龍馨妍， 何澤詔， 彭 鵬， 李 濤， 張慧慧， 袁仕善， 張 霞△

（湖南師范大學醫(yī)學院 1免疫學教研室，2生物化學教研室，湖南長沙410013）

程序性細胞死亡蛋白4（programmed cell death protein 4，PDCD4）是 1995 年 Shibahara 等［1］在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種與細胞凋亡相關的基因，隨后在其他動物和人類中被鑒定出來［2］。人類PDCD4基因定位于染色體10q24 處，編碼區(qū)約1.4 kb，編碼469 個氨基酸。PDCD4 蛋白的氨基側(cè)有2 個重要的α-螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)“MA3”，PDCD4 通過該結(jié)構(gòu)域與翻譯起始因子eIF4A分子結(jié)合，抑制核糖體復合物的形成和蛋白質(zhì)的翻譯。此外，PDCD4 還可以直接與mRNA 結(jié)合以抑制其翻譯［3］。PDCD4 作為一種新的腫瘤抑制因子，在很多實體腫瘤中，如乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌和肺癌中表現(xiàn)為下調(diào)甚至缺失，常預示著腫瘤的惡性程度及不良預后，其發(fā)揮抑癌作用主要是通過抑制一組與腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移有關的基因的翻譯而實現(xiàn)的，而且其在不同組織類型中發(fā)揮的作用不盡相同［4-5］。慢性粒細胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）是造血系統(tǒng)腫瘤，其主要特征是9 號染色體上ABL基因和22 號染色體上的BCR基因相互融合形成了BCR-ABL融合基因進而表達BCRABL 蛋白，很多學者都致力于靶向BCR-ABL 及其相關通路的研究［6］。我們前期研究顯示PDCD4 在慢性粒細胞白血病中表達顯著下調(diào)，而且PDCD4 的表達和BCR/ABL 表達成負相關，PDCD4 的表達上調(diào)伴隨著細胞增殖抑制［7］，另有研究表明慢性淋巴細胞白血病中也存在PDCD4 的表達下調(diào)［8］，這些結(jié)果都提示我們PDCD4 除了在實體腫瘤中發(fā)揮作用，同時也能影響血液腫瘤，然而PDCD4 在血液腫瘤中具體的作用和機制仍不清楚。

本研究通過在人慢性粒細胞白血病細胞系K562 中過表達 PDCD4，研究 PDCD4 對 K562 細胞的活力、周期和凋亡的作用，并進一步通過轉(zhuǎn)錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）檢 測 確 定 PDCD4 在K562細胞中調(diào)控的下游基因，為深入研究PDCD4對K562作用的分子機制提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 細胞和實驗主要材料

人慢性粒細胞白血病細胞系K562 由山東大學附屬第二醫(yī)院血液病實驗室饋贈，PDCD4 過表達慢病毒和對照慢病毒［均攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）］購自上海吉凱基因。RPMI -1640 培養(yǎng)液和胎牛血清（Gibco）；總 RNA 提取試劑Trizol（Invitrogen）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR 檢測試劑盒（Gene Copoeia）；CCK-8 試劑盒（Biosharp）；細胞周期檢測試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；彩虹蛋白Marker 和BCA 蛋白檢測試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；PDCD4 單抗和 β-actin 單抗（Cell Signaling Technology）。

2 方法

2.1 K562細胞培養(yǎng) K562細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，并將其置于37 ℃、5%CO2的孵育箱中，根據(jù)細胞培養(yǎng)情況進行換液及傳代處理，取處于生長對數(shù)期的細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 構(gòu)建穩(wěn)定的過表達細胞系 取對數(shù)生長的K562細胞接種于24孔板，每孔5×104個細胞，分別感染PDCD4 過表達慢病毒和空載體慢病毒，MOI 設置為30，72 h后用熒光顯微鏡確定感染效率，加入終濃度為2.5 mg/L 的嘌呤霉素（purornycin，Puro）進行篩選 5～7 d，得 到陽性克隆 PDCD4 過表達（K562-PDCD4）組和空載體對照（K562-MOCK）組并進行擴增培養(yǎng)。

2.3 RT-qPCR 收集 K562、K562-MOCK 和 K562-PDCD4 3 組細胞各 1×106個，采用 Trizol 一步法抽提細胞總RNA，用核酸蛋白定量儀測定RNA 純度和濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應，采用SYBR Green 實時熒光定量PCR 方法檢測目的基因mRNA 的表達。引物由Invitrogen 設計合成，詳細信息見表1。反應體系為20 μL，反應條件為：95 ℃10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，共計 40 個循環(huán)。每個樣本設3 個復孔，以2-ΔΔCt表示目的基因在實驗組與對照組中表達的倍比關系。

表1 RT-qPCR引物序列信息Table 1.The sequence of primers for RT-qPCR

2.4 Western blot 收集上述3 組細胞各1×106個，加入200 μL RIPA細胞裂解液置于冰上裂解，13 400×g離心5 min，收集上清液，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品加入上樣緩沖液，煮沸 10 min 進行變性，12% SDS-PAGE 分離后，采用濕轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜；用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉1 h；再將膜分別浸入1∶2 000 稀釋的兔抗人PDCD4 單克隆抗體和1∶2 000 稀釋的兔抗人β-actin多克隆抗體中，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min；最后在1∶2 000 稀釋的羊抗兔Ⅱ抗中室溫孵育 1 h；TBST 洗 3 次，每次 10 min；滴加 ECL 化學發(fā)光液顯影。

2.5 CCK-8 實驗 取上述各組處于對數(shù)生長期的細胞制成單細胞懸液，以每孔5 000個的密度接種于96 孔板中，共設4 個時點（0、24、48 和72 h，細胞接種當天為0 h），每個時點設3 個復孔。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至各時點后，加入CCK-8 溶液（每孔10 μL）繼續(xù)培養(yǎng)，2 h后用酶標儀檢測450 nm處吸光度（A450）。根據(jù)各組細胞相對活力，繪制細胞生長曲線。

2.6 細胞周期 取上述各組對數(shù)生長期細胞1×106個，PBS 洗滌 1 遍，棄掉上清后，加入 500 μL 預冷的70% 乙醇，4 ℃固定過夜，PBS 洗滌1 遍，加入500 μL PI/RNase A 工作液（PI∶RNase A=9∶1），室溫避光30～60 min，細胞懸液用200 目篩網(wǎng)過濾一次，使用流式細胞儀記錄激發(fā)波長488 nm 處紅色熒光，檢測細胞DNA含量。應用FlowJo軟件分析細胞周期數(shù)據(jù)。

2.7 細胞凋亡 取上述各組處于對數(shù)生長期的細胞，將細胞密度調(diào)至5×108/L接種于6孔板中，各孔加入終濃度為2.5 μmol/L 阿糖胞苷（cytosine arabinoside，Ara-C）預處理48 h 后，離心收集各組細胞，PBS洗滌2遍，棄掉上清，加入500 μL的Binding Buffer 重懸細胞，加入5μL Annexin V-APC 和5μL 7-AAD 染液混勻；室溫、避光、反應5～15 min，進行流式細胞儀的觀察和檢測。應用FlowJo 軟件分析細胞凋亡數(shù)據(jù)。

2.8 RNA-seq 實 驗 將 K562-MOCK 組 和 K562-PDCD4組的細胞樣本送到深圳華大基因股份有限公司的基因組服務中心進行分析，用Trizol一步法提取兩組細胞中的總RNA，構(gòu)建質(zhì)量合格的DNA 文庫后，使用BGISEQ 平臺進行測序。每組檢測3 個樣本，取3 個樣本數(shù)據(jù)的平均值對結(jié)果進行分析。為了驗證RNA-seq的準確性，隨機挑選6個差異基因進行RT-qPCR檢測以驗證基因芯片結(jié)果。引物的序列信息見表1。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計分析。所有的實驗均采用獨立重復3 次的數(shù)據(jù)，用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，3 組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)的比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 穩(wěn)定過表達PDCD4 的K562 細胞系的構(gòu)建及鑒定

慢病毒感染K562 細胞72 h 后，在熒光顯微鏡下觀察顯示，K562-PDCD4 組和 K562-MOCK 組均可見綠色熒光，而空白對照K562組未見熒光（圖1A）。篩選得到穩(wěn)定表達細胞系后，流式細胞儀檢測到病毒表達蛋白GFP 的陽性率達到95%以上（圖1B）；RT-qPCR 和 Western blot 結(jié) 果 顯 示 ，K562-PDCD4 組PDCD4 mRNA 水平和蛋白水平均顯著升高（圖1C、1D）。上述實驗結(jié)果證明成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達PDCD4 的K562 細胞系，可用于下一步的細胞功能分析。

Figure 1.Expression of PDCD4 in the K562 cells infected by lentivirus.A：GFP positive cells which meant successful infection of the lentivirus were observed under fluorescence microscope（scale bar=50 μm）.Almost all the cells of K562-MOCK and K562-PDCD4 groups showed green fluorescence，while no fluorescence was observed in K562 group.B：the proportion of GFP positive cells detected by flow cytometry（K562：0.23%；K562-MOCK：98.8%，K562-PDCD4：98.2%）.C：the mRNA level of PDCD4 detected by RT-qPCR；D：the protein level of PDCD4 detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs K562-MOCK group.圖1 慢病毒感染的K562細胞中PDCD4的表達

2 過表達PDCD4對K562細胞活力的影響

CCK-8 實驗檢測過表達 PDCD4 后 K562 細胞的活力變化情況。結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后，K562、K562-MOCK 和K562-PDCD4 3 組細胞的活力沒有明顯差異，但在培養(yǎng) 48 h 和 72 h 后，K562-PDCD4 組的細胞活力比K562 組和K562-MOCK 組明顯減若，有顯著差異（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.The growth curves of the K562 cells after over-expression of PDCD4.CCK-8 assay was used to detect the viability of cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs K562-MOCK group.圖2 過表達PDCD4后K562細胞生長曲線圖

3 過表達PDCD4對K562細胞周期的影響

用PI 對細胞進行染色，運用流式細胞儀檢測過表達PDCD4 后K562 細胞周期的變化情況。FlowJo軟件分析結(jié)果顯示，與K562 組和K562-MOCK 組相比，K562-PDCD4 組 S 期的細胞比例下降、G2/M 期細胞比例增加（P＜0.05），見圖3。

Figure 3.Effects of PDCD4 over-expression on cell cycle of K562 cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs K562-MOCK group.圖3 過表達PDCD4對K562細胞周期的影響

4 過表達PDCD4對K562細胞凋亡的影響

采用Ara-C 誘導細胞凋亡，Annexin V-APC/7-AAD 染色檢測過表達PDCD4 后K562 細胞凋亡的變化情況。結(jié)果顯示，與K562 組和K562-MOCK 組相比，K562-PDCD4 組細胞的早期凋亡率沒有明顯變化，但是總凋亡率增加且有顯著差異（P＜0.05），見圖4。

Figure 4.Effects of PDCD4 over-expression on apoptosis of Ara-C-stimulated K562 cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs K562-MOCK+Arac-C group.圖4 過表達PDCD4對K562細胞凋亡的影響

5 PDCD4過表達對K562細胞基因表達譜的影響

收集K562-MOCK和K562-PDCD4兩組細胞的總RNA，經(jīng)鑒定質(zhì)量合格后進行RNA 測序分析，每組選取3 個樣本取平均值，進行差異表達基因篩選。結(jié)果顯示，與K562-MOCK 組比較，K562-PDCD4組有394 種基因有明顯差異表達，其中16 種基因的水平上調(diào)，378 種基因的水平下調(diào)。根據(jù)KEGG pathway富集分析找出差異表達基因中富集的信號通路，表明這些基因功能涉及多個方面，包括新陳代謝、細胞周期調(diào)控、細胞信號轉(zhuǎn)導、凋亡和細胞自噬等，見圖5、6 和表 2。選取其中 6 個基因進行 RT-qPCR 驗證，其中 2 個表達上調(diào)的基因：TENM4和MAP3K7CL，以及 4 個表達下調(diào)的基因：PIK3CA、TRPM7、CCDC186和RANBP3L。結(jié)果顯示，這6 個差異基因的相對表達量與測序結(jié)果趨勢一致，驗證了RNA-seq 結(jié)果的可靠性，見圖7。

Figure 5.Cluster map of the differentially expressed genes.The horizontal axis is the log2（expression value + 1）of the sample，and the vertical axis is the gene.The redder，the higher expression，and the bluer，the lower expression. n=3.圖5 差異基因表達聚類圖

Figure 6.KEGG pathway enrichment histogram of the differentially expressed genes.The horizontal axis：the blue represents the -lg（P value）of the sample；the orange represents the number of candidate gene.The vertical axis is the signal pathway.圖6 差異基因KEGG pathway富集柱狀圖

表2 部分上調(diào)或下調(diào)基因Table 2.Partially up-regulated or down-regulated genes

Figure 7.The mRNA levels of differentially expressed genes.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 group vs K562-MOCK group.圖7 RT-qPCR驗證RNA-seq測序結(jié)果

討 論

PDCD4 是一種新的腫瘤抑制因子，具有抑制細胞生長、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和誘導細胞凋亡等功能，在多種實體腫瘤中表達下調(diào)，但PDCD4 在血液腫瘤中的研究報道較少。我們在前期研究中證實PDCD4在慢性粒細胞白血病中表達降低，且和融合基因BCR/ABL的表達呈負相關，提示 PDCD4 在 CML 中發(fā)揮作用。本研究通過慢病毒表達系統(tǒng)在人類慢性粒細胞白血病細胞系K562 細胞中過表達PDCD4，顯示PDCD4 可以明顯抑制其細胞活力，誘導細胞周期阻滯并促進細胞凋亡，并且通過RNA-seq 分析了差異表達基因，為進一步研究其作用機制提供了依據(jù)。

PDCD4在腫瘤中的表達普遍降低并且受多方面因素的調(diào)控，其中miR-21 可以獨立調(diào)控PDCD4 的表達［9-10］。目前，在多種腫瘤中證實miR-21可以通過下調(diào)PDCD4 的表達促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)化，影響腫瘤細胞的增殖和侵襲［11-12］。在血液腫瘤中也有研究表明反義抑制miR-21 上調(diào)PDCD4 水平可有助于CML 的治療［13］，并且采用miR-21 拮抗劑可以通過誘導凋亡增強K562 細胞對三氧化二砷（一種用作治療白血病的中藥）的敏感性［14］。這些結(jié)果都提示我們PDCD4作為一個抑癌基因，不僅僅對實體腫瘤有抑制作用，對血液腫瘤同樣也發(fā)揮作用。最近有報道稱轉(zhuǎn)錄因子STAT5 的磷酸化，可以直接或間接由BCR-ABL1 和FLT3-ITD（AML）驅(qū)動，從而使miR-21 的表達上調(diào)，表明酪氨酸激酶-STAT5-miR-21-PDCD4 調(diào)節(jié)軸在CML 和 AML 的進展和惡性增殖中發(fā)揮重要作用［15］。然而，PDCD4 對CML 存在哪些作用，目前未見有直接的研究報道。因此，我們在CML 代表性細胞系K562 中過表達 PDCD4，研究 PDCD4 對 K562 細胞的作用及其可能的機制。

首先，我們通過CCK-8 實驗證明PDCD4 可以抑制K562 細胞的活力，這個結(jié)果和實體腫瘤中的研究結(jié)果是一致的，在很多腫瘤實驗中都顯示了PDCD4可以抑制腫瘤細胞增殖，包括乳腺癌［16］，鼻咽癌［17］和膠質(zhì)瘤［18］等；其次，我們顯示 PDCD4 可以改變 K562的細胞周期，表現(xiàn)為G2/M 期阻滯。這個結(jié)果和其他實體腫瘤的研究有些不同，比如在非小細胞肺癌中，PDCD4 通過抑制PI3K/AKT 通路及其下游的細胞周期蛋白 CCND1 和激酶 CDK4 從而誘導 G1期阻滯［19］；而我們之前的研究顯示PDCD4 對卵巢癌細胞的周期調(diào)控則是誘導S 期阻滯［20］。在本研究中，我們證實PDCD4 可以誘導K562 細胞的G2/M 期阻滯，也有研究表明異紫堇定堿可通過PDCD4 誘導G2期阻滯從而誘導肝癌細胞凋亡［21］的，但是具體的作用機制不清楚。最近有研究表明PDCD4 可在端粒酶永生化的人類上皮細胞系中抑制p53基因活性，阻止p53

激活 G1/S 檢查點［22］。在肝癌細胞中PDCD4敲低會抑制細胞生長以及誘導視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，Rb）磷酸化，這個過程是通過下調(diào)Rb自身、下調(diào)磷酸化Rb的細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）的表達以及上調(diào)CDK 抑制劑 p21 的表達來完成的［23］。因此，我們推論PDCD4 很可能是通過直接或間接作用于細胞周期蛋白或激酶來發(fā)揮作用的，相關的靶點還需要進一步確證。

由于很多抑癌基因可以使細胞周期阻滯在G2/M期并促進細胞凋亡［24］，因此，我們進一步檢測了PDCD4 對K562 細胞凋亡的影響，結(jié)果表明PDCD4可以促進阿糖胞苷誘導的細胞凋亡。PDCD4是在細胞凋亡時發(fā)現(xiàn)的表達上調(diào)基因，因此有很多關于PDCD4 促進細胞凋亡的研究。已有研究表明PDCD4蛋白在胞核內(nèi)積累，激活Bcl-2蛋白家族的促凋亡成員Bax 和caspases-8-9 和-3，誘導肝癌細胞凋亡［25］。我們也在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)PDCD4 可以促進順鉑誘導的細胞凋亡，主要是通過抑制凋亡抑制因子c-FLIP 從而增強 caspases-8 的活性來實現(xiàn)的［26］。然而，最近有研究指出PDCD4 通過抑制proCASP3mRNA 表達而在 HeLa 細胞中起抗凋亡作用［27］，這表明PDCD4 的促凋亡作用僅局限于某些細胞類型。很早就有學者提出，PDCD4 的作用具有細胞特異性［28］，在不同的細胞類型中，PDCD4發(fā)揮的作用不盡相同，甚至還出現(xiàn)相反的情況，因此我們研究PDCD4在K562 細胞系中的作用機制就更加重要，血液腫瘤和實體腫瘤細胞的惡性行為存在一定的差異，基因表達譜也不同。

在本研究中，我們通過轉(zhuǎn)錄組測序分析K562-PDCD4和對照K562-MOCK 兩種細胞基因表達差異，初步篩選PDCD4在K562細胞中下游潛在的靶基因，為后續(xù)的分子機制研究奠定基礎。我們的結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達PDCD4 的K562 細胞有394 種差異表達基因，其中表達上調(diào)的有16 種，表達下調(diào)的有378 種。這可能和PDCD4 的作用機制有關，目前認為PDCD4 是個翻譯抑制因子，其主要通過抑制基因的翻譯來調(diào)控基因的表達從而在不同的細胞種類中發(fā)揮不同的作用，因此下調(diào)基因占大部分。我們進一步分析顯示這些差異表達的基因與新陳代謝、細胞周期調(diào)控、細胞信號轉(zhuǎn)導、凋亡和細胞自噬等相關，提示PDCD4在K562細胞中可能通過參與調(diào)節(jié)這些信號轉(zhuǎn)導通路而發(fā)揮作用。除了細胞周期和凋亡，這些基因中很多和自噬相關，而我們前期實體腫瘤細胞實驗也顯示PDCD4 可以通過直接抑制自噬相關蛋白ATG5 的翻譯從而發(fā)揮很強的自噬抑制作用［29］。新近研究顯示免疫反應、造血干細胞分化和腫瘤細胞的耐藥性都和自噬相關。在血液腫瘤中，調(diào)節(jié)自噬可能成為一個在靶向治療領域有前途的研究方向［30］。因此，PDCD4 是否能調(diào)節(jié) K562 細胞的自噬是我們將要解決的一個問題。此外，基因測序還提示了很多PDCD4 調(diào)控的下游信號轉(zhuǎn)導通路，為進一步的機制研究提供了方向。

綜上所述，本研究初步探討了PDCD4對K562細胞的作用，在后續(xù)工作中，我們將根據(jù)測序的結(jié)果繼續(xù)深入研究PDCD4 在K562 細胞中具體的分子作用機制，或進一步進行體內(nèi)實驗以更系統(tǒng)的闡述PDCD4 在髓系白血病CML 中的作用，期望找到更好的靶點，為CML 的發(fā)生發(fā)展以及防治措施的研發(fā)提供初步的參考資料。