李萬芳，宋 健，李 潔

（1. 山東協(xié)和學院，山東 濟南 250109；2. 山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355；3. 山東中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，山東 濟南 250355）

北蟲草（Cordyceps militaris）是一種藥食兩用真菌。研究表明，北蟲草主要含有蟲草素、腺苷等多種核苷、蟲草多糖、氨基酸和無機元素的化學成分。蟲草素作為蟲草主要活性組分之一，其抗腫瘤效果已較早被證實，可延長 S180 荷瘤小鼠的存活時間，對腫瘤生長有一定抑制作用[1]。藥理研究表明，北蟲草有抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、增強免疫、抑菌抗病毒等多種生理功能，但是北蟲草有效部位的分離純化困擾著產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，因此開展北蟲草抗腫瘤有效部位研究有重要意義。

本實驗采用系統(tǒng)溶劑法，按照極性高低對北蟲草進行依次提取，制備得到了水、正丁醇、乙酸乙酯和石油醚4個提取部位，以乳腺癌MCF-7細胞株、食管癌ECA-109細胞株和肺癌A549細胞株為研究對象，用MTT法觀察4個部位對腫瘤細胞的影響，檢測其對MCF-7細胞、ECA-109細胞和A549細胞的抑制作用，為探討北蟲草不同極性部位的抗腫瘤作用提供實驗依據(jù)，為北蟲草的進一步有效開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 儀器、試劑和細胞株

1.1 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（BB16UV/BB5060UV，HERAEUS）；酶標儀（Multiskan MK3，Thermo Scientific）；立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-50FBS，上海申安醫(yī)療器械廠）；超低溫冰箱（U410-86型）（Thermo Scientific）；臺式離心機（H3，Sigma）；雙人單面凈化工作臺（SW-CJ-1C，蘇州凈化設(shè)備有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（101，上海鵬順科學儀器有限公司）；水浴恒溫振蕩器（SHZ-82，金壇市醫(yī)療儀器廠）；倒置顯微鏡（XDS-1B，重慶光學儀器廠）；微量移液器（Gilson，Eppendorf）；細胞培養(yǎng)瓶（Corning）；96孔細胞培養(yǎng)板（Costar，USA）。

1.2 試劑

胎牛血清（以色列Bioind）；胰酶細胞消化液（碧云天）；二甲基亞砜（DMSO，美國Amersco公司）；甲基噻唑藍（MTT，美國Amresco公司）；1640細胞培養(yǎng)基（Hyclone，賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司）；青霉素鏈霉素混合液雙抗；注射用順鉑（齊魯制藥有限公司）。

1.3 材料

取北蟲草粉末，置入燒瓶，加入6倍量的石油醚（60～90 ℃）浸泡過夜，超聲提取2次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓（60 ℃，0.1 MPa）回收溶劑，真空干燥（60 ℃，0.1 MPa），得黃色黏稠油狀物石油醚提取部位備用；濾渣揮干溶劑，依次換用乙酸乙酯、正丁醇、蒸餾水等溶劑替換石油醚重復上述工藝步驟，制備北蟲草不同極性部位，其中乙酸乙酯部位為棕黃色黏稠狀，正丁醇和水提取部位均為棕褐色。

1.4 細胞株

乳腺癌MCF-7細胞株、食管癌ECA-109細胞株、肺癌A549細胞株（山東省立醫(yī)院）。

2 方法與結(jié)果

2.1 北蟲草不同極性部位的制備

精密稱取“1.3”項各提取部位，分別配制質(zhì)量濃度為1，10，50，100 μg/ml樣品液，待用。

2.2 細胞接種及培養(yǎng)

采用貼壁培養(yǎng)法，當腫瘤細胞生長至80 %融合時，消化制成單細胞懸液，接種于96孔板中，置入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。調(diào)零孔不加腫瘤細胞，調(diào)零組和空白對照組分別加入100 μl不含血清的1640培養(yǎng)基，陽性對照組加入10 μg/ml順鉑，其他給藥組每孔分別加入含篩選藥物終濃度依次為1，10，50，100 μg/ml的1640培養(yǎng)基100 μl。將細胞置入二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.3 細胞存活率的測定

采用MTT法檢測北蟲草不同極性提取部位對乳腺癌MCF-7細胞、食管癌ECA-109細胞、肺癌A549細胞的生長抑制作用。

向每孔中加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出96孔板，吸去孔內(nèi)上清，每孔分別加入DMSO 100 μl，放入酶標儀中并于490 nm波長處測定各孔的光密度值（OD值）。

按如下公式計算細胞存活率：

2.4 統(tǒng)計學分析

使用SPSS19.0軟件對實驗所得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。試驗結(jié)果以±s表示，采用組間t檢驗進行處 理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.5 細胞形態(tài)變化結(jié)果

實驗過程中細胞形態(tài)變化見圖1～4（以食管癌ECA-109細胞株為例）。

圖1 加藥之前食管癌ECA-109細胞株形態(tài)

圖2 加入順鉑24 h后食管癌ECA-109細胞株形態(tài)

圖3 加入石油醚100 μg/ml組24h后食管癌ECA-109細胞株形態(tài)

圖4 加入乙酸乙酯50 μg/ml組24 h后食管癌ECA-109細胞株形態(tài)

2.6 腫瘤細胞的存活率結(jié)果

不同腫瘤細胞在北蟲草不同極性部位的不同藥物濃度下的存活率結(jié)果見表1。

表1 北蟲草不同藥物濃度對腫瘤細胞存活率的影響（/%，±s，n＝6）

表1 北蟲草不同藥物濃度對腫瘤細胞存活率的影響（/%，±s，n＝6）

注：*P＜0.05 vs空白對照組

組別 MCF-7細胞 ECA-109細胞 A549細胞石油醚部位1 μg/ml 97.81±0.0838 106.14±0.0708 99.12±0.0386石油醚部位10 μg/ml 100.33±0.0997 97.72±0.0671 98.24±0.0595石油醚部位50 μg/ml 76.45±0.1127 73.56±0.0930* 83.27±0.0822石油醚部位100 μg/ml 63.57±0.1015* 54.24±0.0392* 69.14±0.0574*乙酸乙酯部位1 μg/ml 95.62±0.0689 104.02±0.0744 102.93±0.0585乙酸乙酯部位10 μg/ml 92.97±0.0727 84.95±0.0669 97.47±0.0631乙酸乙酯部位50 μg/ml 72.69±0.0931* 72.77±0.0896* 82.10±0.0538乙酸乙酯部位100 μg/ml 86.60±0.0889 74.67±0.1246* 89.91±0.0983正丁醇部位1 μg/ml 100.58±0.0880 105.48±0.1088 103.71±0.0336正丁醇部位10 μg/ml 124.92±0.1162 99.62±0.1122 108.84±0.0441正丁醇部位50 μg/ml 96.96±0.1035 101.49±0.0818 98.42±0.0473正丁醇部位100 μg/ml 96.93±0.1052 87.59±0.0595 101.21±0.0573水提取部位1 μg/ml 88.74±0.0479 114.86±0.0961 76.58±0.0383*水提取部位10 μg/ml 88.02±0.0348 116.71±0.0933 89.24±0.0507水提取部位50 μg/ml 79.61±0.0609 113.92±0.1329 73.88±0.0365*水提取部位100 μg/ml 83.58±0.0434 107.62±0.1051 83.11±0.0863順鉑10 μg/ml 66.13±0.0757* 80.11±0.0984* 70.14±0.0462*

由表1可見，不同腫瘤細胞在北蟲草不同極性部位的不同藥物濃度下的存活率有所差別，表明北蟲草不同極性部位的不同藥物濃度對不同腫瘤細胞的抑制作用不同。就北蟲草石油醚部位抑制食管癌ECA-109腫瘤細胞作用來說，除1 μg/ml濃度未顯示對食管癌ECA-109腫瘤細胞的抑制作用外，其他濃度均有一定程度的抑制作用。乙酸乙酯部位50，100 μg/ml濃度和石油醚部位50，100 μg/ml濃度時，對食管癌ECA-109腫瘤細胞的抑制率較強；石油醚部位100 μg/ml濃度時，對乳腺癌MCF-7腫瘤細胞、肺癌A549腫瘤細胞的抑制率較強。

3 討論

實驗結(jié)果表明，北蟲草石油醚部位和乙酸乙酯部位對受試細胞具有一定的抑制作用，其他不同極性部位對受試細胞作用不明顯。

李萬芳等[2]對山東北蟲草石油醚提取部位進行GC-MS分析，北蟲草石油醚提取部位中亞油酸相對含量高達63.28 %。另有研究表明[3]，二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）能激活Caspase-3和Bax表達，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達，從而誘導食管癌細胞凋亡，且與濃度呈正比，本實驗證實了這一點。許多不飽和脂肪酸除了能殺傷腫瘤細胞外，還能參與體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)[4]。袁宏莉等[5]研究表明，添加ω-3多不飽和脂肪酸（ω-3PUFA）患者的營養(yǎng)學指標和免疫功能指標水平高于對照組患者，表明不飽和脂肪酸有利于改善患者的免疫功能。提示可進一步研究北蟲草中不飽和脂肪酸的具體成分，全面評估北蟲草的抗腫瘤效果，充分挖掘其在疾病治療方面的價值。

宛玉祥等[6]研究表明，雪峰蟲草乙酸乙酯部位含有麥角甾醇（5.16 %）。據(jù)報道[7-9]，麥角甾醇對MCF-7乳腺癌細胞瘤系等4種癌細胞具有抗腫瘤活性。麥角甾醇抑制腫瘤細胞增殖機制可能與增高p21m RNA 和蛋白表達或通過抑制血管生長有關(guān)[10-11]。李潔等[12]研究發(fā)現(xiàn)，北蟲草乙酸乙酯部位對小鼠的適應(yīng)性免疫有促進作用，這個部位活性成分含有蟲草素，蟲草素的抗癌抑瘤效果已得到廣泛驗證。深入研究北蟲草乙酸乙酯部位的具體成分，確定其具有抗腫瘤活性的化學物質(zhì)，對于開發(fā)臨床藥品具有重要意義。

北蟲草為藥食兩用真菌，本實驗從藥效學角度考察了不同極性部位的抗腫瘤活性，為研發(fā)北蟲草臨床藥品提供了一定的實驗依據(jù)。