吳琳 張科 祖珍玉 陳潔 毛聿華 羅敏

1南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（廣州510515）；2中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科（廣州510000）

宮頸癌是全球第四大最常見(jiàn)女性惡性腫瘤［1］，其常規(guī)治療為手術(shù)結(jié)合放化療，但部分患者對(duì)治療存在抵抗能力，治療后仍出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的情況。腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的種子細(xì)胞［2-3］。針對(duì)宮頸癌干細(xì)胞的研究能更精準(zhǔn)靶向腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的種子細(xì)胞，從而改善難治性宮頸癌患者的預(yù)后情況。

分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（secreted frizzled related protein l，SFRPl）在結(jié)構(gòu)上與FZ 受體極為相似，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Wnt 分子或Fz 受體而直接抑制Wnt 通路［4-5］，SFRP1 在多種腫瘤組織（乳腺癌［6］、腎細(xì)胞癌［7］、結(jié)腸癌［8］、膀胱癌［9］等）中低表達(dá)，可抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Wnt 通路下游目的基因（如C-myc、CyclinD1 等）參與細(xì)胞生存、增殖和分化［10-11］，Wnt/β-catenin 通路在腫瘤中發(fā)揮維持腫瘤干細(xì)胞干性、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移等作用［12-13］。因此，SFRP1 可抑制Wnt/β-catenin 通路的激活，阻斷Wnt/β-catenin通路促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞發(fā)揮功能的作用。

有研究［14-15］發(fā)現(xiàn)SFRP1 在正常宮頸組織中表達(dá)明顯高于宮頸癌組織，敲除SFRP1 后，宮頸癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤惡性表型。但SFRP1 在宮頸癌干細(xì)胞中的表達(dá)情況及其如何調(diào)控Wnt 信號(hào)影響宮頸癌干細(xì)胞的功能尚不明確。故本研究通過(guò)體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證側(cè)群干細(xì)胞（side population cell，SP）具有腫瘤干細(xì)胞的能力；同時(shí)檢測(cè)SFRP1及Wnt 通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)及SFRP1 的表達(dá)水平，初步探討宮頸癌干細(xì)胞中SFRP1 對(duì)Wnt 通路的調(diào)控作用，為確定宮頸癌干細(xì)胞的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源人宮頸癌SiHa 細(xì)胞系，由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供。無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)BALB/c 裸鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，共10 只，4 ～5 周齡，雌性，體重為18 ～20 g。

1.2 主要試劑CCK8 試劑盒、Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基；EdU-594細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天；順鉑、紫杉醇為美國(guó)Abmole 公司產(chǎn)品；維拉帕米鹽酸鹽為美國(guó)Sigma Aldrich 公司產(chǎn)品；抗體SFRP1、β-catenin、C-myc、CyclinD1、β-actin 均購(gòu)自美國(guó)proteintech 公司，二抗購(gòu)自弗德生物。

1.3 細(xì)胞分組及處理將SP細(xì)胞及非側(cè)群干細(xì)胞（non side population cell，NSP）接種于培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基后PBS 洗滌后，加入無(wú)血清腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)基刺激24 h，分為空白對(duì)照組、紫杉醇組、順鉑組、放療組。其中空白對(duì)照組為后續(xù)不予處理；紫杉醇組為加入紫杉醇（2.5 nmol/L）處理48 h；順鉑組為加入順鉑（50 mol/L）處理48 h；放療組為經(jīng)直線加速放射線照射相應(yīng)劑量射線后48 h。

1.4 流式分選側(cè)群干細(xì)胞制備SiHa 細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1 × 106/mL，預(yù)熱細(xì)胞至37 ℃后分為兩組。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均加入Hoechst33342 5 g/mL，37 ℃水浴中避光標(biāo)記90 min。同時(shí)對(duì)照組中加入維拉帕米50 mol/mL。標(biāo)記后于冰浴中終止染色，預(yù)冷PBS 洗滌2 次。再向兩組中加入PI，隨后上機(jī)分選。

1.5 EDU 法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平將各組細(xì)胞接種于96 孔板中，1 000/孔，處理后，10 mol/L EDU 染色孵育2 h；取出進(jìn)行洗滌、固定、通透，按照說(shuō)明書(shū)配制Click 反應(yīng)溶液進(jìn)行Click 點(diǎn)擊反應(yīng)，再次洗滌后用hoechst33342 染細(xì)胞核，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力將各組細(xì)胞接種于6 孔板中，接種細(xì)胞數(shù)目為50 ～3 000/孔，處理后，繼續(xù)培養(yǎng)，4 d 更換一次培養(yǎng)基，接種14 d 后，洗滌、固定、染色，隨后用數(shù)碼照相機(jī)拍照。

1.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將10 只裸鼠隨機(jī)分為兩組，每組5 只，在裸鼠5 周齡時(shí)，將SP 及NSP 細(xì)胞的密度調(diào)整至1 × 107/mL，每只裸鼠腹股溝皮下接種腫瘤細(xì)胞0.1 mL，接種后定期觀察裸鼠，待觸摸到實(shí)體瘤形成后，每7 天測(cè)量1 次，并記錄移植瘤的最長(zhǎng)徑（L）和最短徑（W），計(jì)算腫瘤體積，腫瘤體積=L×W2/2，繪制裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線，在接種第35 天處死裸鼠，剝除移植瘤，測(cè)量移植瘤大小并稱(chēng)重。

1.8 蛋白印跡法（WB）檢測(cè)細(xì)胞蛋白的表達(dá)提取各組細(xì)胞的蛋白并測(cè)定蛋白濃度；按照30 g 蛋白上樣，電泳轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，相應(yīng)抗體4 ℃孵育過(guò)夜；次日洗滌后二抗室溫孵育1 h 后再次洗滌；運(yùn)用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法的發(fā)光液顯影，以β-actin 作為內(nèi)參照，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞分泌SFRP1 水平加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品后37 ℃孵育2 h；棄去液體，加生物素標(biāo)記抗體工作液，37 ℃孵育1 h；洗板后加HRP 標(biāo)記親和素工作液，37 ℃孵育1 h；洗板后加底物溶液，37 ℃孵育15 min；加終止液，終止反應(yīng)5 min 內(nèi)用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處的光密度值。

1.10 免疫熒光檢測(cè)β-catenin的表達(dá)及細(xì)胞亞定位情況取出樣品，洗滌后4%多聚甲醛固定15 min；洗滌后0.3%TritonX-100通透10 min，洗滌后山羊血清封閉液封閉60 min；加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜。次日洗滌后加入熒光染料標(biāo)記的二抗避光孵育90 min；洗滌后DAPI 核染色劑避光孵育10 min，洗滌后加入防熒光淬滅劑。熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式分選SP 細(xì)胞和NSP 細(xì)胞在Hoechst Red-Hoechst Blue 散點(diǎn)圖中，標(biāo)記Hoechst33342 后，細(xì)胞呈現(xiàn)“鷹頭”形狀，鷹頭的“鷹嘴”部分代表SP細(xì)胞（圖1）。

圖1 流式分選SiHa 細(xì)胞中的SP 細(xì)胞和NSP 細(xì)胞Fig.1 Flow cytometric separation of SP cells and NSP cells in SiHa cells

2.2 SP及NSP細(xì)胞體內(nèi)外功能比較EDU實(shí)驗(yàn)證實(shí)SP 細(xì)胞的增殖率高于NSP 細(xì)胞［（22 ± 1）%vs.（13±3）%，P=0.017 1，圖2A、B］；克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SP 細(xì)胞的克隆形成率高于NSP 細(xì)胞［（51±7）%vs.（9±6）%，P=0.010 1，圖2C、D］；無(wú)血清成球?qū)嶒?yàn)在第2 天可見(jiàn)細(xì)胞分裂，有成球的趨勢(shì)，隨后細(xì)胞球逐漸長(zhǎng)大，至第10 天可見(jiàn)折光度好、中間密度高的致密球，發(fā)現(xiàn)SP 細(xì)胞的成球能力強(qiáng)于NSP細(xì)胞（圖2E）。SP 細(xì)胞的裸鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)速度明顯快于NSP，剝離腫瘤組織后測(cè)量其腫瘤重量，發(fā)現(xiàn)SP 細(xì)胞的腫瘤重量明顯重于NSP 細(xì)胞所形成的腫瘤［（913.6 ± 137.3）mgvs.（307.2 ± 36.5）mg，P=0.002 7，圖3］。

圖3 SP 細(xì)胞的裸鼠皮下成瘤能力明顯強(qiáng)于NSP 細(xì)胞Fig.3 The ability of SP cells to form subcutaneous tumors in nude mice in vivo is significantly stronger than that of NSP cells

圖2 SP 細(xì)胞增殖、克隆及成球能力強(qiáng)于NSP 細(xì)胞Fig.2 SP cells have stronger proliferation，cloning and spheronization ability than NSP cells

2.3 SP 和NSP 細(xì)胞的干性標(biāo)志物表達(dá)比較WB發(fā)現(xiàn)在運(yùn)用條件培養(yǎng)基刺激24 h 之后的SP 細(xì)胞中CD133、CD44、Nanog 的表達(dá)均強(qiáng)于NSP 細(xì)胞，而使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，SP 細(xì)胞與NSP 細(xì)胞在三個(gè)分子表達(dá)量上無(wú)明顯差異（圖4）。

圖4 SP 細(xì)胞及NSP 細(xì)胞的干性標(biāo)志物表達(dá)情況Fig.4 The expression of stemness markers in SP cells and NSP cells

2.4 放化療條件下SP 和NSP 細(xì)胞的增殖及克隆形成能力比較根據(jù)EDU 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用紫杉醇（2.5 nmol/L）、順鉑（50 μmol/L）、放射劑量8 Gy 處理時(shí)，SP 細(xì)胞的增殖率分別為（22±1）%、（62±2）%、（20±4）%，NSP 細(xì)胞增殖率分別為（13±3）%、（17± 9）%、（5 ± 1）%，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析后，不同處理組SP 細(xì)胞及NSP 細(xì)胞的增殖率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。見(jiàn)圖5。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)提示在經(jīng)過(guò)2、4、6、8 Gy放射劑量照射后，SP細(xì)胞的克隆形成率分別為（20 ± 3）%、（7 ± 1）%、（19.7 ± 1.9）‰、（5.2 ± 0.1）‰，而NSP 細(xì)胞的克隆形成率分別為（10±1）%、（2±0.3）%、（5.8±0.5）‰、（1.9±0.3）‰，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析后，發(fā)現(xiàn)在不同放射劑量照射后，SP細(xì)胞的克隆形成能力均明顯強(qiáng)于NSP 細(xì)胞（均P＜0.005）。見(jiàn)圖6。

圖6 放療時(shí)宮頸癌干細(xì)胞的克隆形成能力明顯強(qiáng)于非宮頸癌干細(xì)胞Fig.6 During radiotherapy，the cloning ability of cervical cancer stem cells is significantly stronger than that of non-cervical cancer stem cells

圖5 放化療條件下SP 細(xì)胞與NSP 細(xì)胞增殖能力變化Fig.5 Changes in the proliferation ability of SP cells and NSP cells under radiotherapy and chemotherapy

2.5 SFRP1 在細(xì)胞內(nèi)外的水平WB 提示SFRP1在SP 細(xì)胞明顯高于NSP 細(xì)胞（圖7）；ELISA 發(fā)現(xiàn)SiHa-NSP 細(xì)胞的SFRP1 蛋白分泌水平明顯高于SiHa-SP 細(xì)胞［（66.47±3.60）pg/mLvs.（6.75±0.45）pg/mL，P＜0.000 1），說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)的SFRP1表達(dá)水平與SFRP1 的分泌并不呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。

圖7 SP 細(xì)胞及NSP 細(xì)胞SFRP1 在細(xì)胞內(nèi)外的水平Fig.7 The levels of SFRP1 in SP cells and NSP cells inside and outside the cell

2.6 Wnt/β-catenin 通路激活情況WB 結(jié)果顯示β-catenin、C-myc、Cyclin D1 在SP 細(xì)胞中的表達(dá)水平均高于NSP 細(xì)胞；免疫熒光發(fā)現(xiàn)Wnt 通路發(fā)揮關(guān)鍵作用的β-catenin 在SP 細(xì)胞中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)，而在NSP 細(xì)胞的β-catenin 主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)（圖8）。

圖8 SP 細(xì)胞中Wnt/β-catenin 通路明顯激活Fig.8 Wnt/β-catenin signaling pathway is obviously activated in SP cells

3 討論

難治性宮頸癌在經(jīng)過(guò)常規(guī)治療后仍易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等預(yù)后不良的情形，完成同步放化療后，局部晚期宮頸癌婦女的5年總存活率約為70%，而僅限于子宮頸或上陰道的復(fù)發(fā)性宮頸癌是可能治愈的［2］。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)認(rèn)為宮頸癌干細(xì)胞是腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的種子細(xì)胞［2］。根據(jù)運(yùn)用流式分選從細(xì)胞株中分離出SP 細(xì)胞的方法［16］，本研究從宮頸癌細(xì)胞中分選出的SP 細(xì)胞經(jīng)過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)基刺激后，從體內(nèi)外功能、分子生物學(xué)多角度驗(yàn)證了其干細(xì)胞特性。

本研究對(duì)SP 細(xì)胞及NSP 細(xì)胞在經(jīng)過(guò)放射或化療藥物的處理后，SP 細(xì)胞具有更明顯的惡性表型，說(shuō)明宮頸癌干細(xì)胞對(duì)放化療的抵抗能力強(qiáng)于非宮頸癌干細(xì)胞，與前人研究結(jié)果一致［17-18］。宮頸癌干細(xì)胞不能被常規(guī)治療完全消滅，繼而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，因此，進(jìn)一步研究其具體機(jī)制對(duì)于改善難治性宮頸癌患者預(yù)后具有重要意義。

SFRP1 在宮頸癌組織中的表達(dá)明顯低于正常宮頸組織［14］，敲低SFRP1 的表達(dá)后，Wnt 通路促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展［15］。但本研究卻發(fā)現(xiàn)SP 細(xì)胞中Wnt/β-catenin 通路與SFRP1 的表達(dá)趨勢(shì)具有一致性。為了明確其中的原因，結(jié)合細(xì)胞分泌SFRP1阻礙Wnt與FZ受體結(jié)合，從而阻斷Wnt/β-catenin通路激活這一現(xiàn)象［19］，本研究發(fā)現(xiàn)SP 細(xì)胞的SFRP1分泌水平明顯低于NSP 細(xì)胞，由此得出SP 細(xì)胞的SFRP1 分泌水平下降，可能解除其對(duì)Wnt/β-catenin通路的抑制作用，促進(jìn)Wnt/β-catenin 通路激活。

綜上所述，宮頸癌干細(xì)胞可能通過(guò)抑制SFRP1分泌來(lái)促進(jìn)Wnt/β-catenin 通路激活宮頸癌干細(xì)胞的功能，使其具有更強(qiáng)的增殖、克隆形成、放化療抵抗及皮下成瘤能力。因此，進(jìn)一步探討SFRP1對(duì)于宮頸癌干細(xì)胞的具體作用，需觀察SFRP1 基因過(guò)表達(dá)或沉默后，宮頸癌干細(xì)胞的體內(nèi)外生物學(xué)行為變化；闡明宮頸癌干細(xì)胞中抑制SFRP1 分泌至細(xì)胞外的具體機(jī)制，由此設(shè)計(jì)相關(guān)靶向藥物達(dá)到抑制宮頸癌干細(xì)胞的作用。