李 娜 周紅麗 吳衛(wèi)國 廖盧艷 劉 博 宗 平 任劍豪 周 濤

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2中南糧油食品科學(xué)研究院有限公司，湖南長沙 410008)

稻谷是我國主要的糧食作物之一，全國各地都有稻谷的種植區(qū)，年總產(chǎn)量高達(dá)2 億t[1]。稻谷儲藏過程中，受儲藏條件的限制易滋生霉菌，易引起儲藏稻谷發(fā)霉、腐爛和變色，直接或間接地影響儲藏稻谷的質(zhì)量與安全[2]。稻谷儲藏期間危害最大的微生物是霉菌[3]，何榮等[4]研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉(Aspergillus niger)、黃曲霉(Aspergillus flavus) 以及產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)最易導(dǎo)致稻谷結(jié)塊，結(jié)塊稻谷的出糙率、整精米粒率較低，且不完善粒率明顯增加。在熱帶、亞熱帶氣候地區(qū)，多數(shù)稻谷在濕熱季節(jié)收獲，未及時干燥的稻谷在濕熱條件下儲藏會滋生大量霉菌，引起稻谷品質(zhì)下降[5－7]。實際應(yīng)用中，產(chǎn)毒霉菌通常會污染儲存的谷物和谷物產(chǎn)品，同時也會產(chǎn)生有毒的次生代謝物，這些次生代謝物甚至可直接影響動物生殖系統(tǒng)[8－10]。儲藏期間，稻各中帶有的霉菌種類較多，主要是曲霉屬和青霉屬[11]，現(xiàn)階段仍主要依據(jù)霉菌的菌落情況和顯微結(jié)構(gòu)特征[12－13]來鑒定，如參考菌落、菌絲和孢子的形態(tài)[14]。但針對儲糧糧倉不同層位稻谷中優(yōu)勢霉菌數(shù)量的變化以及不同儲糧階段稻谷中優(yōu)勢霉菌的變化規(guī)律研究相對較少。

鑒于此，為了調(diào)整和完善稻谷的儲藏條件，降低稻谷在儲藏過程中的損失，本研究綜合湖南各地區(qū)的儲糧條件，對不同儲糧階段、不同糧倉及糧倉不同位置稻谷中優(yōu)勢霉菌的種類及數(shù)量進(jìn)行研究，以期為稻谷安全儲藏與防控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品來源:湖南省常德市金牛糧倉7P3 倉、長沙縣金山糧倉0P2 倉、永州市銀光糧倉1P2 倉。

稻谷品種:早秈稻；入庫年份:2018年。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；氯化鈉(分析純)，西隴科學(xué)股份有限公司；TSINGKE DNA 凝膠回收試劑盒(Code No.GE0101)、rTaq 酶(Taq DNA 聚合酶)、PCR Mix、測序試劑ABI-bigdye，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司；TIANGEN 基因組DNA 提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SW-CJ－1D 超凈工作臺，江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠；MJ－150－11 霉菌培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDZX－50KBS 立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；TP－220A 電子天平，湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；ABI 3730XL 測序儀，美國基因儀器公司；SMA4000微量分光光度計，美國恒通(北京)儀器有限公司上海分公司；DYY－6C 電泳儀，北京六一生物科技有限公司；BLD8-PCR－2 全自動基因擴(kuò)增儀，上海仝元生物科技有限公司；FR980 凝膠成像分析系統(tǒng)，上海復(fù)日科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 稻谷樣品采集 2019年9月6日分別進(jìn)行第一次取樣，此后每兩個月取樣一次，共取樣3 次。采用五點三層取樣，分別以距糧堆表面2.4、3.6、4.8 m 為上層、中層、下層[15]。以距糧倉東南角、東北角、西南角、西北角1.5 m 處及糧倉中央點作為取樣點，每一個點位取上、中、下三層的稻谷，共取15 份樣品，每份樣品取1 kg，用無菌取樣袋密封取回，于實驗室低溫避光保存。取樣點位如圖1所示。

圖1 稻谷每層取樣點位圖Fig.1 Rice sampling point bitmap of each layer

1.3.2 霉菌菌種鑒定

1.3.2.1 霉菌菌種初步鑒定 利用劃線法分離純化得到的霉菌，根據(jù)其菌落的培養(yǎng)特性和顯微特征對菌種進(jìn)行初步鑒定；霉菌培養(yǎng)特性的觀察:根據(jù)霉菌的生長速度、培養(yǎng)時間，以及其菌落顏色、氣味、形態(tài)等，對其進(jìn)行初步判斷。

霉菌顯微特征鑒定:挑取菌落邊緣的氣生菌絲，制片。將其置入顯微鏡下，觀察其是有性或是無性繁殖、營養(yǎng)菌絲的情況以及形態(tài)和大小，著重觀察其菌絲形態(tài)及其分生孢子頭的形態(tài)，根據(jù)霉菌的顯微特征對其進(jìn)行初步鑒定[12]。

1.3.2.2 霉菌菌種鑒定 使用TIANGEN 基因組DNA 提取試劑盒提取待測菌株的DNA，對提取的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，通用引物為(ITS1:TCCGTAGGTG AACCTGCGG； ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC)。PCR 反應(yīng)體系為50 μL(PCR Mix 25 μL、DNA 模板4 μL、緩沖液1 μL、ddH2O 20 μL)。PCR 反應(yīng)條件:98℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s，54℃退火10 s，72℃延伸10 s，循環(huán)35 次，最后72℃延伸5 min。

使用TSINGKE DNA 凝膠回收試劑盒(Code No.GE0101)切膠回收目的片段以相應(yīng)引物測序。將測序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對，從中選取同源性高的菌株，再使用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.3 霉菌量測定方法 霉菌量測定參照GB 4789.15－2016[16]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Excel 2010 對測定數(shù)據(jù)作圖，采用IBM SPSS Statistics 20 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻谷中霉菌的鑒定

2.1.1 霉菌的篩選 對湖南省3 個地區(qū)糧倉中的稻谷分別進(jìn)行定點定時取樣，經(jīng)過3 次取樣對比，選取了生長速度、培養(yǎng)時間、菌落狀態(tài)、顏色等不同的8 種優(yōu)勢霉菌，暫標(biāo)記為A、B、C、D、F、I、K、L，通過菌株分離及5 次純化得到8 種霉菌的純培養(yǎng)物，于4℃保存。

2.1.2 霉菌的形態(tài)特征分析及菌種鑒定 經(jīng)過霉菌形態(tài)學(xué)對比和測序可知(表1)，A、B、C、D、F、I、K、L 菌株所對應(yīng)的霉菌分別為:根霉(Rhizopodiformis isolate HX－1)、米曲霉(Aspergillus oryzae isolate NL5)、毛霉(Lichtheimia ramosa strain AUMC7961)、黑曲霉(Aspergillus niger isolate SZ8M－14)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus strain JXL－108Y－1)、黃曲霉(Aspergillus flavus isolate L－4932013)、白曲霉(Aspergillus candidus strain HDN15－152)、桔青霉(Penicillium citrinum strain NSF4)。

表1 取樣糧倉的儲藏條件Table 1 Storage conditions of sampling granaries

表2 取樣糧層稻谷的溫度Table 2 Rice temperature of sampled grain layers

表3 優(yōu)勢菌菌種鑒定Table 3 Identification of dominant bacteria

2.2 糧倉中優(yōu)勢霉菌差異對比

2.2.1 金牛倉中優(yōu)勢霉差異對比 由圖2可知，金牛倉庫的稻谷中米曲霉、黑曲霉、煙曲霉、黃曲霉的數(shù)量隨著儲藏時間的延長而減少，而根霉、毛霉、白曲霉、桔青霉的數(shù)量則隨著儲藏時間的延長逐漸增加，其中根霉、毛霉數(shù)量增加較多，占優(yōu)勢，且在不同儲藏時間同一霉菌的霉菌數(shù)量存在顯著差異(P<0.05)。

圖2 糧倉中不同優(yōu)勢霉菌總數(shù)差異比較Fig.2 Comparison of the difference in the total number of different dominant molds in the granary

由圖3可知，第一次取樣結(jié)果顯示，根霉數(shù)量在金牛糧倉中的分布從高到低依次為上層>下層>中層，米曲霉數(shù)量在糧倉中的分布為中層>上層>下層，毛霉、黑曲霉、煙曲霉、黃曲霉、白曲霉數(shù)量在糧倉中的分布均為上層>中層>下層，桔青霉為中層>下層>上層，隨著儲藏時間的延長，各霉菌在糧倉中整體分布趨勢不變，同一霉菌在同一糧倉不同糧層間存在顯著差異(P<0.05)。這可能由于不同種類霉菌的最適溫度不同，結(jié)合取樣時各糧倉倉溫、倉濕以及不同糧層溫度(表1)可知，儲糧糧倉、不同層位的稻谷溫度有一定的差別；另外，不同層位的稻谷水分含量、含氧量等條件也不相同，因此導(dǎo)致同一種霉菌在不同位置的生長繁殖狀態(tài)存在較大差異。

圖3 糧倉不同層位稻谷優(yōu)勢霉菌差異比較Fig.3 Comparison of differences in dominant molds in different layers of grain storage

2.2.2 金山倉中優(yōu)勢霉差異對比 由圖4可知，在金山倉庫中稻谷的米曲霉、黑曲霉、黃曲霉數(shù)量隨著儲藏時間的延長而減少，而根霉、毛霉、白曲霉、桔青霉數(shù)量則隨著儲藏時間的延長逐漸增加，其中根霉、毛霉數(shù)量增加較多，占優(yōu)勢，且在不同儲藏時間同一霉菌的霉菌數(shù)量存在顯著差異(P<0.05)。

圖4 糧倉中不同優(yōu)勢霉菌總數(shù)差異比較Fig.4 Comparison of the difference in the total number of different dominant molds in the granary

由圖5可知，根霉的數(shù)量在金山糧倉中的分布從高到低依次為上層>下層>中層，米曲霉的數(shù)量在糧倉中的分布為中層>上層>下層，毛霉、黑曲霉、黃曲霉、白曲霉的數(shù)量在糧倉中的分布為上層>中層>下層，桔青霉的數(shù)量為中層>下層>上層，隨著儲藏時間的延長，各霉菌的數(shù)量在糧倉中整體分布趨勢不變，同一霉菌的數(shù)量在同一糧倉不同糧層間存在顯著差異(P<0.05)。

圖5 糧倉不同層位稻谷優(yōu)勢霉菌差異比較Fig.5 Comparison of differences in dominant molds in different layers of grain storage

2.2.3 銀光倉中優(yōu)勢霉差異對比 由圖6可知，在銀光倉中，隨著儲藏時間的延長，米曲霉、黑曲霉、黃曲霉的數(shù)量逐漸降低；而根霉、毛霉數(shù)量則隨著儲藏時間的延長逐漸增加，其中根霉、毛霉數(shù)量增加較多，占優(yōu)勢，且在不同儲藏時間同一霉菌的霉菌數(shù)量存在顯著差異(P<0.05)。

圖6 糧倉中不同優(yōu)勢霉菌總數(shù)差異比較Fig.6 Comparison of the difference in the total number of different dominant molds in the granary

由圖7可知，根霉的數(shù)量在糧倉中的分布從高到低依次為上層>下層>中層，米曲霉的數(shù)量在糧倉中的分布為中層>上層>下層，毛霉、黑曲霉、黃曲霉的數(shù)量在糧倉中的分布為上層>中層>下層，隨著儲藏時間的延長，各霉菌的數(shù)量在糧倉中整體分布趨勢不變，同一霉菌在同一糧倉不同糧層間存在差異顯著(P<0.05)。

圖7 糧倉不同層位稻谷優(yōu)勢霉菌差異比較Fig.7 Comparison of differences in dominant molds in different layers of grain storage

3 討論

本研究通過對稻谷中分離鑒定出的8 種優(yōu)勢霉菌進(jìn)行形態(tài)特征分析及分子生物學(xué)鑒定，初步判定為根霉(Rhizopodiformis isolate HX－1)、米曲霉(Aspergillus oryzae isolate NL5)、毛霉(Lichtheimia ramosa strain AUMC7961)、黑曲霉(Aspergillus niger isolate SZ8M－14)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus strain JXL－108Y－1)、黃曲霉(Aspergillus flavus isolate L－4932013)、白曲霉(Aspergillus candidus strain HDN15－152)、桔青霉(Penicillium citrinum strain NSF4)。王榮雪等[25]和楊思成等[26]研究發(fā)現(xiàn)稻谷中主要優(yōu)勢霉菌為曲霉屬的灰綠曲霉、黃曲霉和白曲霉，也說明了稻谷霉菌中曲霉菌為主要的一類優(yōu)勢霉菌。

對比3 個糧倉中霉菌的種類和數(shù)量變化發(fā)現(xiàn)，米曲霉、黑曲霉、煙曲霉、黃曲霉的數(shù)量均隨著儲藏時間的延長而減少，而剩余菌種則隨著儲藏時間的延長，數(shù)量逐漸增加。方寶慶等[27]通過研究不同糧倉稻谷霉菌量也發(fā)現(xiàn)，不同糧倉以及糧倉不同位置稻谷霉菌量均有差異。所以本研究的糧倉中不同糧層霉菌數(shù)量與優(yōu)勢霉菌差異會隨著客觀條件的變化而變化著，而不是永遠(yuǎn)不變的[28－29]。

對比3 個糧倉地理方位，永州市銀光糧倉地理位置在最南方，儲糧溫度及相對濕度均偏高，稻谷對同一霉菌的帶菌量總體高于另2 個糧倉，這與前人研究結(jié)果相似。方寶慶等[27]通過對湖北、湖南兩地不同儲糧位置的稻谷霉菌研究發(fā)現(xiàn)，稻谷帶菌量與水分活度有一定相關(guān)性；吳紅萍等[5]研究發(fā)現(xiàn)海南省儲糧稻谷含水量整體呈東部>中部>西部，海南省儲糧稻谷含菌量整體呈東部>中部>西部，這與東部、西部及中部水稻平均含水量的規(guī)律基本相同。

4 結(jié)論

本研究通過對3 個糧倉優(yōu)勢霉菌菌種及帶菌量測定，經(jīng)過分析對比，得到金牛糧倉優(yōu)勢霉菌有8 種，金山倉有7 種，銀光倉有5 種。除根霉與桔青霉外，優(yōu)勢霉菌大多分布在糧倉上層和中層，差異顯著性分析結(jié)果顯示同一霉菌在同一糧倉不同糧層間存在顯著差異。稻谷中優(yōu)勢菌的數(shù)量隨著儲藏時間的延長，也存在一定的動態(tài)變化，米曲霉、黑曲霉、煙曲霉、黃曲霉的數(shù)量均是隨著儲藏時間的延長而減少，而剩余菌種則隨著儲藏時間的延長，數(shù)量逐漸增加，差異顯著性分析結(jié)果也表明同一霉菌在不同儲藏時間霉菌數(shù)量間存在差異性顯著(P<0.05)。分析不同糧倉、糧倉不同位置稻谷優(yōu)勢霉菌及霉菌量的差異，可以有效預(yù)測糧堆是否存在霉變風(fēng)險，對精準(zhǔn)防霉控霉有重要意義。但本研究未對所檢出的優(yōu)勢霉菌各自最適生長溫度、濕度等進(jìn)行對比，因此糧倉所處地理環(huán)境對稻谷中優(yōu)勢菌生長的影響還有待進(jìn)一步研究。