T)。

1.2.4.3GABA含量的測定

稱取綠豆5.0 g加水研磨后定容至50 ml。于30℃下水浴浸提2 h后4 000 r/min離心10 min，用0.25 μm微孔過濾膜過濾，取濾液0.6 ml于25 ml，加入0.2 ml 0.2 mol/L硼酸-硼酸鈉緩沖液(pH9.0)，1 ml 6%苯酚溶液，0.4 ml次氯酸鈉(活性氯質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.25%)，振蕩沸水浴10 min后立即冰水浴20 min(有藍(lán)綠色化合物出現(xiàn))，加入2 ml 60%乙醇溶液于645 nm下比色，測吸光值。根據(jù)吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出樣品中GABA含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過配制0,0.025、 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/ml的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方法測定其吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)x，以吸光度為縱坐標(biāo)y繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=3.986 3x-0.017 7(R2=0.995 6)。

1.2.4.4植酸的測定

采用GB/T 5009.153—2016的方法測定。

1.2.5數(shù)據(jù)處理

采用Excel 軟件和SAS V8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1復(fù)合菌種比對綠豆?jié){感官品質(zhì)的影響

復(fù)合菌種比對發(fā)酵綠豆?jié){感官品質(zhì)的影響見表2。

表2 復(fù)合菌種比對發(fā)酵綠豆?jié){感官品質(zhì)的影響

由表2可知，復(fù)合菌種比對發(fā)酵綠豆?jié){的組織狀態(tài)和色澤無顯著影響，對發(fā)酵綠豆?jié){的氣味和綜合評分有顯著影響。在乳酸菌∶酵母菌為2∶3時，發(fā)酵綠豆?jié){的綜合評分和氣味評分均最高，在菌種比為1∶0時最低。隨著乳酸菌含量的減少、酵母菌含量的增大，氣味和綜合評分呈先增大后減小趨勢，這可能是因?yàn)槿樗峋a(chǎn)生的乳酸與綠豆?jié){中的揮發(fā)性物質(zhì)混合使綠豆?jié){產(chǎn)生異味，而酵母菌利用中鏈脂肪酸及脂類氧化產(chǎn)物產(chǎn)生的醇類、酸類物質(zhì)具有果香味，使綠豆?jié){具有良好發(fā)酵氣味；但酵母菌添加量過大時，又使綠豆?jié){產(chǎn)生異味，導(dǎo)致評分降低。適宜的乳酸菌與酵母菌比例為2∶3～1∶2。

2.1.2接種量對發(fā)酵綠豆?jié){感官品質(zhì)的影響

接種量對發(fā)酵綠豆?jié){感官品質(zhì)的影響見表3。

表3 接種量對發(fā)酵綠豆?jié){感官品質(zhì)的影響

由表3可知，接種量對發(fā)酵綠豆?jié){的色澤無顯著影響，但對發(fā)酵綠豆?jié){的組織狀態(tài)、氣味和綜合評分有不同程度的影響。隨著接種量增加，綠豆?jié){發(fā)酵氣孔越來越密集，其組織狀態(tài)評分增高。發(fā)酵綠豆?jié){的氣味和綜合評分隨著接種量增加呈先升高后降低的趨勢，在總接種量為0.6%時，兩者評分最高。適宜的接種量為0.2%～1.4%。

2.1.3加糖量對發(fā)酵綠豆?jié){感官品質(zhì)的影響

接種量對發(fā)酵綠豆?jié){感官品質(zhì)的影響見表4。

表4 糖添加量對發(fā)酵綠豆?jié){感官品質(zhì)的影響

由表4可知，加糖量對發(fā)酵綠豆?jié){的色澤無顯著影響，對發(fā)酵綠豆?jié){的組織狀態(tài)、氣味和綜合評分有不同影響。隨著加糖量的增加，發(fā)酵綠豆?jié){的組織狀態(tài)評分逐漸升高，氣味和綜合評分呈先升高后降低的趨勢，在加糖量為3%時，氣味和綜合評分達(dá)到最大值。適宜的加糖量范圍為3%～5%。

2.1.4發(fā)酵時間對發(fā)酵綠豆?jié){感官品質(zhì)的影響

發(fā)酵時間對發(fā)酵綠豆?jié){感官品質(zhì)的影響見表5。

表5 發(fā)酵時間對發(fā)酵綠豆?jié){感官品質(zhì)的影響

由表5可知，隨著發(fā)酵時間的延長，綠豆?jié){組織狀態(tài)評分逐漸升高，氣味和綜合評分均先升高后降低，在發(fā)酵4 h時，氣味評分和綜合評分均最高。這可能與菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝產(chǎn)物的積累有關(guān)。適宜的發(fā)酵時間為4～5 h。

2.1.5發(fā)酵溫度對發(fā)酵綠豆?jié){感官品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度對發(fā)酵綠豆?jié){感官品質(zhì)的影響見表6。由表6可知，隨著溫度的升高，綠豆?jié){的組織狀態(tài)評分逐漸升高，而色澤、氣味和綜合評分均先升高后降低。在發(fā)酵溫度為30℃時，色澤、氣味和綜合評分均達(dá)到最大值。適宜的發(fā)酵溫度約為30℃。

表6 發(fā)酵溫度對發(fā)酵綠豆?jié){感官品質(zhì)的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

以復(fù)合菌種比、接種量、加糖量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度為因素設(shè)計正交試驗(yàn)L16(45)，以發(fā)酵綠豆?jié){的pH值、酸度、GABA含量、植酸含量、感官綜合評分為指標(biāo)確定最佳發(fā)酵條件，試驗(yàn)結(jié)果見表7。對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見8。

表7 正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

由表8可知，影響發(fā)酵綠豆?jié){pH值和酸度的因素按主次順序?yàn)椋築>A>C>D>E，且各因素影響水平均為極顯著(P<0.01)；影響發(fā)酵綠豆?jié){GABA含量的因素按主次順序?yàn)椋篋>B>E>A>C，且B、D的影響水平為極顯著(P<0.01)，A、C、E的影響水平為顯著(P<0.05)；影響發(fā)酵綠豆?jié){的植酸含量因素按主次順序?yàn)椋篍>D>B>A>C，且A、B、D、E的影響水平為極顯著(P<0.01)，C因素不具有顯著性(P>0.1)；影響發(fā)酵綠豆?jié){感官綜合評分的因素按主次順序?yàn)椋篈>B>D>E>C，且A、B、D的影響水平為極顯著(P<0.01)，E的影響水平為顯著(P<0.05)，C的影響水平不顯著(P>0.1)。

表8 正交試驗(yàn)方差分析表(F/P)

正交試驗(yàn)均值分析表見表9。

由表9可知，以GABA含量為評價指標(biāo)，最佳發(fā)酵條件為A2(A3，A4)B3(B4)C3D3(D4)E1(E2)，即復(fù)合菌種比為1∶1(2∶3，1∶2)，接種量為1.0%(1.4%)，加糖量5%，發(fā)酵時間為5 h(6 h)，發(fā)酵溫度為20℃(25℃)。以植酸為評價指標(biāo)，最佳發(fā)酵條件為A3B2C3D1E2，即復(fù)合菌種比為2∶3，接種量為0.6%，加糖量5%，發(fā)酵時間為3 h，發(fā)酵溫度為30℃。以感官綜合評分為評價指標(biāo)，最佳發(fā)酵條件為A3B3C4D3(D4)E3(E4)，即復(fù)合菌種比為2∶3，接種量為1.0%，加糖量7%，發(fā)酵時間為5 h(6 h)，發(fā)酵溫度為35℃(40℃)。綜合各因素的重要性，最優(yōu)發(fā)酵條件為A3B3C3D3E2，即復(fù)合菌種比為2∶3，接種量為1.00%，加糖量為5%，發(fā)酵時間為5 h，發(fā)酵溫度為30℃。

表9 正交試驗(yàn)均值分析表

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表10。

由表10可知，工藝1的pH值和植酸含量均明顯高于工藝2和工藝3，酸度、GABA和綜合評分均低于工藝2和工藝3，說明發(fā)酵條件對綠豆?jié){的pH值、酸度、GABA含量、植酸含量和綜合評分均有顯著作用。工藝2的GABA含量和感官綜合評分明顯高于工藝3，工藝3的植酸含量與工藝2無顯著性，由此確定最佳發(fā)酵條件為工藝2，即復(fù)合菌種比為2∶3，接種量為1.0%，加糖量為5%，發(fā)酵時間為5 h，發(fā)酵溫度為30℃，此時γ-氨基丁酸含量可達(dá)129.53±1.70 mg/(100 g)，植酸含量減少至1.29±0.13 mg/g。與未發(fā)酵的樣品相比，γ-氨基丁酸含量增加了39.6%，植酸含量減少了54.1%。

表10 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用卡斯特酒香酵母ZSM-001和植物乳酸桿菌ZSM-002進(jìn)行復(fù)配，在研究復(fù)合菌比例、接種量、糖添加量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對發(fā)酵綠豆?jié){的感官品質(zhì)影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了發(fā)酵工藝條件優(yōu)化研究，確定了適宜的發(fā)酵工藝條件為乳酸菌與酵母菌復(fù)合菌種比2∶3，接種量1.0%，加糖量5%時，于30℃下發(fā)酵5 h。采用該工藝所得產(chǎn)品中γ-氨基丁酸含量可達(dá)129.53 mg/(100 g)，植酸含量減少至1.29 mg/g。