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        血府逐瘀湯對冠心病模型鼠心肌細胞凋亡及相關(guān)蛋白表達的影響

        2021-08-23 02:00:55趙旻張媛剛麗麗
        世界中醫(yī)藥 2021年12期
        關(guān)鍵詞:血府逐瘀湯心肌細胞心電圖

        趙旻 張媛 剛麗麗

        摘要 目的:觀察血府逐瘀湯對冠心病模型鼠的治療作用,探討其對PI3K-AKT信號通路相關(guān)蛋白的影響。方法:將45只SD大鼠隨機分為空白組、模型組及中藥組,每組15只。將模型組及中藥組大鼠冠心病造模,中藥組用2 g/mL血府逐瘀湯藥液灌胃,空白組及模型組用等量的生理鹽水灌胃,3組均連續(xù)灌胃10 d。觀察各組大鼠造模前后ST段變化、心肌細胞凋亡、頸總動脈形態(tài)學(xué)變化、血脂水平、心肌組織PI3K、AKT、p-AKT蛋白水平變化及大鼠腹主動脈血Bax及Bcl-2水平變化。結(jié)果:1)心電圖顯示經(jīng)過冠心病模型制備大鼠心電圖ST段變化高于空白組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中中藥組較模型組改善,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);2)經(jīng)過冠心病模型制備的大鼠血脂代謝均出現(xiàn)紊亂,總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、Bax明顯升高,高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及Bcl-2明顯下降,與空白組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);經(jīng)過中藥干預(yù)后,大鼠血脂水平高于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);3)Tunel檢測顯示經(jīng)過冠心病模型制備大鼠心肌細胞凋亡率高于空白組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),中藥組心肌細胞凋亡率低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);4)HE染色顯示空白組大鼠冠狀動脈管壁結(jié)構(gòu)厚薄均勻,中內(nèi)膜形狀規(guī)則,結(jié)構(gòu)完整;模型組內(nèi)中膜明顯增厚,動脈管壁明顯凹凸不平,管腔狹窄,出現(xiàn)明顯斑塊;中藥組管壁較模型組平滑,斑塊較模型組減小;5)冠心病模型大鼠PI3K、p-AKT、Bcl-2水平低于空白對照組,Bax水平高于空白組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);中藥干預(yù)后,大鼠上述指標(biāo)表達改善效果優(yōu)于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),各組AKT表達水平相近,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論:血府逐瘀湯可明顯逆轉(zhuǎn)冠心病病理改變,其作用機制可能與抑制心肌細胞凋亡有關(guān)。

        關(guān)鍵詞 冠心病模型;血府逐瘀湯;血脂;心肌細胞;凋亡;PI3K-AKT信號通路;冠狀動脈管壁結(jié)構(gòu);血脂代謝

        Effect of Xuefu Zhuyu Decoction on Cardiomyocyte Apoptosis and Expression of Related Proteins in Rats with Coronary Heart Disease

        ZHAO Yi,ZHANG Yuan,GANG Lili

        (Beijing Changping Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine,Beijing 102208,China)

        Abstract Objective:To observe the therapeutic effect of Xuefu Zhuyu Decoction on coronary heart disease(CHD)model rats and explore its effect on PI3K-AKT signaling pathway related proteins.Methods:A total of 45 SD rats were randomly divided into a blank group,a model group and a traditional Chinese medicine(TCM)group,with 15 rats in each group.CHD model was set up for the rats in the model group and the TCM group.The rats in TCM group were given 2 g/mL Xuefu Zhuyu Decoction by gavage.The rats in the blank group and the model group were given the same amount of normal saline by gavage.All the 3 groups were given gavage continuously for 10 days.The changes of ST segment,cardiomyocyte apoptosis,morphology of common carotid artery,blood lipid level,protein levels of PI3K,AKT and p-AKT in myocardial tissue,and the levels of Bax and Bcl-2 in abdominal aorta were observed before and after modeling.Results:1)ECG showed that the ST segment change of rats after CHD model preparation was higher than that of the blank group(P<0.05),and the TCM group was better than that of the model group(P<0.05); 2)the blood lipid metabolism of rats after CHD model preparation was disordered,with a significant increase in TC,TG,LDL-C,Bax and a significant decrease in HDL-C,bcl-2; compared with the blank group,the differences were statistically significant(P<0.05).After the intervention of TCM,the blood lipid level of rats was higher than that of the model group(P<0.05); 3)TUNEL detection showed that the apoptosis rate of cardiomyocytes in the model group was higher than that of the blank group(P<0.05),and the apoptosis rate of cardiomyocytes in the TCM group was lower than that of the model group(P<0.05); 4)HE staining showed that the thickness of the coronary artery wall in the blank group was uniform,the shape of the intima was regular,and the structure was complete; the intima-media in the model group was significantly thickened,the arterial wall was significantly uneven,the lumen was narrow,and obvious plaque appeared; the wall of the TCM group was smoother than that of the model group,and the plaque was smaller than the model group; 5)the levels of PI3K,p-AKT and Bcl-2 in the CHD model rats were lower than those in the blank group.The concentration of Bax in the control group was higher than that in the blank group(P<0.05),and the improvement effect of the above indexes in the TCM group was better than that in the model group(P<0.05).Conclusion:Xuefu Zhuyu Decoction can significantly reverse the pathological changes of coronary heart disease,and its mechanism may be related to the inhibition of cardiomyocyte apoptosis.

        Keywords Coronary heart disease model; Xuefu Zhuyu Decoction; Blood lipid; Cardiomyocyte; Apoptosis; PI3K-AKT signaling pathway; Coronary artery wall structure; Blood lipid metabolism

        中圖分類號:R289.4;R541文獻標(biāo)識碼:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.011

        心血管疾病已然成為危害我國居民生命安全的主要疾病之一,其中冠心病占據(jù)主導(dǎo)位置,是心血管疾病第一死因[1]。歷代醫(yī)賢并無“冠心病”這一病名的記載,根據(jù)其臨床征象將其歸屬于“胸痹”“血瘀”“痹證”等范疇,病位在心,《黃帝內(nèi)經(jīng)》云:“心痹者,脈不通,煩則心下鼓。”由此可見氣血瘀滯、心脈不通是該病的主要病因病機,則行氣活血、化瘀止痛是治則。血府逐瘀湯是經(jīng)典的理血劑,首載于《醫(yī)林改錯》,現(xiàn)代臨床不乏其有效治療高脂血癥、冠心病、腦血栓形成、高血壓的記載[2-5],但其作用機制目前尚無統(tǒng)一定論,基于此,本研究探討血府逐瘀湯有效治療冠心病的可能機制。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 動物 選取45只無特定病原體(Speciifc Pathogen Free,SPF)級SD雄性大鼠,所有大鼠均購自濟南金豐實驗動物有限公司,(許可證號:SCXK(魯)2014 0006)。大鼠體質(zhì)量190~230 g,平均體質(zhì)量(225±5)g,鼠齡5~6個月,平均鼠齡(5.2±0.5)個月。所有大鼠均飼養(yǎng)于室溫(23±0.5)℃、濕度(51±3)%環(huán)境中,自由攝食,12 h/12 h交替光照。3組大鼠在體質(zhì)量、鼠齡、飼養(yǎng)環(huán)境等條件一致。

        1.1.2 藥物 制備血府逐瘀湯藥液:桃仁12 g,紅花、當(dāng)歸、生地黃、牛膝各9 g,川芎、桔梗各4.5 g,赤芍、枳殼、甘草各6 g,柴胡3 g。整方藥材置于全自動煎藥機中浸泡30 min,水煎煮后濾出藥液,再次加水煎煮后濾出藥液,將2次藥液混勻后濃縮為0.88 g/mL的藥液,置于-20 ℃冰箱中備用。所有中藥均由本院藥劑科采購,批號:29302-11。

        1.1.3 試劑與儀器 PI3K一抗抗體(CST公司,美國,貨號:4249T),AKT一抗抗體(CST公司,美國,貨號:46855),p-AKT一抗抗體(CST公司,美國,貨號:40605),Bcl-2一抗抗體(CST公司,美國,貨號:15071T),Bax一抗抗體(CST公司,美國,貨號:14796S)。Morris水迷宮(江蘇賽昂斯公司,型號:SA201),Model68酶標(biāo)儀(Bio-Rad Laboratories,美國,型號:680),全自動煎藥機(濟南玖延機械廠,型號:JY-C2+1)。

        1.2 方法

        1.2.1 分組與模型制備 將所有大鼠隨機分為空白組、模型組及中藥組,每組15只。將所有SD大鼠進行適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,將模型組和中藥組投喂高脂飼料(10%豬油+10%的蔗糖+10%膽固醇+1%膽鹽和69%普通飼料配制成的高脂飼料),3次/d,同時注射70萬U的維生素D3,隔1 d注射1次,共注射4次。

        1.2.2 給藥方法 空白組大鼠投喂普通飼料。3組均連續(xù)投喂8周。隨后中藥組用2 g/mL血府逐瘀湯藥液灌胃,空白組及模型組用等量的0.9%氯化鈉注射液灌胃,3組均連續(xù)灌胃10 d。灌胃結(jié)束后處死所有大鼠。

        1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

        1.2.3.1 各組心電圖檢測 使用水合氯醛(0.1 mL/kg)進行腹腔注射麻醉,待大鼠充分麻醉后連接BL-420E+生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司),對各組大鼠造模前后的心電圖進行記錄,記錄時間持續(xù)30 min,記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖,以J點(QRS波群的終點與ST段交接處)的位移情況判斷心肌是否存在缺血征象,J點上升或下降0.1 mV視為心肌存在缺血。

        1.2.3.2 各組血脂、Bax及Bcl-2水平的變化 接受干預(yù)后,在完成心電圖檢測后隨機選取各組3只大鼠,抽取腹主動脈血后4 ℃ 5 000 r/min條件下離心10 min(離心半徑10 cm),抽吸上清液利用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)對總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、Bax、Bcl-2水平進行測定,具體操作過程嚴(yán)格按照ELISA試劑盒上的說明書進行。

        1.2.3.3 Tunel檢測心肌細胞凋亡情況 接受干預(yù)后,在完成心電圖檢測后隨機選取各組3只大鼠,用事先配制好的多聚甲醛溶液從左心室注入,隨后將

        大鼠心臟取出,對心肌組織進行剪切、修剪成5 mm×5 mm大小的組織塊,再進行脫水、浸蠟、包埋、切片、制片等過程,嚴(yán)格按照Tunel試劑盒中的操作過程,利用激光共聚焦對心肌細胞的凋亡情況進行檢測。其中所有細胞核顯示為藍色熒光,凋亡細胞顯示綠色熒光,每個組織片隨機選取5個視野。細胞凋亡率=(綠色熒光的凋亡細胞數(shù)/Tunel染色的總細胞數(shù))×100%。

        1.2.3.4 HE染色觀察主動脈的病理變化 接受干預(yù)后,在完成心電圖檢測后隨機選取各組3只大鼠,用事先配制好的多聚甲醛溶液從左心室注入,隨后將大鼠主動脈取出,剪裁主動脈長度約1 cm,常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片、制片等過程,嚴(yán)格按照HE染色試劑盒對主動脈進行HE染色,并在光鏡下觀察主動脈的病理變化。

        1.2.3.5 蛋白免疫印跡法(Western Blotting)檢測各組心肌組織PI3K、AKT、p-AKT蛋白水平變化 接受干預(yù)后,在完成心電圖檢測后隨機選取各組3只大鼠,處死后冰上快速取出心臟,加入裂解液充分反應(yīng)30 min,隨后將標(biāo)本置于4 ℃ 5 000 r/min條件下離心10 min(離心半徑10 cm),取出上清液后利用DBA試劑盒測定總蛋白含量,將樣本加入至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中進行蛋白分離,將目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,進行脫脂牛奶封閉,加入相應(yīng)的一抗孵育,將PVDF用PBS清洗后再加入HRP-二抗,置于室溫,經(jīng)60 min后取出再用PBS洗滌3次。最后進行曝光、顯影、定影、拍照和統(tǒng)計分析。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組內(nèi)比較采用配對t檢驗,多組計量資料采用LSD法單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組血脂、Bax及Bcl-2水平變化 經(jīng)過冠心病模型制備的大鼠均出現(xiàn)血脂代謝紊亂,TC、TG、LDL-C、Bax明顯升高,HDL-C、Bcl-2明顯下降,與空白組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);中藥干預(yù)后,大鼠血脂水平明顯改善,與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表1、圖1。

        2.2 各組心電圖檢測結(jié)果比較 心電圖顯示,經(jīng)過冠心病模型制備大鼠心電圖ST段變化超過0.1 mV,與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中中藥組較模型組改善,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

        2.3 各組Tunel檢測結(jié)果比較 Tunel檢測顯示,經(jīng)過冠心病模型制備大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高,與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中,中藥組心肌細胞凋亡率較模型組下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

        2.4 各組主動脈HE染色結(jié)果比較 HE染色顯示,空白組大鼠冠狀動脈管壁結(jié)構(gòu)厚薄均勻,中內(nèi)膜形狀規(guī)則,結(jié)構(gòu)完整;模型組內(nèi)中膜明顯增厚,動脈管壁明顯凹凸不平,管腔狹窄,出現(xiàn)明顯斑塊;中藥組管壁較模型組平滑,斑塊較模型組減小。見圖2。

        2.4 各組大鼠PI3K、p-AKT水平比較 冠心病模型制備的大鼠PI3K、p-AKT水平明顯下降,與空白組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);經(jīng)過中藥干預(yù)后,大鼠PI3K、p-AKT表達明顯改善,與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。各組AKT表達水平相近,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、表4。

        3 討論

        心血管事件在我國發(fā)生率居高不下,冠心病病理上主要是粥樣斑塊形成,導(dǎo)致冠脈管腔狹窄,心肌供血減少,因此糾正冠脈異常增厚,抑制斑塊形成是治療冠心病的關(guān)鍵[6-7]。中醫(yī)并無“冠心病”這一病名的記載,根據(jù)其臨床征象將其歸屬于“胸痹”“血瘀”“痹證”等范疇,病位在心,《黃帝內(nèi)經(jīng)》云:“心痹者,脈不通,煩則心下鼓。”由此可見,氣血瘀滯、心脈不通是該病的主要病因病機,則行氣活血、化瘀止痛是治則。血府逐瘀湯是胸中血瘀證的代表經(jīng)方,方中活血藥與行氣藥相結(jié)合,桃仁、紅花、赤芍可活血化瘀,川芎血中之氣藥,活血同時可行氣,桔梗、枳殼可行氣止痛,與川芎合用加強行氣活血之功效,當(dāng)歸、生地黃可活血涼血,柴胡、牛膝引血下行,升降并用。諸藥合而用之,使得瘀化氣行,共奏行氣活血、化瘀止痛之功[8-11]。我們對各組大鼠進行心電圖檢測,結(jié)果顯示,經(jīng)過冠心病模型制備大鼠心電圖ST段變化超過0.1 mV,經(jīng)過血府逐瘀湯干預(yù)后,大鼠心肌缺血征象明顯改善。與此同時我們利用HE染色顯示空白組大鼠冠狀動脈管壁結(jié)構(gòu)厚薄均勻,中內(nèi)膜形狀規(guī)則,結(jié)構(gòu)完整;模型組內(nèi)中膜明顯增厚,動脈管壁明顯凹凸不平,管腔狹窄,出現(xiàn)明顯斑塊;中藥組管壁較模型組平滑,斑塊較模型組減小。在佐證本研究造模成功的同時進一步佐證了血府逐瘀湯可明顯改善冠狀動脈病理結(jié)構(gòu),增加心肌供血?;钛鰷械幕梆觥焙w的意義較為廣泛,包括血瘀、代謝產(chǎn)物積聚等。尤其對于代謝產(chǎn)物及各種毒性物質(zhì)如血脂等形成的淤積,活血化瘀湯通過對這些物質(zhì)的清除,達到縮小斑塊,改善冠狀動脈結(jié)構(gòu)的效果。

        既往認為心肌缺血導(dǎo)致細胞壞死是心肌細胞死亡的主要形式,但隨著研究的不斷深入,越來越多的證據(jù)顯示細胞凋亡參與了心肌缺血的病理變化過程[12-13]。心肌細胞的缺血缺氧導(dǎo)致了細胞凋亡效應(yīng)增強,而心肌異常凋亡是導(dǎo)致心肌收縮力異常及心室重構(gòu)、心力衰竭的重要原因。此外,心肌細胞屬于可執(zhí)行特定功能的終末分化成熟細胞,再分裂潛能極其微弱,故心肌壞死導(dǎo)致的細胞減少或丟失對心功能具有致命的影響,而細胞凋亡在一定程度屬于部分可逆,因此抗凋亡是治療心肌缺血,改善冠心病遠期預(yù)后的重要靶向。PI3K/AKT信號通路是經(jīng)典抗凋亡通路,PI3K激活后介導(dǎo)第二信使PIP3的生成,PIP3進一步結(jié)合下游的AKT使其核移位,促進AKT的磷酸化而影響其構(gòu)象的改變,啟動細胞凋亡程序[14-15]。Bcl-2與Bax亦是與凋亡密切相關(guān)的因子,二者之間有45%的同源性,作用相反,當(dāng)Bcl-2與Bax形成異二聚體復(fù)合物后有相互抑制作用。有研究人員證實正常生理狀態(tài)下Bax以單體的形式存在于細胞核內(nèi),在受到凋亡信號的刺激后其構(gòu)象發(fā)生變化,寡聚在線粒體膜上,誘發(fā)細胞色素C自線粒體的釋放,誘導(dǎo)細胞的凋亡[16-20]。本研究結(jié)果顯示經(jīng)過冠心病模型制備的大鼠PI3K、p-AKT、Bcl-2水平明顯下降,Bax水平上調(diào),經(jīng)過中藥干預(yù)后,大鼠上述指標(biāo)表達明顯改善。為了進一步驗證,本研究對各組大鼠心肌組織進行Tunnel染色,結(jié)果顯示經(jīng)過冠心病模型制備大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高,其中中藥組心肌細胞凋亡率較模型組下降,這說明血府逐瘀湯對冠心病模型心肌細胞凋亡發(fā)揮抑制效應(yīng)。

        總之,血府逐瘀湯可明顯逆轉(zhuǎn)冠心病病理組織改變,其作用機制可能與抑制心肌細胞凋亡有關(guān),而該過程可能是通過PI3K/AKT信號通路介導(dǎo)的。

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        (2019-09-30收稿 責(zé)任編輯:楊覺雄)

        基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(31874851)

        作者簡介:趙旻(1981.09—),男,研究生,主治醫(yī)師,研究方向:中醫(yī)基礎(chǔ)理論與臨床的關(guān)系,E-mail:teethbrush1981@126.com

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