張賀朋，王兵兵，李憲臻，李蓉

大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116000

異麥芽酮糖（α-D-glucosylpyranosyl-1，6-D-fru-ctofranose）具有水解性緩慢且不易被微生物降解等生理功能［1］，作為甜味劑已被廣泛應(yīng)用［2-5］，但自然界存在極少。用蔗糖異構(gòu)酶（EC5.4.99.11）轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖是目前工業(yè)化生產(chǎn)的主要方法。由于蔗糖異構(gòu)酶在催化蔗糖轉(zhuǎn)化的過(guò)程中始終伴隨著副產(chǎn)物單糖的生成，增加了后續(xù)產(chǎn)物分離時(shí)的難度并提高了成本，對(duì)生產(chǎn)質(zhì)量控制不利［6-9］。

枯草芽孢桿菌為非致病性菌，具有不分泌內(nèi)、外毒素的特性，常作為食品工業(yè)的生產(chǎn)宿主。該菌為革蘭陽(yáng)性，細(xì)胞僅有一層膜結(jié)構(gòu)，蛋白可分泌到胞外，且外分泌蛋白能力相對(duì)較強(qiáng)。對(duì)枯草芽抱桿菌分泌機(jī)制己深入研究多年，具有良好的發(fā)酵基礎(chǔ)，因此，該菌在高產(chǎn)、經(jīng)濟(jì)的重組蛋白分泌生產(chǎn)中具有先天的優(yōu)勢(shì)［10-12］。

本研究以來(lái)源于克雷伯菌LX3（KlebsiellaspLX3）的蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ基因構(gòu)建在枯草芽孢桿菌B.subtilis WB800中重組表達(dá)菌株，基于微生物以葡萄糖和果糖等單糖為速效碳源在培養(yǎng)過(guò)程中優(yōu)先利用的原理，探索重組菌株在含蔗糖的培養(yǎng)液中發(fā)酵產(chǎn)酶催化底物蔗糖轉(zhuǎn)化時(shí)減少副產(chǎn)物單糖的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 菌株及載體 感受態(tài)E.coli DH10B由中科院大連化物所趙宗保研究員課題組惠贈(zèng)；枯草芽孢桿菌B.subtilis WB800及載體pHT43購(gòu)自武漢淼靈生物科技有限公司；pET28a-PalⅠ質(zhì)粒由大連工業(yè)大學(xué)生物催化技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.2 主要試劑及儀器 限制性?xún)?nèi)切酶、DNA連接酶、Ex Taq DNA聚合酶、primer STARDNA聚合酶、DpnⅠ酶及DNA片段純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；0.22μm濾膜購(gòu)自德國(guó)默克密理博公司；IPTG及LB培養(yǎng)基購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；Agilent 1260高效液相色譜購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；高效液相色譜柱SPHERISORB NH2（4.6 mm×250 mm，80?）購(gòu)自英國(guó)Waters公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)來(lái)源于Klebsiella spLX3的蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ基因序列（NCBI：AY040843.1）設(shè)計(jì)RF-克隆引物［13］，上游引物43-Primer-F：5′-GTTTGCCGATTACAAAAACATCAGCCATGTCTTTTGTTACG-3′；下游引物43-Primer-R：5′-CGCTCATTAGGCGGGCTGCTTACCGCAGCTTATACAC-3′。引物由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 采用PCR法從pET28a-PalⅠ質(zhì)粒克隆獲得含有同源臂的目的片段PalⅠ，再通過(guò)同源臂擴(kuò)增連接至pHT43載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pHT43-PalⅠ。具體步驟如下：提取pET28a-PalⅠ質(zhì)粒，以其為模板，進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系為：pET28-a（+）-PalⅠ2μL，43-Primer-F 4μL，43-Primer-R 4μL，dNTPMix 8μL，5×PS buffer 20μL，Primer STAR DNA polymerase 1μL，ddH2O 62μL。反應(yīng)條件為：95℃5 min；94℃30 s，55℃1 min，72℃3 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收后，進(jìn)行RF-克隆第2步［13］，PCR反應(yīng)體系為：引物（RF克隆第1輪回收產(chǎn)物）2.5μL，pHT43 0.5μL，dNTPMix 2μL，5×PSbuffer 5μL，Primer STARDNA聚合酶0.25μL，ddH2O 15μL。反應(yīng)條件為：95℃5 min；94℃50 s，65℃50 s，72℃8 min，共15個(gè)循環(huán)；94℃50 s，55℃50 s，72℃8 min，72℃20 min，共20個(gè)循環(huán)；4℃結(jié)束。PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnⅠ酶消化后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH10B中，37℃培養(yǎng)16 h；提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒送吉林省庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pHT43-PalⅠ。

1.5 重組菌株p H T43-PalⅠ／B.subtilis WB800的構(gòu)建 將重組質(zhì)粒pHT43-PalⅠ電轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌B.subtilis WB800中，篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定正確后接種種子液進(jìn)行保存。

1.6 重組酶PalⅠ的異源表達(dá)及其催化活性分析將重組菌pHT43-PalⅠ／B.subtilis WB800（試驗(yàn)組）進(jìn)行活化，挑取單菌落制備種子液。按1∶100接種于LB培養(yǎng)基中；37℃擴(kuò)增培養(yǎng)，用終濃度為0.5 mmol／L IPTG 16℃分別誘導(dǎo)表達(dá)10、24、36及46 h，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行10%SDS-PAGE分析，同時(shí)以pHT43／B.subtilis WB800為陰性對(duì)照組。取100μL粗酶液，加入含終濃度2%蔗糖的50 mmol／L（pH 6.0）磷酸鹽，反應(yīng)體系為1 mL，30℃，120 r／min搖床反應(yīng)10 h；15 428×g離心10 min，取上清進(jìn)行HPLC分析，色譜條件：流動(dòng)相乙腈∶水=90∶10，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為10μL，每個(gè)樣品上樣3次。

1.7 重組菌在蔗糖培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化的應(yīng)用 配制含2%、4%、8%及12%蔗糖的LB培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)重組菌pHT43-PalⅠ／B.subtilis WB800，30℃誘導(dǎo)表達(dá)24 h及4%蔗糖濃度再誘導(dǎo)48 h，取發(fā)酵液，15 428×g離心10 min；除菌并用0.22μm濾膜去除蛋白，HPLC分析發(fā)酵液中的產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒p H T43-PalⅠ的鑒定 菌落PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)1 797 bp的目的基因片段，大小與預(yù)期一致，見(jiàn)圖1。經(jīng)測(cè)序鑒定基因序列無(wú)突變，表明pHT43-PalⅠ構(gòu)建正確且已導(dǎo)入E.coli DH10B中。

圖1 重組菌落pHT43-PalⅠ／E.coli DH10B PCR電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of recombinant colony pHT43-PalⅠ／E.coli DH10B

2.2 重組菌株p H T43-PalⅠ／B.subtilis WB800的鑒定 菌落PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)在1 500～2 250 bp之間擴(kuò)增出1條目的條帶，大小與基因片段PalⅠ相符，見(jiàn)圖2。表明成功獲得重組菌株pHT43-PalⅠ／B.subtilis WB800。

圖2 重組菌株pHT43-PalⅠ／B.subtilis WB800 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretic profile of PCR product of recombinant bacterial strain pHT43-PalⅠ／B.subtilis WB800

2.3 重組酶PalⅠ的鑒定 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)10%SDS-PAGE分析，試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組在相對(duì)分子質(zhì)量66 400處可見(jiàn)1條差異條帶，大小與目的蛋白重組酶PalⅠ相符；誘導(dǎo)時(shí)間從10 h延長(zhǎng)至46 h，差異條帶顏色逐漸增加。見(jiàn)圖3。表明蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ在B.subtilis WB800中成功異源重組表達(dá)。

圖3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAEG profile of expressed PalⅠ

2.4 重組酶PalⅠ轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析 發(fā)酵液經(jīng)HPLC分析，底物蔗糖轉(zhuǎn)化為二糖產(chǎn)物異麥芽酮糖及海藻酮糖，其中以異麥芽酮糖為主，并伴隨單糖副產(chǎn)物葡萄糖及果糖的生成，見(jiàn)圖4。

圖4 重組酶PalⅠ發(fā)酵液與2%蔗糖反應(yīng)10 h的色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of fermentation borth of PalⅠreacted with 2%sucrose for 10 h

2.5 重組菌p H T43-PalⅠ／B.subtilis WB800發(fā)酵轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析 結(jié)果顯示，在不同蔗糖濃度的LB培養(yǎng)基中，發(fā)酵液中重組酶PalⅠ可催化蔗糖轉(zhuǎn)化為二糖產(chǎn)物，且以異麥芽酮糖為主產(chǎn)物；在6.8 min保留時(shí)間無(wú)明顯色譜峰，表明副產(chǎn)物單糖作為速效碳源基本已被菌消耗；在含4%蔗糖的LB培養(yǎng)基中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，海藻酮糖含量基本不變，而異麥芽酮含量降低38%，表明重組菌并不能利用海藻酮糖，枯草芽孢桿菌能在蔗糖被完全轉(zhuǎn)化后，可再水解異麥芽酮糖進(jìn)行生長(zhǎng)。見(jiàn)圖5。在含12%蔗糖的培養(yǎng)基中，發(fā)酵表達(dá)蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ過(guò)程中同時(shí)催化蔗糖轉(zhuǎn)化，利用重組菌消耗副產(chǎn)物單糖，24 h后產(chǎn)物二糖與單糖副產(chǎn)物之比最大可達(dá)92∶1，見(jiàn)圖6。

圖5 pHT43-PalⅠ／B.subtilis WB800對(duì)培養(yǎng)基中不同濃度的蔗糖轉(zhuǎn)化比較Fig.5 Conversion of sucrose at different concentrations by pHT43-PalⅠ／B.subtilis WB800

圖6 不同培養(yǎng)基中二糖主產(chǎn)物與單糖副產(chǎn)物的比值Fig.6 Ratio of disaccharide main product to monosaccharide by-product in different media

3 討論

將蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ基因?qū)隑.subtilis WB800后，異源重組外分泌菌株pHT43-PalⅠ／B.subtilis WB800可在發(fā)酵過(guò)程中將重組酶PalⅠ分泌表達(dá)至培養(yǎng)基內(nèi)。將底物蔗糖添加至培養(yǎng)基中，可在表達(dá)重組酶PalⅠ同時(shí)催化蔗糖轉(zhuǎn)化產(chǎn)物二糖，同時(shí)基于微生物會(huì)優(yōu)先使用葡萄糖作為速效碳源的原理，可利用重組菌來(lái)消耗反應(yīng)中產(chǎn)生的副產(chǎn)物單糖?；谝陨峡紤]，在含不同蔗糖濃度的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)試驗(yàn)組pHT43-PalⅠ／B.subtilis WB800和陰性對(duì)照組pHT43／B.subtilis WB800，采用HPLC對(duì)發(fā)酵液中的各種糖組分分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物二糖異麥芽酮糖與海藻酮糖產(chǎn)量比、產(chǎn)物二糖與產(chǎn)物單糖的產(chǎn)量比的變化主要與培養(yǎng)基中蔗糖濃度和發(fā)酵時(shí)間有關(guān)。在含12%蔗糖的培養(yǎng)基中發(fā)酵表達(dá)蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ過(guò)程中同時(shí)催化蔗糖轉(zhuǎn)化并消耗副產(chǎn)物單糖，24 h后產(chǎn)物二糖與單糖副產(chǎn)物的最大比值可達(dá)92∶1。

本研究成功構(gòu)建了蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ在枯草芽孢桿菌中表達(dá)菌株，且可利用重組菌在含有蔗糖培養(yǎng)基中直接發(fā)酵催化蔗糖的轉(zhuǎn)化，同時(shí)利用并消耗副產(chǎn)物單糖，降低反應(yīng)中副產(chǎn)物的含量。