何連軍 王鼎南 張宜明 汪思佳

(1杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州 310018；2浙江農(nóng)林大學(xué)，農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 311300；3浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江杭州 310023)

硝基咪唑類是一類具有5－硝基咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)的藥物，具有較強(qiáng)的抗厭氧菌和抗原蟲作用，曾被用于畜牧、水產(chǎn)品中厭氧菌和寄生蟲的防治[1－2]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其對(duì)人體具有致突變和致癌危害[3－4]。地西泮又稱安定，是一種鎮(zhèn)靜催眠藥物[5]，常用于人和動(dòng)物的鎮(zhèn)靜和催眠治療[6]，一些不法分子為便于水產(chǎn)品的捕撈和運(yùn)輸[7]，擅自在水體中添加地西泮等鎮(zhèn)靜劑，造成水產(chǎn)品中地西泮的殘留，最終通過(guò)食物鏈危害人體健康[8－9]。根據(jù)我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的相關(guān)公告，甲硝唑、洛硝達(dá)唑、地美硝唑和地西泮在動(dòng)物源性食品中均不得檢出[10－12]，而羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑作為硝基咪唑原藥的代謝物，在動(dòng)物源性食品中同樣不得檢出[13]。

目前，我國(guó)針對(duì)硝基咪唑和地西泮的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)主要有GB/T 21318－2007[14]和SN/T 3235－2012[15]。其中GB/T 21318－2007 中采用了凝膠色譜、C18 固相萃取凈化，整個(gè)提取凈化過(guò)程極繁瑣，效率低，不適合高通量檢測(cè)的開展。同時(shí)因使用外標(biāo)法定量，對(duì)檢測(cè)人員的操作要求較高，精確定量難以得到保證。而SN/T 3235－2012 采用了QuEChERS 方法，一定程度上簡(jiǎn)化了提取凈化過(guò)程，且該方法能同時(shí)測(cè)定甲硝唑、地美硝唑、洛硝達(dá)唑、羥甲基甲硝咪唑和地西泮，但該方法的缺點(diǎn)在于使用乙腈提取時(shí)會(huì)帶出大量極性物質(zhì)，而N－丙基乙二胺(primary secondary amine sorbent，PSA)和C18 這2 種吸附劑不能很好地消除極性物質(zhì)的干擾，僅能凈化色素、脂類等弱極性干擾物，因此只適合基質(zhì)成分較單一的魚類(基質(zhì)干擾主要為脂類、蛋白)，對(duì)于極性較強(qiáng)的羥基甲硝唑，因凈化不足，無(wú)法滿足精確定量的要求，故無(wú)法同時(shí)測(cè)定。我國(guó)水產(chǎn)品品種繁多，涵蓋了貝類、爬行類、魚類、甲殼類等多種生物，生物體組成成分差異較大，導(dǎo)致樣品基質(zhì)不同，可引起基質(zhì)干擾的物質(zhì)包括脂類、色素、糖類、可溶性蛋白或多肽、胺類、無(wú)機(jī)鹽等。因此，開發(fā)一種適用于多種樣品基質(zhì)，基于液相色譜－ 串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)檢測(cè)水產(chǎn)品中多獸藥殘留的方法非常必要。

為消除樣品基質(zhì)的干擾，進(jìn)一步增強(qiáng)HPLC－MS/MS 法高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在此基礎(chǔ)上開發(fā)了多種前處理方法來(lái)分析和測(cè)定硝基咪唑和鎮(zhèn)靜劑類藥物，如固相萃取法[16－19]、QuEChERS 法[20－21]、分散固相萃取法[22]、液液微萃取法[23]以及通過(guò)型固相萃取法[24－25]等。其中，C18 固相萃取小柱應(yīng)用較廣泛，但其缺點(diǎn)在于對(duì)極性較強(qiáng)的化合物保留性較差，易造成損失；MCX 復(fù)合陽(yáng)離子交換柱則是利用離子交換作用來(lái)捕獲目標(biāo)物，需通過(guò)調(diào)節(jié)pH 值來(lái)改變目標(biāo)物在小柱上的保留能力，由于不同類的化合物化學(xué)性質(zhì)千差萬(wàn)別，因此較難應(yīng)用于多類化合物的同時(shí)提取和凈化。此外還有HLB、PEP2、RP 等以高聚物為填料的小柱，其主要機(jī)理為反相和疏水作用。以上固相萃取小柱均需要通過(guò)吸附和解吸附的過(guò)程達(dá)到提取凈化的目的，操作步驟繁瑣。而采用PSA 作為吸附材料的QuEChERS 方法雖然操作簡(jiǎn)便，但由于PSA 主要吸附基質(zhì)中的有機(jī)酸、色素和糖類雜質(zhì)，對(duì)富含蛋白、磷脂類的動(dòng)物源性食品凈化能力有限。近年來(lái)，美國(guó)Agilent 公司開發(fā)了一款通過(guò)型固相萃取小柱Captiva EMR-Lipid(EMR)，其原理是通過(guò)空間位阻和疏水作用，阻止脂類物質(zhì)通過(guò)，實(shí)現(xiàn)高選擇性的脂質(zhì)去除，同時(shí)能夠兼顧親水性和疏水性化合物的回收率。本研究在EMR 小柱的基礎(chǔ)上，對(duì)色譜條件、提取條件、凈化條件等進(jìn)行優(yōu)化，旨在建立一種高通量、適用于多種水產(chǎn)品基質(zhì)，并能同時(shí)檢測(cè)水產(chǎn)品中5 種硝基咪唑和地西泮的檢測(cè)方法，以期在水產(chǎn)品大規(guī)模篩查檢測(cè)中得到較好地應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)中所采用的樣品基質(zhì)，品種包括草魚(Ctenopharyngodon idella)、大黃魚(Larimichthys crocea)、中華鱉(Trionyx sinensis)、南美白對(duì)蝦(Penaeus vanname)和貽貝(Mytilus edulis)。其中草魚、中華鱉、南美白對(duì)蝦采自杭州某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，大黃魚購(gòu)自杭州某大型超市，貽貝采自溫州南麂島某養(yǎng)殖戶。

5 種硝基咪唑類藥物混標(biāo)[包括地美硝唑(dimetridazole，DMZ)、羥甲基甲硝咪唑(dimetridazole-2-hydroxy，HMMNI )、羥基甲硝唑 ( hydroxymetronidazole，MNZOH)、甲硝唑( metronidazole，MNZ)、洛硝噠唑( ronidazole，RNZ)]、地西泮(diazepam，DZP)標(biāo)準(zhǔn)溶液、甲硝唑-D4(metronidazole-D4，MNZ-D4)標(biāo)準(zhǔn)溶液、洛硝噠唑-D3(ronidazole-D3，RNZ-D3)標(biāo)準(zhǔn)溶液、地美硝唑-D3(dimetridazole-D3，DMZ-D3) 標(biāo)準(zhǔn)溶液、羥甲基甲硝咪唑-D3(dimetridazole-2-hydroxy-D3，HMMNI-D3)標(biāo)準(zhǔn)溶液、羥基甲硝唑-D4(hydroxy metronidazole-D4，MNZOHD4)標(biāo)準(zhǔn)溶液、地西泮-D5(diazepam-D5，DZP-D5)標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度均為100 μg·mL－1，購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司。將5 種硝基咪唑類藥物混標(biāo)、甲醇中地西泮標(biāo)準(zhǔn)溶液配置成100.0 ng·mL－1的混合內(nèi)標(biāo)工作液。將MNZ-D4 標(biāo)準(zhǔn)溶液、RNZ-D3 標(biāo)準(zhǔn)溶液、DMZ-D3 標(biāo)準(zhǔn)溶液、HMMNI-D3 標(biāo)準(zhǔn)溶液、MNZOH-D4 標(biāo)準(zhǔn)溶液、DZP-D5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成500.0 ng·mL－1的混合內(nèi)標(biāo)工作液，所有標(biāo)準(zhǔn)工作液均－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

乙腈、甲醇、乙酸乙酯(色譜純)，美國(guó)Thermo Fisher 公司；無(wú)水磷酸氫二鉀、無(wú)水碳酸鈉(分析純)，上海麥克林生化試劑有限公司；甲酸(色譜純)，上海麥克林生化試劑有限公司；無(wú)水硫酸鈉(5.0 g 離心管裝，灼燒處理)，北京迪馬科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UltiMate3000 液相色譜儀，美國(guó)Thermo Fisher 公司；API4000 Qtrap 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，美國(guó)SCIEX 公司；Multi Reax 全能型振蕩器，德國(guó)Heidolph 公司；Allegra X－15 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)BECKMAN 公司；N-EVAP112 水浴式氮吹濃縮儀，美國(guó)Organomation 公司；innoLab 10P 手持式pH 計(jì)，英國(guó)PRIMA 公司；Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱(600 mg·6.0mL－1)，美國(guó)Agilent 公司； PRiME HLB 固相萃取柱(200 mg·6.0 mL－1)，美國(guó)Waters 公司。

1.3 樣品制備

魚類、中華鱉樣品取肌肉組織，蝦類樣品去頭去尾去殼后取肌肉組織，貽貝樣品洗凈開殼后取出貝肉，所有樣品均放入攪拌機(jī)中制為勻漿狀，置于－20℃冷凍備用。

1.4 樣品前處理

對(duì)前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，主要考察提取溶劑、提取環(huán)境的pH 值對(duì)目標(biāo)化合物提取效率的影響；比較過(guò)柱時(shí)有機(jī)溶劑的比例對(duì)目標(biāo)化合物損失的影響； 考察EMR 小柱用于樣品凈化時(shí)，不同樣品間的基質(zhì)效應(yīng)；考察2 種通過(guò)型固相萃取小柱(EMR 小柱和PRiME HLB 小柱)凈化效果的差異。

優(yōu)化后樣品前處理過(guò)程如下:準(zhǔn)確稱取均質(zhì)樣品5.0 g 于50 mL 離心管中，加入100 μL 混合內(nèi)標(biāo)工作液，再加入1.0 mL 1.0 mol·L－1磷酸氫二鉀和5.0 mL 10%碳酸鈉，置于振蕩器中充分振蕩。加入20 mL 乙酸乙酯，振蕩提取5 min。加入5.0 g 無(wú)水硫酸鈉，消除乳化。樣品于4℃、3 750 r·min－1離心6 min。離心后取上層乙酸乙酯8 mL 于10 mL 離心管，氮吹吹干。使用5 mL 80%乙腈/水溶液復(fù)溶，過(guò)EMR 小柱，再用1.25 mL 80%乙腈/水潤(rùn)洗小柱，收集濾液氮吹吹干，用0.5 mL 10%乙腈/水溶液復(fù)溶，過(guò)0.2 μm 親水型PTFE 濾膜后備用。

1.5 LC-MS/MS 條件

1.5.1 色譜條件 考察目標(biāo)化合物在兩種C18 色譜柱上的色譜行為，同時(shí)比較不同溶劑作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)色譜行為的影響。其余液相條件統(tǒng)一為:柱溫40℃；流速0.3 mL·min－1；進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫程序:0～1 min，5% B；1～8 min，95% B；8～10 min，95% B；10～13 min，5% B。

1.5.2 質(zhì)譜條件 離子源模式為ESI＋，離子源溫度550℃，電噴霧電壓5 500 Ⅴ，霧化氣(GS1)壓力345 kPa，輔助氣(GS2)壓力345 kPa，氣簾氣(CUR)壓力172 kPa，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)模式，具體質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.6 方法學(xué)驗(yàn)證

采用同位素內(nèi)標(biāo)稀釋法，對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行檢測(cè)分析。建立6 個(gè)濃度水平的系列梯度工作溶液，濃度分別為2、5、10、20、50、100 ng·mL－1，以此考察方法的線性、相關(guān)系數(shù)。通過(guò)信噪比計(jì)算確定方法的檢出限(limit of detection，S/N ＝3) 和定量限(limit of quantitation，S/N＝10)。

1.7 精密度和準(zhǔn)確度驗(yàn)證

按照試驗(yàn)方法，在空白的草魚、中華鱉、南美白對(duì)蝦、大黃魚和貽貝樣品中，做2、4 和10 μg·kg－13 個(gè)添加水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平做6 次平行測(cè)定，計(jì)算其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.8 與國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行對(duì)比

比較本試驗(yàn)方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)在消耗時(shí)間、可操作性以及結(jié)果準(zhǔn)確性方面的優(yōu)劣。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

良好的分離度和靈敏度是多藥物同時(shí)分析的關(guān)鍵。在C18 分析柱基礎(chǔ)上，對(duì)液相條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先，在流動(dòng)相的水相中加入0.1%的甲酸，能提升各化合物在ESI＋模式下的靈敏度。其次，在0.1%甲酸水溶液中加入2 mmol·L－1甲酸銨可降低基線噪音，但MNZOH 和HMMNI 的靈敏度大幅下降，與唐志理等[24]的研究結(jié)果一致，這可能是甲酸銨抑制了這2 種化合物的離子化，因此水相選用0.1%甲酸水溶液。

隨后，分別考察了在2 種有機(jī)相(甲醇、乙腈)體系下，以及2 種不同C18 分析柱(Agilent Eclipse Plus C18、Phenomenex Kinetex C18)條件下，各目標(biāo)化合物的色譜行為，詳見圖1、2、3、4。

圖1 甲醇作為流動(dòng)相，Eclipse Plus C18 為分析柱的色譜圖Fig.1 The chromatogram with the condition of methanol and Eclipse Plus C18

圖2 甲醇作為流動(dòng)相，Kinetex C18 為分析柱的色譜圖Fig.2 The chromatogram with the condition of methanol and Kinetex C18

圖3 乙腈作為流動(dòng)相，Eclipse Plus C18 為分析柱的色譜圖Fig.3 The chromatogram with the condition of acetonitrile and Eclipse Plus C18

圖4 乙腈作為流動(dòng)相，Kinetex C18 為分析柱的色譜圖Fig.4 The chromatogram with the condition of acetonitrile and Kinetex C18

結(jié)果表明，在相同流動(dòng)相條件下，各化合物在Eclipse Plus C18 上的保留時(shí)間較遲，具有較強(qiáng)的保留能力。在相同分析柱條件下，甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，各化合物的靈敏度明顯高于乙腈，峰形更尖銳對(duì)稱，這可能是由于甲醇相較乙腈能夠提供質(zhì)子，改善了化合物的離子化效率。由于乙腈洗脫能力強(qiáng)于甲醇，化合物更易從色譜柱洗脫下來(lái)，MNZOH 和HMMNI 在色譜柱上保留能力較弱，若以乙腈作為流動(dòng)相，容易造成極性干擾物與這2 種目標(biāo)物共流出，從而引起基質(zhì)干擾。因此，選用Eclipse Plus C18 作為分析柱，甲醇作為有機(jī)相。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取條件的考察與優(yōu)化 由EMR 小柱凈化機(jī)理可知，其對(duì)基質(zhì)中的小分子干擾物、鹽、可溶性蛋白等物質(zhì)的凈化具有一定的局限性。且EMR 小柱為通過(guò)型凈化小柱，不存在富集、凈化、洗脫過(guò)程，因此在選擇提取劑時(shí)，需盡量避免干擾物溶解于提取劑，同時(shí)盡可能保持過(guò)柱時(shí)的通暢性。當(dāng)使用甲醇或乙腈提取時(shí)，極性干擾物、無(wú)機(jī)鹽、可溶性蛋白等可直接或通過(guò)基質(zhì)中的水分間接溶于其中，因此選擇與水不互溶的乙酸乙酯作為提取劑。由于乙酸乙酯不能直接通過(guò)EMR 小柱，故采取溶劑替換的方法，彌補(bǔ)EMR 小柱凈化能力的不足。

由于大部分硝基咪唑類為兩性化合物[17，24]，地西泮為堿性化合物[9]，因此在堿性環(huán)境中，目標(biāo)化合物能夠呈分子態(tài)而易于被有機(jī)溶劑萃取。首先，試驗(yàn)嘗試將提取用的有機(jī)溶劑堿化，即使用3%氨化乙酸乙酯直接提取，但該方法的提取液經(jīng)氮吹吹干和80%乙腈/水復(fù)溶后，樣液中存在較多的不可溶性油脂狀顆粒物，在上柱時(shí)導(dǎo)致EMR 小柱堵塞，樣液無(wú)法靠重力自然下滴，因此該方法被舍棄。其次，在樣品中添加pH調(diào)節(jié)劑來(lái)提高提取環(huán)境的pH 值，作為對(duì)比，試驗(yàn)也比較了弱酸性和中性的pH 值條件下，各化合物的提取效率。試驗(yàn)是在無(wú)樣品基質(zhì)干擾的條件下，在不同pH值條件下的水溶液中添加相同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，再使用乙酸乙酯萃取，通過(guò)回收率的比較，來(lái)考察不同pH 值對(duì)目標(biāo)化合物提取效率的影響?？疾斓膒H 條件包括以下4 種:0.1%甲酸水溶液，pH 值3.0；純水，pH 值7.0；混合緩沖液(1.0 mol·L－1磷酸氫二鉀∶10%碳酸鈉，v1∶v2＝1 ∶5)，pH 值10.3；10%碳酸鈉溶液，pH 值11.7。各目標(biāo)化合物在不同pH 條件下的回收率見圖5。

圖5 不同pH 條件下目標(biāo)化合物的回收率Fig.5 The recovery rates of target compounds under different pH conditions

結(jié)果表明，大部分目標(biāo)化合物在弱堿性環(huán)境下提取率更高，但DMZ 在弱酸性條件下回收率最好，隨著堿性的增強(qiáng)，提取效率反而下降，這可能是因?yàn)镈MZ有1 個(gè)硝基，堿性增強(qiáng)后DMZ 呈離子態(tài)[17]，不利于提取。在混合緩沖液(pH 值10.3)條件下，各目標(biāo)化合物的回收率較為均衡，因此選用混合緩沖液作為樣品pH 環(huán)境的調(diào)節(jié)劑。經(jīng)過(guò)pH 計(jì)測(cè)試，在5 種不同種類的樣品基質(zhì)中添加6.0 mL 混合緩沖液，各類樣品基質(zhì)的pH 值非常接近，pH 值范圍為9.9～10.1，能夠保證提取方法在應(yīng)對(duì)不同基質(zhì)時(shí)擁有較一致的提取效率。此外，使用混合緩沖液調(diào)節(jié)pH 值再用乙酸乙酯萃取的方法，不會(huì)出現(xiàn)類似氨化乙酸乙酯提取時(shí)大量不溶性油脂狀顆粒物堵塞小柱的現(xiàn)象。因此以混合緩沖液調(diào)節(jié)pH 值后再用乙酸乙酯萃取的方法更合適。對(duì)于加入混合緩沖液造成的乳化現(xiàn)象，則通過(guò)加入5.0g 無(wú)水硫酸鈉來(lái)進(jìn)行消除。

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化 EMR 小柱在上樣時(shí)，需要一定比例的水活化吸附劑，但過(guò)高或過(guò)低比例的水會(huì)影響化合物的回收率。故試驗(yàn)中配置了不同濃度的乙腈/水溶液(70%、75%、80%、85%、90%)，并以此配置了相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行上柱試驗(yàn)，過(guò)柱后步驟同1.4 節(jié)中方法，考察了不同乙腈濃度下上柱后各目標(biāo)化合物的回收率，結(jié)果見圖6。

圖6 不同乙腈濃度下目標(biāo)化合物的回收率Fig.6 The recovery rates of target compounds under different concentration of acetonitrile

結(jié)果表明，在80%乙腈/水條件下，各化合物回收率均保持在80%以上，較為均衡，故選用80%乙腈/水作為上柱前復(fù)溶用的溶劑。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)的干擾主要來(lái)源于樣品的前處理過(guò)程以及檢測(cè)時(shí)的離子化階段。如果在前處理時(shí)凈化不完全，則會(huì)對(duì)分析物的離子化效率造成干擾，造成分析物信號(hào)的增強(qiáng)或減弱，進(jìn)而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，在試驗(yàn)分析驗(yàn)證過(guò)程中，對(duì)基質(zhì)效應(yīng)影響的評(píng)估是必不可少的。本試驗(yàn)采取峰面積比值法來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。具體操作如下，選取草魚、南美白對(duì)蝦、大黃魚、貽貝和中華鱉共5 種常見的水產(chǎn)品基質(zhì)，采用1.4 節(jié)中的前處理方法，分別制備5 種基質(zhì)的基質(zhì)空白液，并用5 種基質(zhì)空白液分別配制20 ng·mL－1基質(zhì)空白加標(biāo)液，通過(guò)質(zhì)譜分析，與20 ng·mL－1的溶劑空白加標(biāo)溶液進(jìn)行峰面積的比對(duì)來(lái)考察基質(zhì)效應(yīng)。具體計(jì)算公式為:基質(zhì)效應(yīng)＝(基質(zhì)空白液加標(biāo)峰面積－溶劑空白加標(biāo)峰面積)/溶劑空白加標(biāo)峰面積×100%，負(fù)值表示基質(zhì)減弱效應(yīng)，正值表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[24]。由表2可知，該方法在應(yīng)對(duì)草魚、大黃魚、南美白對(duì)蝦和中華鱉樣品時(shí)，均達(dá)到了較好的凈化效果，6 種目標(biāo)物的基質(zhì)減弱效應(yīng)均不超過(guò)－30%。特別是針對(duì)高脂類樣品大黃魚，基質(zhì)減弱效應(yīng)最高不超過(guò)－21%，表明EMR 小柱對(duì)樣品起到了較好的除脂作用。但在應(yīng)對(duì)貽貝基質(zhì)時(shí)，凈化效果較差，尤其是地西泮，其基質(zhì)減弱效應(yīng)達(dá)－49%，由于貽貝制樣時(shí)連同內(nèi)臟一起勻漿，故基質(zhì)本身較為復(fù)雜，多糖、色素、蛋白、多肽等均包含其中，使最終的凈化效果弱于其他基質(zhì)的凈化效果。盡管如此，所有樣品的絕對(duì)回收率大于50%。通過(guò)內(nèi)標(biāo)法補(bǔ)償，可以有效地校正樣品的絕對(duì)回收率，最終所有樣品相對(duì)回收率為88.9%～106.2%。

表2 目標(biāo)化合物在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 The matrix effects of target compounds in different samples

2.4 不同通過(guò)型凈化小柱的提取、凈化效果對(duì)比

試驗(yàn)選用同為通過(guò)型固相萃取的PRiME HLB 小柱與EMR 小柱進(jìn)行對(duì)比，同時(shí)比較乙酸乙酯萃取和乙腈萃取對(duì)提取效果的影響。試驗(yàn)選用中華鱉作為基質(zhì)，同時(shí)在樣品中添加相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，按照不同前處理方法凈化樣品，通過(guò)比較化合物的峰面積來(lái)考察各凈化方法的效果，具體方法如下:

方法1:參照1.4 節(jié)前處理。

方法2:參照1.4 節(jié)前處理，將EMR 小柱替換成PRiME HLB 小柱。

方法3:參考唐志理等[24]、馬東杰等[25]的前處理方法，并結(jié)合1.4 節(jié)中pH 值調(diào)節(jié)方法，然后使用20 mL 乙腈作為提取劑。等提取完成后，加入5 g 無(wú)水硫酸鈉促進(jìn)乙腈與水相分層，取8 mL 乙腈與2 mL 超純水混合均勻，過(guò)EMR 小柱凈化。

方法4:參照方法3，將EMR 小柱替換成PRiME HLB 小柱。

每種方法均做3 個(gè)相同濃度的加標(biāo)平行(10 μg·kg－1)，通過(guò)計(jì)算目標(biāo)化合物的峰面積，比較不同提取凈化方式對(duì)6 種目標(biāo)化合物的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 不同提取、凈化條件下6 種目標(biāo)化合物的峰面積Fig.7 Peak areas of 6 target compounds under different extraction and purification conditions

對(duì)比發(fā)現(xiàn)2 種小柱的凈化效果存在差異。PRiME HLB 小柱對(duì)極性較強(qiáng)的甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑、羥基甲硝唑具有較好的凈化效果，這3 種化合物在凈化時(shí)的損失要小于EMR 小柱或持平，但PRiME HLB 小柱對(duì)極性較弱的地美硝唑和地西泮并不友好，凈化后出現(xiàn)了較大的損失，這可能是因?yàn)榈孛老踹蚝偷匚縻哂休^強(qiáng)的疏水性，被保留在PRiME HLB 小柱上，未被完全洗脫下來(lái)。此外，乙酸乙酯作為提取劑時(shí)，各目標(biāo)化合物的提取率顯著高于乙腈。因此，乙酸乙酯提取與EMR 小柱凈化組合方法的通用性明顯優(yōu)于其他方法。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 方法的線性范圍、回歸方程、檢出限與定量限

6 種目標(biāo)化合物在2～100 ng·mL－1范圍內(nèi)線性良好，各目標(biāo)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限如表3所示。

表3 各目標(biāo)化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)及定量限Table 3 Linear equations，correlation coefficient and method quantification limit

2.5.2 精密度和準(zhǔn)確度驗(yàn)證 由表4可知，方法中5種硝基咪唑類藥物和地西泮的平均回收率為87.7%～110.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.63%～11.17%，說(shuō)明優(yōu)化后方法具有良好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度。

2.6 與國(guó)標(biāo)方法的對(duì)比

與GB/T 21318－2007 和SN/T 3235－2012 相比，本試驗(yàn)方法簡(jiǎn)化了前處理過(guò)程，用溶劑替換和通過(guò)型固相萃取凈化替代了操作繁瑣的凝膠色譜、C18 固相萃取和QuEChERS 方法，將試驗(yàn)時(shí)間從1 天縮短至半天完成。在試驗(yàn)結(jié)果方面，以草魚基質(zhì)為例，GB/T 21318－2007 需要在草魚空白基質(zhì)液校準(zhǔn)的情況下，才能將5 種硝基咪唑的加標(biāo)回收率控制在78.1%～ 86.9%之間；而SN/T 3235－2012 僅使用RNZ-D3 和DZP-D5 作為同位素內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)，存在目標(biāo)物與同位素內(nèi)標(biāo)提取效率不同步的問(wèn)題，草魚基質(zhì)中4 種硝基咪唑和地西泮的加標(biāo)回收率在69.0%～118.6%之間。而本試驗(yàn)方法能夠適用于多種水產(chǎn)品基質(zhì)的凈化，通過(guò)一對(duì)一的同位素內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性得到保證，6 種目標(biāo)物在5 種水產(chǎn)品基質(zhì)中的的平均回收率在87.7%～110.0%之間，優(yōu)于上述國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，各目標(biāo)化合物的定量限也明顯優(yōu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)還彌補(bǔ)了SN/T 3235－2012 中不能測(cè)定羥基甲硝唑的缺陷。

3 討論

本研究結(jié)果表明，乙酸乙酯提取與EMR 小柱凈化結(jié)合的預(yù)處理方法，在檢測(cè)水產(chǎn)品中5 種硝基咪唑和地西泮時(shí)具有較好的適用性。乙酸乙酯適合萃取中等極性或弱極性的物質(zhì)，相較偏極性的乙腈，可以提高5種硝基咪唑和地西泮的提取效率。同時(shí)，乙酸乙酯也能將一些強(qiáng)極性的干擾物排除在外，而隨乙酸乙酯被一起提取的脂類等弱極性物質(zhì)，在EMR 小柱的空間位阻和疏水作用下，可得到有效的凈化。此外，通過(guò)添加混合緩沖鹽，較溫和地改變了基質(zhì)pH 環(huán)境，提高了提取效率，作為對(duì)比，氨化乙酸乙酯因堿性較強(qiáng)，易引起基質(zhì)的水解，產(chǎn)生更多干擾物，對(duì)后續(xù)凈化不利。試驗(yàn)方法還借鑒了QuEChERS 法中的鹽析過(guò)程，在基質(zhì)中加入過(guò)量的無(wú)水硫酸鈉，使一些蛋白質(zhì)變性沉淀，同時(shí)由于無(wú)水硫酸鈉的吸水作用，乙酸乙酯與水相獲得了更好的分層效果。從方法的定量限、準(zhǔn)確度和精密度來(lái)看，本方法較MCX 小柱固相萃取法[26－27]，擁有更好的靈敏度和重現(xiàn)性，基質(zhì)適用范圍也更廣。從基質(zhì)效應(yīng)來(lái)看，在相同基質(zhì)下，本方法的凈化效果不亞于QuEChERS 法[28]和PRiME HLB 小柱固相萃取法[24]。作為對(duì)比，QuEChERS 法[29－31]的吸附劑對(duì)部分藥物有吸附，使其適用范圍受到一定的限制；PRiME HLB 小柱則在應(yīng)對(duì)極性較弱的化合物時(shí)，回收率不佳。本研究方法也存在一定的不足，由于乙酸乙酯不能直接過(guò)EMR 小柱，需要進(jìn)行溶劑替換，氮吹時(shí)可能會(huì)引起藥物的損失；在貽貝樣品中基質(zhì)效應(yīng)也較大。目前，在多組分獸藥同時(shí)分析時(shí)，單一的凈化手段已經(jīng)無(wú)法滿足試驗(yàn)需要，已有學(xué)者研發(fā)了QuEChERS 法和通過(guò)型固相萃取聯(lián)用的方法用于水產(chǎn)品的檢測(cè)[32]。盡管如此，本研究的方法在檢測(cè)水產(chǎn)品中的獸藥殘留方面，仍具有較好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本研究基于通過(guò)型固相萃?。咝б合嗌V－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了快速測(cè)定水產(chǎn)品中5 種硝基咪唑類藥物和地西泮的檢測(cè)方法。相較國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，將硝基咪唑類和地西泮兩類化合物使用同一種方法提取、凈化和分析，縮短了分析時(shí)間，降低了人力成本。本試驗(yàn)還驗(yàn)證了該方法在多種水產(chǎn)品基質(zhì)中檢測(cè)的可行性，6種目標(biāo)化合物的平均回收率在87.7～110.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于11.17%，本研究還證明了通過(guò)型萃取小柱能夠適應(yīng)極性跨度較大的復(fù)雜基質(zhì)中多種有害獸藥殘留檢測(cè)。因此該方法適用于大多數(shù)水產(chǎn)品中5 種硝基咪唑和地西泮的同時(shí)分析。