海興華，劉芳，駱雄飛，李華南，張瑋，王海騰，孫慶

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381）

胃黏膜在維持胃的生理功能中起著重要作用，可以保護(hù)深層組織免受胃液成分的破壞和防止黏膜刺激物的攝入[1-2]。胃黏膜損傷是導(dǎo)致胃潰瘍及急慢性胃炎的主要病理生理環(huán)節(jié)[3]。針對胃黏膜損傷的治療，目前西醫(yī)尚無特效手段，而腹部推拿則善于調(diào)理脾胃疾患[4-5]，相關(guān)臨床研究已經(jīng)證實(shí)了腹部推拿治療胃黏膜損傷性疾病具有顯著療效[6-7]。然而，針對腹部推拿促進(jìn)胃黏膜損傷修復(fù)作用的相關(guān)基礎(chǔ)研究還處于初級(jí)階段，故本研究以無水乙醇致胃黏膜損傷大鼠作為研究對象，觀察腹部推拿對胃黏膜損傷的修復(fù)作用，并從調(diào)節(jié)胃黏膜攻擊因子和防御因子平衡的角度初步探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用SPF級(jí)健康成年SD大鼠30只，6～8周齡，雌雄不限，體質(zhì)量（200±20）g[北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證：SCXK（京）2014-0004]。

1.2 主要試劑與儀器 無水乙醇（科密歐，天津）；4%多聚甲醛（鼎國，北京）；白介素（IL）-6酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）kit（Ebioscience公司，美國）；腫瘤壞死因子（TNF）ELISA kit（Ebioscience公司，美國）；表皮生長因子（EGF）ELISA kit（Ebioscience 公司，美國）；MilliQ超純水系統(tǒng)（Millipore公司，美國）；AL204型分析天平（Mettler-toledo Instruments公司，瑞士）；ST-10組織切片機(jī)[世聯(lián)博研（北京）科技有限公司]；DW-86L628型-80℃立式超低溫保存箱（Haier公司，中國）。

2 方法

2.1 造模方法 采用無水乙醇灌胃法復(fù)制胃黏膜損傷大鼠模型。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，除空白對照組外，其余實(shí)驗(yàn)大鼠均禁食不禁水24 h后，按照5 mL/kg的劑量行無水乙醇灌胃1次。模型成功的標(biāo)準(zhǔn)是無水乙醇灌胃后實(shí)驗(yàn)大鼠胃黏膜出現(xiàn)條狀出血壞死，病理切片可見腺體破壞、炎性細(xì)胞浸潤等損傷表現(xiàn)。造模后2 h即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。

2.2 分組與干預(yù)方法 采用隨機(jī)對照研究方法，運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的胃黏膜損傷大鼠隨機(jī)分為腹部推拿組和模型組，每組各10只。同時(shí)設(shè)置10只大鼠作為空白對照組。腹部推拿組干預(yù)操作方法：實(shí)驗(yàn)大鼠取仰臥位，將其束縛于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。操作者右手食指、中指伸直并攏，其余3指屈曲放松，以食指、中指指腹于實(shí)驗(yàn)大鼠腹部，利用腕關(guān)節(jié)帶動(dòng)兩指做回旋揉動(dòng)，揉動(dòng)頻率為20～30次/min，操作10 min，連續(xù)治療21 d，每日正常飼食喂水。模型組每天將實(shí)驗(yàn)大鼠束縛于實(shí)驗(yàn)臺(tái)10 min，不予任何干預(yù)?？瞻讓φ战M不予任何干預(yù)。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.3.1 觀察大鼠行為學(xué)改變 扭體反應(yīng)：觀察實(shí)驗(yàn)大鼠扭體反應(yīng)，記錄15 min內(nèi)每只大鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，干預(yù)前后各觀察1次。曠場實(shí)驗(yàn)：本實(shí)驗(yàn)使用曠場箱長、寬、高均為80 cm的定制塑料箱，內(nèi)壁涂黑，并將底面均分為25個(gè)小方格。測試時(shí)，將大鼠置于曠場箱底面中心，并用視頻裝置錄制其6 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)行為。觀察指標(biāo)：以大鼠穿越底面的方格數(shù)為水平得分，以后肢站立的次數(shù)為垂直活動(dòng)得分。記錄各組動(dòng)物垂直活動(dòng)得分、水平活動(dòng)得分[8]。干預(yù)前后各測量1次。

2.3.2 標(biāo)本采集及組織病理學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)大鼠斷頭處死后迅速打開腹腔取胃組織，從幽門部沿胃大彎剪開，肉眼觀察胃黏膜組織損傷情況；取1 cm×1 cm胃組織標(biāo)本，置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后進(jìn)行病理學(xué)觀察；剪取50～100mg胃黏膜組織，放置于2mL凍存管中，收藏于-80℃冰箱待用。

2.3.3 炎性因子和表皮生長因子檢測 將保存的胃黏膜組織以無菌剪刀剪成勻漿；將勻漿放入1.5mL離心管中，離心機(jī)離心半徑75 mm，2 500 r/min離心20 min，仔細(xì)收集上清液，放入另外的1.5 mL離心管中；采用ELISA法檢測胃黏膜組織樣本中TNF-α、IL-6和EGF水平，操作嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行操作。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 扭體反應(yīng) 空白對照組大鼠行為較正常，造模后模型組和腹部推拿組大鼠扭體反應(yīng)次數(shù)顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。腹部推拿干預(yù)后腹部推拿組大鼠扭體反應(yīng)次數(shù)明顯降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 3組大鼠扭體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）Tab.1 Results of twisting reaction of rats in each group（±s） 次

表1 3組大鼠扭體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）Tab.1 Results of twisting reaction of rats in each group（±s） 次

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) 扭體反應(yīng)次數(shù)造模后 干預(yù)后空白對照組 10 0.30±0.48 0.20±0.42模型組 10 35.10±8.14* 26.20±5.55腹部推拿組 10 36.60±6.75* 17.20±5.12#

3.2 曠場實(shí)驗(yàn) 空白對照組大鼠活動(dòng)正常，造模后模型組和腹部推拿組大鼠在曠場箱中的垂直活動(dòng)得分和水平活動(dòng)得分顯著低于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。腹部推拿干預(yù)后腹部推拿組大鼠垂直活動(dòng)得分和水平活動(dòng)得分均所提升，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）Tab.2 Results of open-field test of rats in each groups（±s） 分

表2 3組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）Tab.2 Results of open-field test of rats in each groups（±s） 分

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) 垂直活動(dòng)得分 水平活動(dòng)得分造模后 干預(yù)后 造模后 干預(yù)后空白對照組 10 12.20±2.10 11.90±1.66 38.20±2.65 38.60±2.17模型組 10 9.10±1.37* 7.70±1.89 30.40±2.46*27.40±3.75腹部推拿組 10 9.30±1.76* 9.40±1.71#30.60±2.59*30.80±2.20#

3.3 實(shí)驗(yàn)大鼠胃黏膜損傷程度觀察 與空白對照組比較，模型組大鼠胃黏膜出現(xiàn)較嚴(yán)重的肉眼可見的損傷，胃黏膜呈粉紅色，腺區(qū)充血、紅腫，伴有點(diǎn)狀及長短不一的條狀出血壞死，而腹部推拿組大鼠胃黏膜損傷面積和出血面積明顯減小。見圖1。

圖1 胃黏膜損傷程度觀察Fig.1 Observation on the degree of gastric mucosal injury

3.4 實(shí)驗(yàn)大鼠胃黏膜組織病理學(xué)觀察 空白對照組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)完整，腺體清晰，未見明顯損傷及炎癥反應(yīng)。模型組大鼠胃黏膜損傷明顯，腺體正常結(jié)構(gòu)消失，并可見侵犯黏膜全層的病變，在黏膜下層出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤。腹部推拿組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞和腺體可見破壞，但部位較淺，炎癥反應(yīng)較少。見圖2。

圖2 胃組織HE染色結(jié)果（×100）Fig.2 HE staining results of gastric tissue(×100)

3.5 腹部推拿對實(shí)驗(yàn)大鼠胃黏膜炎性因子分泌的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠胃黏膜TNF-α、IL-6的分泌量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，腹部推拿組大鼠胃黏膜TNF-α、IL-6的分泌量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

3.6 腹部推拿對實(shí)驗(yàn)大鼠胃黏膜EGF含量的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠胃黏膜中EGF含量顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，腹部推拿組大鼠胃黏膜中EGF含量顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表3 3組大鼠胃黏膜EGF含量檢測結(jié)果（±s）Tab.3 Results of EGF content in gastric mucosa of rats in each groups（±s）ng/L

表3 3組大鼠胃黏膜EGF含量檢測結(jié)果（±s）Tab.3 Results of EGF content in gastric mucosa of rats in each groups（±s）ng/L

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) 胃黏膜EGF含量空白對照組 10 4 507.68±114.44模型組 10 3 495.51±71.85*腹部推拿組 10 4 147.87±124.12#

4 討論

胃黏膜損傷性疾病臨床表現(xiàn)主要以胃脘部疼痛不適，可伴隨噯氣、泛酸、胃脘燒灼感等癥狀，屬中醫(yī)學(xué)中“胃脘痛”的范疇。腹部推拿作為中醫(yī)推拿學(xué)中的一個(gè)重要分支，其作用于腹部，通過力學(xué)刺激直接調(diào)理脾胃臟腑及腹部循行經(jīng)脈，在治療以胃腸為主的消化系統(tǒng)疾病中療效顯著?！独逭茨σg(shù)》曰：“胸腹者，五臟六腑之官城，陰陽氣血之發(fā)源，若欲其臟腑如何，則莫如診胸腹?！斌w現(xiàn)了腹部與五臟六腑的密切關(guān)系?！吨笁函煼ā芬粫懈侵赋觥案篂槿f病機(jī)”，并認(rèn)為按摩腹部對于治療疾病深有影響。同時(shí)胃經(jīng)、脾經(jīng)循行均經(jīng)過腹部，雖然為腹部推拿治療胃黏膜損傷性疾病提供了中醫(yī)理論基礎(chǔ)，但仍缺乏相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究對其療效進(jìn)行驗(yàn)證。

現(xiàn)代研究表明，胃黏膜損傷的發(fā)生是胃黏膜攻擊因子與防御因子失調(diào)所致[8-9]。攻擊因子主要包括胃酸及白介素、TNF、胃蛋白酶等；防御因子主要有胃黏膜EGF、一氧化氮及前列腺素等[10]。調(diào)節(jié)攻擊因子和防御因子的平衡是治療胃黏膜損傷類疾病的關(guān)鍵。無水乙醇灌胃法復(fù)制胃黏膜損傷大鼠模型的病變特點(diǎn)、潰瘍外形、病理組織學(xué)特點(diǎn)、修復(fù)、愈合、復(fù)發(fā)過程與人胃黏膜損傷類似，且制作方便，重復(fù)性高，尤其適用于胃黏膜損傷相關(guān)機(jī)制研究[11]。故本研究采用無水乙醇灌胃法復(fù)制胃黏膜損傷大鼠模型，造模成功后從行為學(xué)、解剖學(xué)、病理學(xué)等方面觀察腹部推拿對胃黏膜損傷的修復(fù)作用，同時(shí)檢測胃黏膜炎性因子和EGF含量，進(jìn)一步探討腹部推拿促進(jìn)胃黏膜損傷修復(fù)的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，造模后大鼠出現(xiàn)了明顯的扭體反應(yīng)，并且在曠場實(shí)驗(yàn)中的垂直活動(dòng)得分和水平活動(dòng)得分均減少。予腹部推拿干預(yù)后，模型大鼠扭體反應(yīng)及曠場實(shí)驗(yàn)得分均有改善，證明了腹部推拿可以改善胃黏膜損傷大鼠的異常行為學(xué)改變。通過對實(shí)驗(yàn)大鼠胃黏膜組織解剖學(xué)及病理學(xué)觀察，結(jié)果顯示，造模后實(shí)驗(yàn)大鼠胃黏膜出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的肉眼可見的損傷，并且從病理學(xué)方面可以觀察到胃黏膜腺體正常結(jié)構(gòu)消失，黏膜下層出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤等病理改變；而經(jīng)過腹部推拿干預(yù)后，胃黏膜損傷程度均有明顯改善，證明了腹部推拿可以促進(jìn)胃黏膜損傷的修復(fù)。經(jīng)對胃黏膜損傷部位進(jìn)行總蛋白提取，并分析關(guān)鍵攻擊因子TNF-α、IL-6和防御因子EGF的變化，結(jié)果顯示，造模后TNF-α、IL-6的分泌量明顯升高，EGF明顯降低；而腹部推拿干預(yù)后，TNF-α和IL-6分泌量均有所降低，同時(shí)EGF明顯升高，初步表明了腹部推拿促進(jìn)胃黏膜修復(fù)的作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)胃黏膜攻擊因子和防御因子的平衡來實(shí)現(xiàn)的。但是胃黏膜損傷性疾病在發(fā)病過程中攻擊因子和防御因子種類繁多，且相互作用，而腹部推拿的調(diào)節(jié)機(jī)制，仍有待進(jìn)一步深入研究。