姜應(yīng)傳 陳炳 鄔嘉波 王婕 張小榮

膀胱癌是泌尿系最常見的惡性腫瘤，全世界每年約有54.9萬例新發(fā)病例，約20萬例患者死于膀胱癌，且發(fā)病率和病死率仍在不斷上升[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，一些長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）作為基因表達(dá)的重要調(diào)控因子，參與調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程[2]。母系表達(dá)基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）是最早被發(fā)現(xiàn)具有抑癌作用的lncRNA之一，在多數(shù)腫瘤中呈低表達(dá)或表達(dá)缺失，而啟動子超甲基化可能是導(dǎo)致其低表達(dá)的原因之一[3]。本研究使用不同濃度的DNA甲基化特異性抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine，5-Aza-CdR）作用人膀胱癌T24細(xì)胞，檢測MEG3啟動子甲基化程度、MEG3 mRNA表達(dá)和細(xì)胞凋亡情況，進而探討5-Aza-CdR對MEG3啟動子超甲基化逆轉(zhuǎn)及膀胱癌細(xì)胞凋亡的作用。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 人膀胱癌細(xì)胞系T24購自上海生工細(xì)胞庫。FBS（批號：11011-8611）購自杭州四季青生物公司，胰蛋白酶（批號：25200114）、DMEM 培養(yǎng)基（批號：11995065）均購自美國 Gibco公司；5-Aza-CdR（批號：A3656）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO；批號：D2650）均購自美國Sigma公司；QIAmp DNA Mini Kit試劑盒（批號：51304）、EpiTect Bisulfite Kit（批號：59104）、EpiTect MSP Kit試劑盒（批號：59496）均購自德國Qiagen公司；熒光定量試劑盒（批號：A6001）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：A5001）均購自美國 Promega公司；Hoechst33258試劑盒（批號：C1011）購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Annexin V PE/7-AAD凋亡試劑盒（批號：559763）購自美國BD生物科學(xué)公司，各引物購自上海生工生物工程公司。

1.2 藥物配置 5 mg 5-Aza-CdR溶于DMSO中，配制成濃度為2.2×105μmol/L的母液，置于-20°C冰箱內(nèi)儲存；用 DMEM 培養(yǎng)基配制濃度為 0、2.5、10 μmol/L 的5-Aza-CdR培養(yǎng)液，同時用DMEM培養(yǎng)基配制濃度為0、2.5、10 μmol/L 的 DMSO 培養(yǎng)液，于 4 °C 保存。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人膀胱癌T24細(xì)胞用10%FBS+DMEM培養(yǎng)基，于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1～2 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞生長至90%以上時，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.4 MEG3啟動子甲基化程度檢測 采用甲基化特異性PCR法。T24細(xì)胞按1.0×105個/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，實驗組加入濃度為 0、2.5、10 μmol/L的5-Aza-CdR培養(yǎng)液，對照組加入濃度為0、2.5、10 μmol/L的DMSO培養(yǎng)液，分別作用3 d。收集細(xì)胞，按照 QIAmp DNA Mini Kit、EpiTect Bisulfite Kit試劑盒說明書進行基因組DNA提取和亞硫酸鹽修飾。MEG3基因甲基化特異性引物序列如下，甲基化引物：正向5'-GTT AGTAATCGGGTTTGTCGGC-3'，反向 5'-AATCATAACTCCGAACACCCGCG-3'；非甲基化引物：正向5'-GAGGATGGTTAGTTATTGGGG T-3'，反向 5'-CCA CCATAACCAACACCCTATAATCACA-3'。按EpiTectMSP Kit試劑盒說明書在PCR擴增儀（MyCycler，美國Bio-Rad公司）上進行甲基化特異性PCR。擴增反應(yīng)總體系50 μl，其中EpiTect Master Mix 25 μl（1×）、primer A 2 μl（0.4 μmol/L）、primer B 2 μl（0.4 μmol/L）、模板DNA（＜200 ng/50 μl）、RNase free dH2O 補足至 50 μl。擴增條件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物于2.5%瓊脂糖凝膠電泳后觀察，使用凝膠成像儀（Universal HoodⅡ，美國Bio-Rad公司）攝像。出現(xiàn)甲基化條帶而未出現(xiàn)非甲基化條帶提示超甲基化，而非甲基化條帶越清晰代表甲基化程度越低。

1.5 MEG3 mRNA表達(dá)檢測 采用RT-qPCR法。T24細(xì)胞按1.0×105個/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入濃度為 0、2.5、10 μmol/L 的 5-Aza-CdR 培養(yǎng)液作用3 d。使用Trizol試劑提取總RNA，將提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增。MEG3引物序列：正向5'-CTGCCCATCTACACCTCACG-3'，反向 5'-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3'。每個待測樣品設(shè)置3個平行復(fù)孔，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參。PCR體系：10 μl 2×SYBR Premix Ex Taq；1 μl Reverse Primer；5.2 μl RNase Free dH2O；4 μl cDNA；0.2 μl DyeⅡ；1 μl Forward Primer。在RT-qPCR儀（7500 fast Real-Time PCR system，美國ABI公司）上進行反應(yīng)。反應(yīng)程序：95℃2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，60℃ 60 s，40個循環(huán)。記錄 Ct值，采用2－ΔΔCt方法計算MEG3 mRNA相對表達(dá)量。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測 （1）采用Hoechst33528核染色法。在6孔板中配置2 ml密度為2×104個/ml的T24細(xì)胞懸液，加入 0、2.5、10 μmol/L 的 5-Aza-CdR 培養(yǎng)液作用3 d。用0.1%多聚甲醛固定30 min，PBS洗5 min；加入Hoechst33258 染色液（1：1 000）避光作用 10 min；置于熒光顯微鏡（LSM800，德國Zeiss公司）下，在波長340 nm處進行觀察。在熒光顯微鏡下，存活細(xì)胞呈彌散均勻熒光，凋亡細(xì)胞在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光。（2）采用流式細(xì)胞術(shù)。T24細(xì)胞按1.0×105個/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入濃度為0、2.5、10 μmol/L的5-Aza-CdR作用3 d。將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個/ml，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1次，再用冷的鹽酸緩沖液洗滌1次，1 000 r/min離心5 min；棄上清液，收集細(xì)胞，加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞；再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清液；用去離子水按 1:3稀釋結(jié)合緩沖液（4 ml 4×結(jié)合緩沖液+12 ml去離子水）；用1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106個/ml；取100 μl細(xì)胞懸液于5 ml流式管中，加入 5 μl Annexin V PE混勻后于室溫避光孵育5 min；加入10 μl 20 mg/L的 7-AAD、400 μl PBS，立刻使用流式細(xì)胞儀（FACSVia，美國BD公司）進行檢測。凋亡率=早期凋亡率（右下象限）+晚期凋亡率（右上象限）；實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Graphpad Prism 7.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同藥物作用后T24細(xì)胞MEG3啟動子甲基化程度比較 對照組出現(xiàn)清晰的M帶（甲基化條帶）未出現(xiàn)U帶（非甲基化條帶），提示對照組MEG3啟動子發(fā)生超甲基化；實驗組隨5-Aza-CdR濃度的增加逐漸出現(xiàn)清晰的U帶，MEG3啟動子甲基化程度隨著5-Aza-CdR濃度增加而下降，見圖1。

圖1 不同藥物作用后T24細(xì)胞母系表達(dá)基因3（MEG3）啟動子甲基化程度比較

2.2 不同濃度5-Aza-CdR作用后T24細(xì)胞MEG3 mRNA表達(dá)比較 0、2.5、10 μmol/L 5-Aza-CdR作用T24細(xì)胞后MEG3 mRNA相對表達(dá)量分別為1.00±0.00、3.17±0.14、6.73±0.57，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=73.43，P＜0.05），且MEG3 mRNA相對表達(dá)量隨著5-Aza-CdR濃度增加而增加（均P＜0.05）。

2.3 不同濃度5-Aza-CdR作用后T24細(xì)胞凋亡情況比較 在熒光顯微鏡下，0 μmol/L組T24細(xì)胞形態(tài)基本正常，2.5 μmol/L 組、10 μmol/L 組 T24細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，表現(xiàn)為熒光集中，核固縮、分解等形態(tài)，見圖2（插頁）。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，0、2.5、10 μmol/L 5-Aza-CdR作用T24細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率分別為（0.34±0.05）%、（11.49±0.36）%、（17.53±2.03）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=53.28，P＜0.05），且 T24細(xì)胞凋亡率隨著 5-Aza-CdR濃度增加而升高（均P＜0.05），見圖3（插頁）。

圖2 不同濃度5-氮雜-2-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）作用后T24細(xì)胞凋亡情況（Hoechst33528核染色，×200）

圖3 不同濃度5-氮雜-2-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）作用后T24細(xì)胞凋亡情況（流式細(xì)胞術(shù)）

3 討論

膀胱癌的演化和進展與多種癌基因及抑癌基因異常表達(dá)有關(guān)[4]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)重要的調(diào)控過程之一，可以直接改變其表觀遺傳學(xué)內(nèi)容或使基因發(fā)生突變，導(dǎo)致抑癌基因“靜默”，從而導(dǎo)致腫瘤惡性轉(zhuǎn)化[5]。目前已在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)MEG3啟動子存在異常甲基化的CpG島（胞嘧啶C和鳥嘌呤G富集的區(qū)域），而且這種改變可能與MEG3表達(dá)降低有關(guān)[3，6]。另有研究發(fā)現(xiàn)，MEG3在多種腫瘤中通過調(diào)控不同信號通路發(fā)揮抑癌作用，比如在非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌中，MEG3可以通過激活p53引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡[7]。而5-Aza-CdR是已知最強的DNA甲基化特異性抑制劑，能抑制DNA甲基化。研究表明，去甲基化可誘導(dǎo)MEG3重新活化和表達(dá)[8]。故本研究使用不同濃度5-Aza-CdR作用人膀胱癌T24細(xì)胞，以探討其對MEG3啟動子超甲基化逆轉(zhuǎn)及膀胱癌細(xì)胞凋亡的作用。

本研究檢測MEG3啟動子甲基化程度發(fā)現(xiàn)，對照組、0 μmol/L 5-Aza-CdR組T24細(xì)胞均呈現(xiàn)超甲基化狀態(tài)，同時MEG3啟動子甲基化程度隨著5-Aza-CdR濃度增加而下降。這說明在膀胱癌細(xì)胞中存在MEG3啟動子甲基化，而5-Aza-CdR能夠逆轉(zhuǎn)膀胱癌細(xì)胞中MEG3啟動子甲基化，其原理可能是5-Aza-CdR通過共價結(jié)合DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的方式來抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性，從而抑制MEG3啟動子甲基化效應(yīng)，使其呈去甲基化狀態(tài)。本研究繼續(xù)采用RT-qPCR檢測MEG3 mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR作用后T24細(xì)胞恢復(fù)MEG3 mRNA表達(dá)，且相對表達(dá)量隨著5-Aza-CdR濃度增加而增加。這間接表明MEG3基因表達(dá)下調(diào)歸因于其啟動子超甲基化。相關(guān)研究表明，MEG3表達(dá)與腫瘤的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，MEG3在許多惡性腫瘤中發(fā)揮著抑癌作用[9]。為了明確MEG3恢復(fù)表達(dá)后對膀胱癌細(xì)胞產(chǎn)生何種效果，本研究進一步采用Hoechst33528核染色法和流式細(xì)胞術(shù)檢測T24細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR作用后T24細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，且隨著5-Aza-CdR濃度增加而凋亡程度更明顯。

綜上所述，5-Aza-CdR可能通過逆轉(zhuǎn)膀胱癌細(xì)胞中MEG3啟動子超甲基化狀態(tài)來恢復(fù)MEG3 mRNA表達(dá)，進而誘發(fā)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，但具體分子機制有待進一步研究證實。