秦小波, 高 華, 張冰冰, 高繼海

(1. 四川省自然資源科學(xué)研究院，成都 610015； 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611137; 3.成都市第三人民醫(yī)院 血液科，成都 610031; 4. 成都大學(xué) 醫(yī)學(xué)院(護(hù)理學(xué)院), 成都 610106)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)是具有包膜的正鏈RNA病毒，屬冠狀病毒屬(Coronavirus)；其感染引起的肺炎被世界衛(wèi)生組織命名為新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)[1]。SARS-CoV-2屬于β屬的新型冠狀病毒，其顆粒多是多形性，直徑約60～140 nm；其基因特征與中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)和急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)有明顯區(qū)別[2]；其RNA既可像mRNA 一樣直接進(jìn)行蛋白翻譯，也可當(dāng)作模板合成負(fù)義鏈，再經(jīng)負(fù)義鏈復(fù)制子代RNA，具有很高的突變率[3]。

已公布的SARS-CoV-2基因組序列[4-5]中，基因組全長約30 kb，預(yù)測的開放讀碼框架(ORF)達(dá)11個(gè)，可能編碼已知或未知的成熟功能蛋白20余種；其基因組具有典型的冠狀病毒基因組結(jié)構(gòu)，依次為5′-非翻譯區(qū)、5′-復(fù)制酶多聚糖蛋白基因(orf1/ab)、刺突糖蛋白基因(Spike, S)、小包膜糖蛋白基因(envelope，E)、膜糖蛋白基因(membrane，M)、核衣殼蛋白基因(nucleocapsid，N)以及3′-非翻譯區(qū)[6]。SARS-CoV-2作為一個(gè)新變種，其流行規(guī)律、致病機(jī)制與病原學(xué)特征都和以往流行的冠狀病毒具有差異。SARS-CoV-2全基因組序列的破譯，為COVID-19的診斷與相關(guān)研究提供了非常有用的基礎(chǔ)。又因其與SARS-CoV基因組表現(xiàn)出較高的序列同源性[2,6]，相關(guān)研究可通過與已有的其他冠狀病毒的蛋白編碼特征比較預(yù)測，為后續(xù)研究提供有力的指導(dǎo)。

核衣殼蛋白即N蛋白，是RNA病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，與致病性密切相關(guān)。SARS-CoV-2 N蛋白的功能主要與結(jié)合病毒RNA發(fā)揮作用相關(guān)，可能參與RNA的轉(zhuǎn)錄及復(fù)制等，更全面的生物學(xué)功能還需深入研究。從預(yù)測的蛋白質(zhì)氨基酸序列分析，其可能還具有與致病機(jī)理相關(guān)的新功能，因此在COVID-19的診斷以及疫苗研發(fā)方面具有重要意義。

通過公開的新型冠狀病毒的全基因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，N蛋白在不同地區(qū)的SARS-CoV-2中幾乎沒有變異，在冠狀病毒間變異也較小，且核心結(jié)構(gòu)區(qū)域保守。因此，其重組抗原對亞單位疫苗的研究和診斷試劑的研制具有重要價(jià)值。本研究利用生物信息學(xué)預(yù)測分析SARS-CoV-2的N蛋白結(jié)構(gòu)，構(gòu)建原核系統(tǒng)并進(jìn)行表達(dá)，獲得了大量高效表達(dá)的重組蛋白，為其作ELISA包被抗原開展抗體檢測提供基礎(chǔ)，也為后續(xù)相關(guān)深入研究提供借鑒和幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌菌株BL21、質(zhì)粒載體pET-28實(shí)驗(yàn)保存。核衣殼蛋白基因編碼序列等根據(jù)GenBank：NC_045512由擎科生物科技有限公司根據(jù)密碼子偏好優(yōu)化合成。各種限制性內(nèi)切酶、連接酶等購自TaKaRa公司;Ni-NTA 柱購自QIAGEN公司;抗His-tag多克隆抗體購自YEASEN公司;山羊抗兔IgG購自中杉金橋公司;Marker、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自天根生物有限公司;其他常規(guī)化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 序列分析及預(yù)測

1.2.1 SARS-CoV-2 核衣殼蛋白核酸及氨基酸序列分析

從國家生物信息中心(https://bigd.big.ac.cn)和NCBI 數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)獲得SARS-CoV-2 與其他冠狀病毒的核衣殼區(qū)域核苷酸及其氨基酸序列，并分析預(yù)測分子質(zhì)量、等電點(diǎn)及氨基酸組成。利用ClusterX進(jìn)行序列比對分析同源區(qū)域及保守區(qū)。

1.2.2 SARS-CoV-2 核衣殼蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

應(yīng)用EXPASY 服務(wù)器(https://www.expasy.org/resources)上的SOPMA、GOR 等方法分析預(yù)測核衣殼蛋白的二級結(jié)構(gòu)[7-8]，以及PROSCAN預(yù)測蛋白的修飾位點(diǎn)，SignalP預(yù)測蛋白的信號肽。

As the understanding of myocardial protection improved,the use of mildly hypertrophic left ventricles with short ischaemic times were also proposed with the caveat that there were no ECG changes[116].

1.2.3 SARS-CoV-2 核衣殼蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用Swiss-model(https://swissmodel.expasy.org)預(yù)測分析核衣殼蛋白的三級結(jié)構(gòu)[9]。

1.2.4 SARS-CoV-2 核衣殼蛋白跨膜預(yù)測

采用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)預(yù)測驗(yàn)證其是否存在跨膜結(jié)構(gòu)。

1.3 核衣殼蛋白基因序列的克隆

根據(jù)基因設(shè)計(jì)引物，結(jié)合質(zhì)粒載體pET-28 多克隆位點(diǎn)，將BamH I與SacI兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)引入引物。引物：SV2NPF:5′-CGGGATCC ATGTCTGATAATGGACCCCA-3′；SV2NPR:5′-CGAGCTC GAGGCCTGAGTTGAGTCAG CAC-3′。PCR 條件：95 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃ 變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，30個(gè)循環(huán)；然后72 ℃再延伸10 min。

1.4 重組載體轉(zhuǎn)化

將利用高保真酶擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物雙酶切膠回收后連入pET-28載體。轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞, 以獲得重組菌pET-N。在含50 mg/L卡那霉素的LB 培養(yǎng)基上進(jìn)行初步篩選，挑取陽性克隆的菌落測序鑒定。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析

挑取重組菌pET-N，接入含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8時(shí)，取培養(yǎng)物作為誘導(dǎo)前樣品；向其余培養(yǎng)物中加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。收集誘導(dǎo)后的菌體，重懸于PBS 溶液，液氮反復(fù)凍融4 次，再冰上超聲波處理(6 s × 9 s)，直到菌液澄清。4 ℃離心后，取上清液和沉淀分別上樣。SDS-PAGE 電泳檢測重組載體的蛋白表達(dá)。Western Blot轉(zhuǎn)移，以抗His-tag 多克隆抗體作為一抗，羊抗兔IgG 多克隆抗體作為二抗，進(jìn)行Western分析。

1.6 表達(dá)產(chǎn)物的純化

2 結(jié)果與分析

2.1 核衣殼蛋白氨基酸序列分析

SARS-CoV-2 N蛋白的氨基酸有419個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量約為45.6 ku，等電點(diǎn)10.07，是堿性蛋白，且親水性強(qiáng)，疏水性弱。利用國家生物信息中心和NCBI 數(shù)據(jù)庫公開數(shù)據(jù)，選取了10個(gè)全球各地代表性的SARS-CoV-2 N蛋白氨基酸序列，同時(shí)選取了10個(gè)其他代表性冠狀病毒的N蛋白氨基酸序列，進(jìn)行氨基酸序列比對，結(jié)果如圖1所示。分析發(fā)現(xiàn)各地SARS-CoV-2 N蛋白氨基酸序列幾乎沒有變異，但SARS-CoV-2 N蛋白氨基酸序列與其他冠狀病毒的N蛋白間存在一定變異，特別是N-端和C-端。結(jié)合三級結(jié)構(gòu)預(yù)測比對分析發(fā)現(xiàn)N蛋白序列存在2個(gè)保守區(qū)域Region1和Region2，而在這兩個(gè)區(qū)域間的序列，SARS-CoV-2與其他冠狀病毒仍存在較多變異。

序列編號已標(biāo)注在圖中。圖1 不同地區(qū)SARS-CoV-2 N蛋白氨基酸序列與其他β冠狀病毒的同源性比較Figure 1 Comparison of amino acid sequence of SARS-CoV-2 N protein with other β-coronaviruses in different regions

2.2 核衣殼蛋白的修飾位點(diǎn)預(yù)測

翻譯后修飾是蛋白質(zhì)能夠發(fā)揮作用的重要過程，通過PROSCAN預(yù)測SARS-CoV-2 核衣殼蛋白的修飾位點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列中有3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(N-glycosylation site)，1個(gè)cAMP-和 cGMP-依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(cAMP-and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site)，10個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(protein kinase C phosphorylation site)，6個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)(casein kinase II phosphorylation site)，12個(gè)N-?；稽c(diǎn)(N-myristoylation site)，1個(gè)酰胺化位點(diǎn)(amidation site)，見表1。蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)特征序列是[ST]-x-[RK]，C-端的堿性氨基酸殘基R或K可以很大程度上提高磷酸化反應(yīng)的Vmax和Km。同時(shí)，體內(nèi)的蛋白激酶C可以讓氨基酸Thr或Ser磷酸化，從而通過氨基酸的磷酸化調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性[10]。分析發(fā)現(xiàn)所有位點(diǎn)中，共有17個(gè)蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，排在第一位。蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)的存在，支持病毒RNA在轉(zhuǎn)錄過程中需要磷酸化活化。

表1 SARS-CoV-2核衣殼蛋白的修飾位點(diǎn)的預(yù)測

2.3 核衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測

應(yīng)用SOPMA、GOR分析工具預(yù)測SARS-CoV-2 核衣殼蛋白的二級結(jié)構(gòu)(圖 2)。2 種方法對SARS-CoV-2 N蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測有較好的一致性，都顯示其二級結(jié)構(gòu)中的柔性區(qū)域以無規(guī)卷曲為主，少見β-轉(zhuǎn)角(表2)。

SOPMA、GOR 為不同的預(yù)測方法；h：α-螺旋；e：β-片層；c：無規(guī)卷曲；t：β-轉(zhuǎn)角。圖2 SARS-CoV-2 核衣殼蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Figure 2 Prediction of secondary structure of SARS-CoV-2 N protein

表2 SARS-CoV-2 核衣殼蛋白二級結(jié)構(gòu)百分占比

應(yīng)用Swiss-model分析工具預(yù)測SARS-CoV-2 核衣殼蛋白的三級結(jié)構(gòu)。通過比對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)其滿足同源建模條件，模擬三級結(jié)構(gòu)如圖3所示。同時(shí)結(jié)合序列分析，發(fā)現(xiàn)其存在2段同源性高達(dá)90%以上的同源保守區(qū)域(圖1)。

(a)為核衣殼蛋白的三維結(jié)構(gòu)；(b)為引入載體His標(biāo)簽序列的核衣殼蛋白的三維結(jié)構(gòu)。

2.4 核衣殼蛋白跨膜區(qū)預(yù)測

經(jīng)TMHMM預(yù)測分析，SARS-CoV-2 N蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)(圖4)；而SignalP分析發(fā)現(xiàn)其無信號肽序列，其特征符合冠狀病毒核衣殼蛋白的主要特征。

圖4 TMHMM 預(yù)測SARS-CoV-2 核衣殼蛋白分析

2.5 核衣殼蛋白原核表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)

以經(jīng)過大腸桿菌密碼子優(yōu)化的合成核衣殼蛋白基因?yàn)槟０?，利用設(shè)計(jì)的帶BamH I 和SacI酶切位點(diǎn)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并膠回收獲得大量目的片段。將目的片段與pET-28載體分別經(jīng)BamH I 和SacI 雙酶切，然后連接連入載體，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET-N。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，挑選陽性克隆，接入LB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，取樣通過測序驗(yàn)證序列一致性后得到pET-N重組大腸桿菌。

pET-N重組大腸桿菌接入含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8時(shí)，取培養(yǎng)物作為誘導(dǎo)前樣品；然后加入 IPTG至濃度1.0 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h 后，收集菌體，并將樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE 電泳。電泳后，蛋白膠進(jìn)行掃描分析蛋白Marker 和目的蛋白遷移率Mr，并根據(jù) lgMw-Mr 的線性關(guān)系計(jì)算目的蛋白分子質(zhì)量。分析顯示，在分子質(zhì)量約50 ku處出現(xiàn)蛋白條帶，該蛋白與帶His 標(biāo)簽的重組蛋白理論大小相符；同時(shí)目的蛋白表達(dá)量達(dá)菌體總蛋白的15%以上(圖5)。

1:空載體誘導(dǎo)對照；2:誘導(dǎo)重組菌；3:超聲裂解后包涵體；4:超聲裂解后相應(yīng)可溶性蛋白；5:未誘導(dǎo)重組菌對照；6:純化的目的蛋白。

2.6 重組蛋白Western檢測與可溶性分析及純化

在重組表達(dá)設(shè)計(jì)時(shí)，為了便于重組蛋白的純化及鑒定，引入了載體上帶有的His 標(biāo)簽。以兔抗His-tag 多克隆抗體為一抗，羊抗兔IgG抗體為二抗，進(jìn)行核衣殼重組蛋白的Western Blot 分析。結(jié)果顯示，在約50 ku處出現(xiàn)了特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相吻合，表明該重組蛋白為目的蛋白SARS-CoV-2 N蛋白(圖6)。

M:蛋白質(zhì)Maker；1:未誘導(dǎo)；2:誘導(dǎo)重組蛋白。

將誘導(dǎo)后收集的菌體進(jìn)行超聲波破碎，離心后分別取上清液和沉淀作為樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上清液與沉淀中都含有目的條帶，且包涵體中目的蛋白較多。由此表明，所表達(dá)的重組蛋白存在的包涵體可能與誘導(dǎo)條件有關(guān)，適當(dāng)降低IPTG終濃度可以減少目的蛋白包涵體的產(chǎn)生(圖5)。

通過對pET-N重組表達(dá)菌的振蕩培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)處理，收集菌體，并進(jìn)行超聲波破碎及包涵體溶解；然后利用目的蛋白C末端帶有的His標(biāo)簽，進(jìn)行Ni-NTA柱親和層析，收集洗脫峰，得到純化的融合蛋白。12% SDS-PAGE 電泳檢測分析表明，通過Ni-NTA 柱洗脫得到的樣品，經(jīng)復(fù)性、透析除鹽后，可檢測到單一的蛋白電泳條帶，因此獲得了較純的融合蛋白，純度可以達(dá)到90%。通過該重組蛋白，利用醫(yī)療機(jī)構(gòu)已有的ELISA檢測基礎(chǔ)，可開展SARS-CoV-2感染者血清中理論上存在的IgG或IgM抗體檢測，從而輔助補(bǔ)充核酸等檢測的不足。同時(shí)，利用核衣殼蛋白的免疫原性，結(jié)合膠體金等方式，可開發(fā)SARS-CoV-2抗體檢測試劑盒等。

3 討論與結(jié)論

全基因組測序結(jié)果提示，SARS-CoV-2 與SARS CoV 基因組序列同源性較高，說明兩者的結(jié)構(gòu)和功能有一定的相似性[4,11]。本研究通過氨基酸同源比對分析，也發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2與SARS CoV的核衣殼蛋白(N 蛋白)氨基酸序列同源性較高，具有兩段同源性很高的保守區(qū)域，但在N端和C端差異較為明顯(圖1)。

核衣殼蛋白是冠狀病毒中一種與RNA相關(guān)的重要結(jié)構(gòu)蛋白，一般位于病毒的核心，呈長螺旋核殼體，與病毒RNA結(jié)合，參與病毒包裝過程[12]。對不同地區(qū)提交的SARS-CoV-2基因組分析，推測N蛋白具有419 aa，分子質(zhì)量大小約為45.6 ku，位于3′-端。預(yù)測顯示其等電點(diǎn)高達(dá)10.07，是典型的堿性蛋白；同時(shí)其中性親水性最強(qiáng)，氨基酸占比達(dá)44%，疏水性較弱，占比僅33%；與SARS CoV的N蛋白親疏水性有一定差異。SARS-CoV-2 N蛋白序列分析顯示，其177～207的序列存在多個(gè)SRXXX的特征序列，其可能是與RNA結(jié)合的位點(diǎn)[13]，同時(shí)在SARS-CoV N蛋白序列的相應(yīng)位置也發(fā)現(xiàn)具有該SRXXX特征序列；因此，推測177～207序列區(qū)域可能是SARS-CoV-2 N蛋白的RNA結(jié)合區(qū)域的部分。此外，SARS-CoV N蛋白位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)在373～390蛋白序列區(qū)存在核轉(zhuǎn)移信號，但SARS-CoV-2 N蛋白序列在相應(yīng)區(qū)域與SARS-CoV存在多個(gè)氨基酸變異，沒有該核轉(zhuǎn)移信號基序。而SARS-CoV-2 N蛋白序列中存在大量蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)；磷酸化作為一種分子開關(guān)，可以改變RNA轉(zhuǎn)錄與剪接凝聚物(condensates)與蛋白復(fù)合物的親和力；這揭示SARS-CoV-2 N蛋白在病毒RNA的轉(zhuǎn)錄上可能存在開關(guān)功能[14]。

利用全病毒抗原進(jìn)行診斷或試劑盒開發(fā)需要PⅢ級實(shí)驗(yàn)室的支撐，成本高且易造成環(huán)境污染。因此，重組表達(dá)具有免疫原性重組蛋白是更好的選擇。大腸桿菌是一種最廣泛的原核表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)目的蛋白，具有快捷、經(jīng)濟(jì)、高效等諸多優(yōu)點(diǎn)。本研究通過構(gòu)建SARS-CoV-2 N蛋白的重組載體，重組融合蛋白在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，但目的蛋白中的大部分以包涵體形式存在。雖然外源蛋白的表達(dá)容易形成無活性的包涵體是原核表達(dá)系統(tǒng)的不足[15]，但通過適當(dāng)降低溫度和IPTG濃度等可以減少包涵體的形成。而且，以包涵體形式表達(dá)的蛋白也容易純化，同時(shí)不經(jīng)復(fù)性也可作包被抗原來檢測抗體，這在單純的免疫反應(yīng)檢測上更具高效性。而冠狀病毒N蛋白的相關(guān)研究均揭示N蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性[16-17]。在SARS期間，針對其N蛋白與患者體內(nèi)血清的免疫原性研究已表明N蛋白對SARS-CoV診斷試劑的研制具有很高的價(jià)值[16]，這對SARS-CoV-2病毒N蛋白的免疫原性及相關(guān)開發(fā)提供有力參考。雖然目前針對SARS-CoV-2 感染的免疫反應(yīng)研究很少，僅有研究提到COVID-19 患者的N蛋白特異性抗體反應(yīng)[4]，這反映SARS-CoV-2病毒的N蛋白參與了機(jī)體的體液免疫。因此，本研究構(gòu)建的SARS-CoV-2病毒N蛋白的重組表達(dá)蛋白可進(jìn)行COVID-19的臨床檢測；同時(shí)本研究也為SARS-CoV-2 抗原抗體檢測試劑盒開發(fā)以及后續(xù)的SARS-CoV-2 基因組選擇性包裝等研究提供了技術(shù)支撐。