高文慧 吳錦俊 簡曉順 賈小婷 李靖

廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院1藥學部，4泌尿外科（廣州510095）；2廣州中醫(yī)藥大學國際中醫(yī)藥轉化醫(yī)學研究所（廣州510006）；3廣州醫(yī)科大學腫瘤研究所（廣州510095）

肝癌在我國是第4 位常見惡性腫瘤及第2 位腫瘤致死病因［1］，早期手術可延長生存期。但肝癌的早期檢出率低，多數(shù)患者確診時已為晚期，需要進行全身治療。目前，靶向藥物治療已成為肝癌治療的主要手段之一，但該類藥物種類少，療效不佳，如何提高這些藥物的抗腫瘤效果已成為研究肝癌治療的熱點和難點。

索拉非尼（sorafenib，SRF）是多靶點酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI），是中晚期肝癌患者一線治療藥物，但其無進展生存期僅為167 d，預后不理想。同時，由于索拉非尼不良反應較多，嚴重時需停藥或減量，影響其臨床療效［2-3］。納米技術為解決上述問題提供了有效策略：納米藥物顆粒小、比表面積大、有腫瘤靶向性［4］，能增強療效、降低毒性和優(yōu)化體內藥物行為［5-6］。MO 等［7］制備的索拉非尼長循環(huán)脂質體具有顯著的抗乳腺癌細胞活性。ZHANG 等［8］制備脂質包被的索拉非尼納米晶，可將腫瘤組織中藥物濃度提高近15 倍。MARIA 等［9］制備的索拉非尼固體脂質納米粒同樣提高了索拉非尼的抗肝腫瘤活性。因此，索拉非尼納米制劑的研發(fā)已成為肝癌治療的新方向。

目前報道的索拉非尼納米制劑仍有生物相容性低、粒徑偏大、抗腫瘤活性不高等問題。白蛋白是一種天然的親水性生物材料，也是最早用于制備抗腫瘤納米制劑的載體。它對腫瘤具有獨特的親和力：內皮細胞上的gp60 受體和腫瘤細胞外的分泌型富含半胱氨酸的酸性蛋白（SPARC）均能結合、轉運白蛋白到達腫瘤部位，增加瘤內藥物的蓄積量［10］。因此，采用白蛋白負載索拉非尼（human serum albumin-sorafenib nanoparticles，HSASRF-NPs）有望制備水溶性的納米制劑，并提高索拉非尼的肝腫瘤靶向性和抗腫瘤活性，為該藥的白蛋白納米劑型在肝癌治療中的應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器Malvern-3000HS 激光散射粒度分析和電位測定儀（英國Malvern 公司）；H-7650 型透射電鏡（日立高新技術上海國際貿易有限公司）；5810R低溫離心機（德國Eppendorf 公司）；LC-20AT 高效液相色譜儀（島津公司）；DMI3000B/DF450C 熒光倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；IncuCyte ZOOM 變焦活細胞成像系統(tǒng)（美國ESSEN Bioscience 公司）。

1.2 藥品與試劑索拉非尼（中國阿拉丁公司，批號：1528035，含量≥99.9%）；人血清白蛋白（美國Sigma 公司，批號：A0307A，含量≥96%）；1-乙基-3-［3-二甲基氨基丙基］碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10081863，含量：98.5%）；PARP（美國CST 公司，貨號-抗體類型：9542P-RabbitmAb）；β-tubulin（美國BD 公司，貨號-抗體類型：556321-MousemAb）；PVDF 膜（美國Millipore 公司）；超純水等。

1.3 細胞BEL-7402 細胞（廣州醫(yī)科大學腫瘤研究所贈）。

1.4 方法

1.4.1 制備HSA-SRF-NPs 和FITC-HSA-SRFNPs精密稱取10.0 mg 索拉非尼，用二甲亞砜（DMSO）溶解并逐滴加入0.5%人血白蛋白溶液中，攪拌后加入EDC 交聯(lián)，磷酸鹽緩沖液（PBS）透析后4～8 ℃下保存。制備FITC-HSA：將FITC 溶液滴入含人血白蛋白的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中，避光反應過夜，PBS 透析至外液澄清無顏色。制備FITC-HSA-SRF-NPs：調整FITC-HSA 溶液的濃度為0.5%，同前方法逐滴加入索拉非尼，并用EDC交聯(lián)，制備FITC 標記的HSA-SRF-NPs。

1.4.2 HSA-SRF-NPs 的表征用激光粒度分布和電位測定儀測定粒徑分布和Zeta 電位，透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察形態(tài)特征（3%磷鎢酸染色，pH 7.0），高效液相色譜法測定載藥量和包封率。

1.4.3 細胞復蘇與傳代37 ℃水浴融化凍存管，離心棄上清，完全培養(yǎng)基分散后繼續(xù)培養(yǎng)。當瓶底細胞面積達80%～90%時棄去培養(yǎng)基，PBS蕩洗，胰酶消化，無菌吸管吹打分散細胞，離心棄上清，用完全培養(yǎng)基分散，取一半重新培養(yǎng)。

1.4.4 FITC-HSA-SRF-NPS 在BEL-7402 細胞內的蓄積6 孔板中放置蓋玻片，將BEL-7402 細胞接種于蓋玻片上，培養(yǎng)24 h 后分別加入FITC 和FITC-HSA-SRF-NPS，培養(yǎng)12 h 后PBS 清洗，室溫下固定，DAPI 染色。將蓋玻片放在載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察（20×）。

1.4.5 IncuCyte ZOOM實時動態(tài)細胞成像將BEL-7402 細胞接種于96 孔板培養(yǎng)24 h，棄去上清，分別加入1.5、3、6 μmol/L 索拉非尼和HSA-SRF-NPS，每組3 個復孔，置于IncuCyte ZOOM 系統(tǒng)內，根據(jù)設定好的程序（每孔采集3 張不同視野的圖像，采集間隔4 h，10×鏡頭）收集6 d 的數(shù)據(jù)，用系統(tǒng)自動分析圖像中細胞的區(qū)域，計算細胞融合率。

1.4.6 細胞凋亡實驗將BEL-7402 細胞接種于6孔板培養(yǎng)24 h，不加藥或分別加入12.0 μmol/L 索拉非尼和HSA-SRF-NPs，每組3 個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。消化細胞，1×PBS洗滌，室溫離心收集細胞，重復洗滌3 次；加入預冷的1×binding buffer 重懸細胞，分別加入5 μL 的Annexin V-FITC 和PI 染色，室溫避光孵育，混勻上機，采用flowjo7.6 軟件進行凋亡分析，計算細胞凋亡百分比。

1.4.7 Western blot法檢測凋亡相關蛋白Cl-PARP的表達BEL-7402 細胞培養(yǎng)24 h，不加藥或分別加入13.5 μmol/L 的索拉非尼和HSA-SRF-NPs，每組3 個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后棄去培養(yǎng)基，裂解、收集細胞，低溫離心并取上清液，-80 ℃保存。取40 μg 樣品上樣，60 V 恒壓電泳后，恒流200 mA 轉膜90 min，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h。一抗PARP（1∶1 000）和β-tubulin（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，二抗（1∶5 000）繼續(xù)室溫孵育2 h，化學發(fā)光并于暗室中顯影、定影，檢測目標條帶。

1.5 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)經SPSS 軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HSA-SRF-NPs的表征HSA-SRF-NPs的水合粒徑為（75.8±2.6）nm（圖1A），多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）為0.129；Zeta 電位為-（19.00 ±1.02）mV（圖1B），絕對值較高，穩(wěn)定性較好（圖1）。由圖1 C 的TEM 圖可知，HSA-SRF-NPs 呈球形，大小在100 nm 左右。最終測得HSA-SRF-NPs 的載藥量和包封率分別為（4.23 ± 0.03）%和（92.52 ±2.40）%。

圖1 HSA-SRF-NPs 的表征Fig.1 Characterization of HSA-SRF-NPs

2.2 FITC-HSA-SRF-NPS 在BEL-7402 細胞內的蓄積見圖2，活細胞不會主動吞噬FITC，因此對照組和FITC 組BEL-7402 細胞中均無綠色熒光；FITC-HSA-SRF-NPS 組BEL-7402 細胞內出現(xiàn)綠色熒光，可能是其通過內吞作用將納米粒轉運入細胞，從而提高胞內索拉非尼的含量。

圖2 熒光顯微鏡觀察FITC 和FITC-HSA-SRF-NPS 在BEL-7402 細胞內的蓄積情況（20×）Fig.2 Observation of accumulation of FITC and FITC-HSA-SRF-NPS in BEL-7402 cells by fluorescence microscope（20×）

2.3 動態(tài)細胞增殖試驗未用藥物處理的BEL-7402 細胞從2 d 開始逐漸進入對數(shù)生長期，6 d 后細胞融合率接近100 %；索拉非尼處理后，各濃度組均顯示出對BEL-7402 細胞的增殖抑制作用（圖3A），同樣的變化在HSA-SRF-NPs 組也能觀察到（圖3B）。實驗結束后比較索拉非尼和HSA-SRFNPs 處理BEL-7402 細胞的融合率，發(fā)現(xiàn)HSA-SRFNPs 在各濃度組對BEL-7402 細胞的增殖抑制作用均顯著強于索拉非尼（圖3C）。隨著藥物處理時間延長，HSA-SRF-NPs 對BEL-7402 細胞形態(tài)結構的破壞比索拉非尼更加明顯（圖4）。

圖4 各樣品處理后BEL-7402 細胞的形態(tài)學變化Fig.4 Morphological changes in BEL7402 cells after treatment with each sample

圖3 IncuCyte ZOOM 動態(tài)細胞增殖試驗Fig.3 The dynamic cell proliferation test by IncuCyte ZOOM

2.4 細胞凋亡實驗凋亡結果見圖5。對照組僅有5 %的BEL-7402 細胞發(fā)生凋亡，而索拉非尼組和HSA-SRF-NPs 組分別為14.5 %和23.2 %（包括早期凋亡和晚期凋亡細胞），三組之間凋亡細胞百分比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

圖5 索拉非尼和HSA-SRF-NPs 對BEL-7402 細胞的促凋亡作用及三組細胞凋亡Fig.5 Comparison of the effects of sorafenib and HSA-SRFNPs on apoptosis of BEL-7402 cells and a column chart of apoptosis percentage in three groups

2.5 Western blot法檢測凋亡相關蛋白Cl-PARP的表達PARP的分子量為116 KDa，剪切后的Cl-PARP分子量為89 KDa，凋亡過程發(fā)生時，PARP被剪切成Cl-PARP，推進凋亡過程。三組PARP條帶下均有Cl-PARP條帶。Image J軟件測量圖中Cl-PARP的灰度值，并與β-tubulin 蛋白相比，計算相對蛋白表達量。經統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，Cl-PARP 在各組間的表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表達量由高到低依次為：HSA-SRF-NPs組＞索拉非尼組＞對照組。見圖6。

圖6 Western blotting條帶圖及Cl-PARP相對表達量柱狀圖Fig.6 Strip image of Western blotting and histogram of relative expression of Cl-PARP

3 討論

本研究采用化學交聯(lián)法成功制備出人血白蛋白-索拉非尼納米粒，測得HSA-SRF-NPs 的粒徑為（75.8±2.6）nm，Zeta 電位為-（19.00±1.02）mV，載藥量和包封率分別為（4.23 ± 0.03）%和（92.52 ±2.40）%。研究表明，粒徑大小影響納米藥物的分布。當粒徑在30～200 nm 時，高通透性和滯留（enhance the permeability and retention，EPR）效應增強［11］，藥物在腫瘤部位的蓄積量增加。SUN等［12］的研究表明，粒徑為100 nm 的牛血清白蛋白-阿霉素納米粒比250 nm 的該納米粒更容易在乳腺癌細胞中蓄積，有研究也證實，腫瘤細胞更有可能攝取較小的納米顆粒。因此，將粒徑控制在30～100 nm 有利于提高納米粒的腫瘤靶向性。現(xiàn)有研究中索拉非尼納米粒的粒徑多在200 nm 左右［8，13］，包封率并不理想［14］。本研究通過改良工藝，制備出粒徑在100 nm 以內、包封率高、穩(wěn)定性好的索拉非尼納米粒，能保證其良好的抗腫瘤活性。

細胞水平研究發(fā)現(xiàn)，HSA-SRF-NPs在BEL-7402細胞內的蓄積性、對BEL-7402 細胞的增殖抑制作用以及促凋亡能力均顯著優(yōu)于索拉非尼。WAN等［14］制備的拉帕替尼人血清白蛋白納米粒克服了藥物水溶性差和口服吸收受限等問題，但制備的納米粒并未提高藥物對乳腺癌細胞的細胞毒性和促凋亡能力。RETNAKUMARI 等［15］制備的轉鐵蛋白-人血白蛋白-索拉非尼納米粒顯示出抗慢性髓系白血病的功效，但并未評價其對肝腫瘤細胞的作用。本研究制備的HSA-SRF-NPs 對肝腫瘤細胞的毒性顯著增強，證明白蛋白為載體具有明顯優(yōu)勢，為其在肝癌治療中的應用提供理論依據(jù)，具有潛在的臨床研究價值。然而，HSA-SRF-NPs 的抗腫瘤活性仍可進一步提高：HSA-SRF-NPs 粒徑小，白蛋白表面又具有很多活性基團，因此可以繼續(xù)在其表面嫁接腫瘤靶向的配體，如葉酸、抗體和適體等［16］或共包載其他抗腫瘤藥物，以提高納米粒的抗肝腫瘤活性。未來還需要繼續(xù)改進該納米制劑，同時在整體動物水平評價其抗腫瘤活性，為其向臨床轉化打下理論基礎。