王永強(qiáng) 彭際奎 姜洪偉 王舉

內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科，呼和浩特 010017

胃癌是嚴(yán)重威脅人類健康的消化道惡性腫瘤之一，我國胃癌發(fā)病率高，在男性、女性分別居惡性腫瘤第2、第3位，病死率均居惡性腫瘤第2位［1］。早期胃癌，手術(shù)治療能有效控制疾病的惡化。然而，胃癌發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，就診時(shí)大多屬晚期，已出現(xiàn)腹膜、肝、肺等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)機(jī)會。另外，雖然化療聯(lián)合靶向治療是晚期胃癌或胃癌術(shù)后的主要手段，但受耐藥的影響，其療效有限［2-3］。數(shù)據(jù)顯示，胃癌5年生存率僅為31.5%［4］。因此，探索胃癌發(fā)生發(fā)展新機(jī)制以及制定治療新策略迫在眉睫。近年來，胃癌腫瘤微環(huán)境免疫抑制狀態(tài)以及胃癌對免疫治療響應(yīng)的研究備受關(guān)注。

目前認(rèn)為，免疫微環(huán)境影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥［5-6］，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞可用來評估腫瘤患者復(fù)發(fā)及死亡風(fēng)險(xiǎn)［7-8］。研究表明微衛(wèi)星不穩(wěn)定的胃癌患者接受抗PD-1/PD-L1單抗的免疫治療可獲得明顯的生存受益［9-10］。另外，對于腫瘤微環(huán)境中效應(yīng)T細(xì)胞浸潤增多、腫瘤突變負(fù)荷高的患者，臨床預(yù)后也更佳［11-12］。然而，受限于免疫細(xì)胞標(biāo)志物，傳統(tǒng)檢測免疫浸潤的方法，例如流式細(xì)胞計(jì)數(shù)、免疫組化法等，并不能全面反應(yīng)免疫細(xì)胞的浸潤情況。利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過單樣本基因集富集分析，可充分展示腫瘤患者28種免疫細(xì)胞浸潤特征，從而指導(dǎo)臨床實(shí)踐。對于胃癌，目前還沒有基于免疫基因數(shù)據(jù)庫分析其免疫微環(huán)境以及評估其預(yù)后的分子模型。因此，本研究基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫獲取大樣本的胃癌轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，以期構(gòu)建胃癌免疫相關(guān)生存模型，并探索免疫微環(huán)境生存相關(guān)性以及其影響胃癌發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控通路。

1 材料與方法

1.1 原始數(shù)據(jù)下載及數(shù)據(jù)預(yù)處理 從TCGA官網(wǎng)（https：//portal.gdc.cancer.gov/repository）下載胃癌測序數(shù)據(jù)，依次選擇STAD→RNA-Seq→FPKM，并整理成行名為基因名、列名為樣本名的矩陣文件。免疫相關(guān)基因列表從ImmPort網(wǎng)站（https.//www.immport.org/home）下載并整理，總共1 739個(gè)免疫基因。從總矩陣中提取免疫相關(guān)基因表達(dá)量，用于后續(xù)分析。此外，從TCGA網(wǎng)站下載胃癌臨床數(shù)據(jù)，整理成矩陣文件，并排除：（1）臨床信息不完整的病例；（2）術(shù)后隨訪時(shí)間小于90 d的病例。

1.2 構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型

1.2.1 分組 將免疫相關(guān)基因、臨床預(yù)后矩陣合并成行名為樣本名，列名為生存時(shí)間、生存狀態(tài)和基因的新矩陣，采用R“caret”包，按6∶4比例分為訓(xùn)練集、驗(yàn)證集，并采用卡方檢驗(yàn)分析兩組樣本集臨床病理特征的差異性。

1.2.2 構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評估模型 首先采用單因素Cox分析在訓(xùn)練集中篩選預(yù)后相關(guān)免疫基因，在此基礎(chǔ)上，利用多因素Cox分析，得到胃癌風(fēng)險(xiǎn)評估模型。進(jìn)一步利用模型對樣本進(jìn)行評分，以中位風(fēng)險(xiǎn)評分將樣本分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，運(yùn)用R“survminer”包繪制高、低風(fēng)險(xiǎn)Kaplan-Meier生存曲線從而分析該模型預(yù)測效果；運(yùn)用R“survival ROC”包繪制受試者工作特征曲線（ROC）從而驗(yàn)證分析模型可靠性；再運(yùn)用以R“pheatmap”包繪制風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)圖。

1.2.3 驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)評估模型 利用上述風(fēng)險(xiǎn)模型對驗(yàn)證集樣本進(jìn)行評分，并以測試集中位風(fēng)險(xiǎn)評分將驗(yàn)證集樣本分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，再分別運(yùn)用R“survminer”“survival ROC”及“pheatmap”包繪圖，進(jìn)一步驗(yàn)證模型預(yù)測的有效性及可靠性。

1.3 Cox回歸分析篩選影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素 將臨床病理特征及生存矩陣、風(fēng)險(xiǎn)評分（risk score）矩陣整理合并成包含生存時(shí)間、生存狀態(tài)、性別、年齡、分化程度、TNM分期以及風(fēng)險(xiǎn)評分的新矩陣。先采用單因素Cox分析，篩選預(yù)后相關(guān)變量，再預(yù)后相關(guān)的變量納入多因素Cox回歸分析，最終篩選影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

1.4 免疫細(xì)胞浸潤分析 利用單樣本富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA），將基因表達(dá)矩陣轉(zhuǎn)化成28種免疫細(xì)胞相對浸潤比例矩陣，行名是免疫細(xì)胞類型，列名是樣本名。預(yù)設(shè)特征基因集，即各免疫細(xì)胞的特征基因集，從最近發(fā)表的2篇文獻(xiàn)整理［13-14］?？ǚ綑z驗(yàn)分析高、低風(fēng)險(xiǎn)組與各免疫細(xì)胞浸潤比例、各臨床病理特征的關(guān)系，采用R“pheatmap”包繪制高、低風(fēng)險(xiǎn)熱圖。

1.5 高、低風(fēng)險(xiǎn)組差異分析 運(yùn)用R“edger”包分析高、低風(fēng)險(xiǎn)組差異表達(dá)基因后，再利用R“clusterProfiler”對差異基因進(jìn)行基因本體論（GO）、京都基因與基因組大百科全書數(shù)據(jù)庫（KEGG）富集分析，以探索影響胃癌預(yù)后的重要調(diào)控通路以及相關(guān)分子機(jī)制。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用R語言對本研究進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用survival包進(jìn)行單因素、多因素Cox回歸分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以R“chisq.test”函數(shù)分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，以R“t.test”或“wilcox.test”函數(shù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 分組 按照排除標(biāo)準(zhǔn)，將胃癌樣本分為訓(xùn)練集（221例）、驗(yàn)證集（147例），χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，訓(xùn)練集、驗(yàn)證集樣本在年齡、性別、病理分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），說明兩組樣本具有可比性，見表1。

2.2 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果 采用單因素Cox分析在訓(xùn)練集中篩選預(yù)后相關(guān)免疫基因（P＜0.05），再納入多因素Cox分析，得到由9個(gè)免疫基因構(gòu)成的胃癌預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評估模型（圖1），風(fēng)險(xiǎn)值（risk score）=PROC×0.076+IGKV1D-43×0.032+CLCF1×0.049+IL21RA×-0.074+TAFA4×0.061+NOX4×0.446+INHA×0.133+ITGAV×0.025+FABP3×0.019，按訓(xùn)練集中位風(fēng)險(xiǎn)值分別將訓(xùn)練集、驗(yàn)證集樣本分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組。

2.3 Kaplan-Meier生存及ROC分析 采用R“survminer”包對高、低風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行Kaplan-Meier分析，檢測風(fēng)險(xiǎn)評估模型預(yù)測胃癌患者預(yù)后的有效性，結(jié)果顯示，訓(xùn)練集中高、低風(fēng)險(xiǎn)組5年總生存率（OS）分別為20.0%（22/110）、50.5%（55/111）；驗(yàn)證集中高、低風(fēng)險(xiǎn)組5年OS分別為24.7%（18/73）、43.2%（32/74）（圖2A、B）；兩組樣本集高風(fēng)險(xiǎn)組OS均顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)組（均P＜0.05）。采用R“time ROC”包進(jìn)行ROC繪制，檢測風(fēng)險(xiǎn)評估模型預(yù)測胃癌患者預(yù)后的可靠性，結(jié)果顯示，訓(xùn)練集1、3、5年ROC的AUC值為0.69、0.71、0.78，驗(yàn)證集1、3、5年ROC曲線的AUC為0.56、0.71、0.78（圖2C、D）。

圖2 訓(xùn)練集、測試集胃癌患者中高、低風(fēng)險(xiǎn)組Kaplan-Meier生存曲線及ROC（A為訓(xùn)練集的生存曲線，B為驗(yàn)證集的生存曲線，C為訓(xùn)練集的ROC，D為驗(yàn)證集的ROC）

2.4 免疫風(fēng)險(xiǎn)評估模型Cox回歸分析 以構(gòu)建的免疫風(fēng)險(xiǎn)評估模型聯(lián)合胃癌臨床病理特征，包括性別、年齡、分化程度、TNM分期，先做Cox單因素分析，再納入預(yù)后相關(guān)的因素做Cox多因素分析，篩選影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素，結(jié)果顯示，在訓(xùn)練集、驗(yàn)證集中免疫風(fēng)險(xiǎn)評估模型、TNM分期都是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素（表2）。

2.5 免疫風(fēng)險(xiǎn)評估模型與免疫細(xì)胞浸潤、臨床病理特征的關(guān)系 利用Cibersort反卷積算法，將每個(gè)樣本基因表達(dá)矩陣轉(zhuǎn)化成28種免疫細(xì)胞浸潤比例的矩陣，并采用χ2檢驗(yàn)分析訓(xùn)練集、驗(yàn)證集中高、低風(fēng)險(xiǎn)組與臨床病理特征的關(guān)系，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)（屬于非參數(shù)檢驗(yàn)）分析訓(xùn)練集、驗(yàn)證集中高、低風(fēng)險(xiǎn)組與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系。結(jié)果如圖3所示，訓(xùn)練集、驗(yàn)證集中免疫風(fēng)險(xiǎn)評分均與活化的CD4+T細(xì)胞的浸潤有關(guān)，高風(fēng)險(xiǎn)組活化CD4+T細(xì)胞的浸潤比例顯著降低（P＜0.05）。

表1 訓(xùn)練集、測試集胃癌患者的臨床病理特征分布（例）

表2 胃癌臨床病理特征及風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型在訓(xùn)練集、測試集的單因素及多因素Cox回歸分析

2.6 風(fēng)險(xiǎn)差異基因GO、KEGG富集分析 利用非參數(shù)檢驗(yàn)，分別在訓(xùn)練集、驗(yàn)證集中，篩選高、低風(fēng)險(xiǎn)組差異基因，再以R“clusterProfiler”包對差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，以初步探索模型中基因促進(jìn)胃癌進(jìn)展的分子機(jī)制。如圖4所示，訓(xùn)練集、驗(yàn)證集的差異基因均富集于PI3K-Akt、cGMP-PKG、ECM-受體結(jié)合、黏著斑激酶、腫瘤蛋白多糖等腫瘤相關(guān)信號通路。

3 討 論

作為構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，免疫細(xì)胞在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥、預(yù)后評估、治療評估等方面起重要作用。免疫評分已作為胃腸道腫瘤預(yù)后判斷的重要依據(jù)。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫，利用Cox比例回歸模型，構(gòu)建了由9個(gè)免疫基因組成的胃癌預(yù)測模型，利用該模型可準(zhǔn)確、有效地評價(jià)胃癌預(yù)后。

利用公共數(shù)據(jù)庫如TCGA、GEO測序或芯片、臨床數(shù)據(jù)構(gòu)建胃癌預(yù)后模型的研究較多，包括利用編碼蛋白基因、lncRNA、miRNA構(gòu)建模型。此類預(yù)測模型存在以下問題：（1）為減少納入構(gòu)建模型的基因數(shù)，先設(shè)定嚴(yán)格閾值，篩選差異表達(dá)基因。然而，預(yù)后相關(guān)基因不一定是差異基因。因此，一些關(guān)鍵基因可能被剔除。隨著生物信息學(xué)發(fā)展，功能基因被進(jìn)一步注釋、分類，如免疫、代謝以及RNA結(jié)合蛋白相關(guān)基因。（2）利用全部樣本構(gòu)建模型，缺少外部和/或內(nèi)部數(shù)據(jù)的交叉驗(yàn)證，模型的可靠性有待商榷。鑒于以上問題，本研究納入全部免疫相關(guān)基因（1 739例）建模，而不篩選差異基因；TCGA胃癌樣本分為訓(xùn)練集、驗(yàn)證集，在訓(xùn)練集中建模，在驗(yàn)證集中檢測，設(shè)置循環(huán)，滿足條件后輸出結(jié)果。本研究構(gòu)建的模型在訓(xùn)練集、驗(yàn)證集中均能有效評估胃癌患者預(yù)后，隨訪時(shí)間越長，準(zhǔn)確性越高，且該模型是胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。高風(fēng)險(xiǎn)組患者活化CD4+T細(xì)胞浸潤比例減少，CD4+T細(xì)胞浸潤是影響結(jié)腸癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，部分解釋了該組患者預(yù)后差的原因［15］。此外，本研究分別在訓(xùn)練集、驗(yàn)證集中篩選高、低風(fēng)險(xiǎn)組差異基因，納入GO、KEGG富集分析以初步探索模型基因?qū)е禄颊哳A(yù)后差的分子機(jī)制，結(jié)果顯示模型基因可能通過激活PI3K-Akt通路促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移、耐藥。有文獻(xiàn)報(bào)道，PI3K-Akt參與胃癌轉(zhuǎn)移及化療耐藥［16-17］。

圖3 訓(xùn)練集、驗(yàn)證集胃癌患者高低風(fēng)險(xiǎn)組臨床及免疫細(xì)胞浸潤熱圖（A為訓(xùn)練集，221例，B為驗(yàn)證集，147例）

圖4 訓(xùn)練集、驗(yàn)證集胃癌患者風(fēng)險(xiǎn)差異基因KEGG富集圖（A為訓(xùn)練集，B為驗(yàn)證集）

該胃癌預(yù)后評估模型包含8個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因PROC、IGKV1D-43、CLCF1、TAFA4、NOX4、INHA、ITGAV、FABP3和1個(gè)保護(hù)基因IL27RA，其中4個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因被報(bào)道與胃癌或其他惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。心肌營養(yǎng)因子樣細(xì)胞因子1（CLCF1）屬于Gp130細(xì)胞因子家族成員，與細(xì)胞因子受體因子1（CRLF1）形成異源二聚體，與神經(jīng)營養(yǎng)因子（CNTF）競爭性結(jié)合其受體CNTFR，從而激活JAK-STAT增殖相關(guān)信號通路，與肝細(xì)胞癌索拉菲尼耐藥、有氧糖酵解有關(guān)［18］。另外，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通過CLCF1/CXCL6/TGF-β軸協(xié)調(diào)肝癌細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的“對話”［19］。目前尚無CLCF1與胃癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移、預(yù)后及耐藥的報(bào)道。本研究提示CLCF1是影響胃癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素，CLCF1高表達(dá)的患者預(yù)后差，然而，CLCF1促進(jìn)胃癌進(jìn)展的作用及機(jī)制需要進(jìn)一步研究。NAPDH氧化酶4（NOX4）作為催化亞基，可促進(jìn)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，而ROS伴隨腫瘤代謝重編程產(chǎn)生，可作為第二信使，參與多條信號通路的激活及氧化還原信號調(diào)控與腫瘤代謝。沉默NOX4或使用抑制劑可逆轉(zhuǎn)由腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞引起的CD8+T細(xì)胞耗竭而出現(xiàn)的免疫抑制狀態(tài)，從而改善免疫治療耐藥情況［20］。本研究顯示，NOX4在模型中所占權(quán)重最高，高表達(dá)個(gè)體罹患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)增高1.56倍，說明NOX在胃癌預(yù)后評估中的作用最大。整合素α5（integrinαV，ITGAV）屬于整合素家族成員之一，與整合素β亞基形成異源二聚體，調(diào)節(jié)新生血管生成及腫瘤發(fā)展。細(xì)胞外基質(zhì)通過ITGAV激活JAK2/STAT5通路，而該通路參與細(xì)胞干性維持及腫瘤發(fā)生，IL-32γ通過抑制ITGAV介導(dǎo)的STAT5通路從而抑制肺癌干細(xì)胞的增殖［21］。作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子YAP、WWTR1靶基因的ITGAV不僅直接激活Hippo通路，促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移，而且正反饋調(diào)節(jié)YAP、WWTR1的活性。而且，有文獻(xiàn)報(bào)道，ITGAV促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的能力［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，ITGAV高表達(dá)個(gè)體預(yù)后差，提示ITGAV可能促進(jìn)胃癌的轉(zhuǎn)移從而影響預(yù)后。脂肪酸結(jié)合蛋白3（fatty acid binding protein 3，F(xiàn)ABP3），在脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞增殖以及基因調(diào)控方面起重要作用，其高表達(dá)被認(rèn)為是非小細(xì)胞肺癌的不良預(yù)后因素［23］，與本研究顯示的FABP3高表達(dá)是胃癌不良預(yù)后因素相似。

綜上所述，本研究利用TCGA胃癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，構(gòu)建了由9個(gè)免疫基因組成的預(yù)后評估模型，訓(xùn)練集、驗(yàn)證集驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了該模型具有良好的預(yù)測性能，其能準(zhǔn)確區(qū)分高、低風(fēng)險(xiǎn)的病例，具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。