李歌 代云 冀梁 關(guān)東升

河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（鄭州450003）

腦小血管?。╟erebral small vessel disease，CSVD）是一種與年齡密切相關(guān)的高患病率疾病，并且是造成認(rèn)知障礙的主要原因，其引起的認(rèn)知功能障礙在血管性癡呆中占比35% ～67%［1］。目前有研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激為發(fā)病的關(guān)鍵，其通過干擾一氧化氮信號通路損害腦血管的功能，并與CSVD引起的動脈非淀粉樣變和淀粉樣變以及其重要危險因素密切相關(guān)［2-3］。

中醫(yī)藥理學(xué)研究顯示，百里醌有抗氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)、抗細(xì)胞凋亡、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等廣泛的生物學(xué)活性［4-5］。更有研究表明，百里醌是有效的親氧化劑，可維持多種抗氧化酶的還原性［6］，能緩解輻射小鼠的氧化損傷，降低癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠的腦損傷［7］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，百里醌可在葡萄酸鈉小鼠結(jié)腸炎模型中上調(diào)結(jié)腸組織中谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）水平，下調(diào)丙二醛（MDA）水平［8］。

至今，有關(guān)百里醌對CSVD 認(rèn)知功能和氧化應(yīng)激的研究甚少，本研究選用SHRsp 大鼠模型以研究氧化應(yīng)激與CSVD 發(fā)病的關(guān)系，并探討百里醌治療CSVD 的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器10 只15 周齡雄性SD 大鼠；30 只15 周齡雄性卒中易感型自發(fā)性高血壓大鼠，SPF 級，體質(zhì)量250 ～300 g，購自上海SLK 生物科技有限公司，給予標(biāo)準(zhǔn)光照周期（12 h光照，12 h 黑夜），室內(nèi)溫度（21±2）℃，濕度50%～70%，飼養(yǎng)條件均符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB14925-2010 規(guī)定。實驗在河南省中醫(yī)院實驗動物中心進(jìn)行，使用許可證號【SYXK（豫）2016-0009】。百里醌購自美國Sigma 公司。SOD 測定試劑盒（A001-3-2）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（A007-1-1）、GSH 測定試劑盒（A006-1-1）、MDA 測定試劑盒（A003-1-1）、活性氧（ROS）測定試劑盒（E004-1-1）均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗動物分組及給藥喂養(yǎng)前進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分［9］，評分在1 ～3 分顯示模型成功，繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)的實驗。適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d 后，將30 只SHRsp大鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量（25 mg/kg）和高劑量（50 mg/kg）百里醌組，每組10只，口服給藥，共4周，并以10 只SD 大鼠為對照組。低和高劑量的百里醌組分別給予25 和50 mg/kg 百里醌，對照組和模型組大鼠給予等量賦形劑。療程4 周后，模型組死亡脫落2 只。神經(jīng)行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 神經(jīng)行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Neurobehavioral scoring standards

1.3 Morris 水迷宮試驗參照Morris 水迷宮試驗方法［10］，實驗歷經(jīng)5 d，實驗第1 天將大鼠在未放置平臺的水池中自由游泳2 min，以適應(yīng)實驗環(huán)境。從第2 天起，每天進(jìn)行4 次登臺試驗，分別在水池不同位置釋放大鼠，記錄大鼠尋找隱藏平臺所花費的時間（即逃避潛伏期），60 s 內(nèi)未找到平臺，成績?nèi)园?0 s 計算。在試驗第6 天撤除透明平臺，任選一個水池位置釋放大鼠，進(jìn)行探索試驗，記錄120 s 內(nèi)大鼠穿越原平臺象限次數(shù)和在目標(biāo)象限所花費的時間。

1.4 新物體識別試驗給藥4 周后，考察大鼠自主活動進(jìn)行記憶獲取的能力，記錄動物對2 個物體各自的學(xué)習(xí)時間。在短期記憶試驗中，在二次訓(xùn)練180 min 后替換1 個新物體，在5 min 的檢測周期中記錄大鼠對新物體和舊物體的探索時間。在長期記憶試驗中，在二次訓(xùn)練24 h 后替換1 個新物體，在5 min 的檢測周期中記錄大鼠對新物體和舊物體的探索時間。以鑒別指數(shù)（新物體探索時間/新物體探索時間＋舊物體探索時間）評價大鼠對新舊物體的認(rèn)知能力和記憶水平。

1.5 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)測定認(rèn)知功能評測結(jié)束后，迅速將實驗動物斷頭取腦，冰上分離腦組織，取腦組織塊在低溫氯化鈉溶液中漂洗，去除血液，放入燒杯中，在燒杯中加入低溫氯化鈉溶液，并剪碎腦組織塊。將剪碎的腦組織塊混懸液倒入勻漿管中進(jìn)行充分勻漿，后將勻漿液以4 000 r/min 離心15 min，取上清液冰凍于-80 ℃貯存?zhèn)溆谩Ｑ趸瘧?yīng)激指標(biāo)（SOD、CAT、GSH、MDA、ROS）根據(jù)試劑盒說明書步驟進(jìn)行檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計單因素方差分析，方差齊采用LSD 檢驗方法，方差不齊采用Dunnett's T3 檢驗方法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 百里醌可改善SHRsp 大鼠的認(rèn)知功能

2.1.1 百里醌對SHRsp 大鼠逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時間和穿越原平臺象限次數(shù)的影響Morris水迷宮期間，大鼠的逃避潛伏期隨訓(xùn)練時間呈逐漸降低的趨勢。模型組大鼠與對照組比較，逃避潛伏期時間顯著延長（P＜0.01），目標(biāo)象限的停留時間顯著縮短（P＜0.01），穿越原平臺象限次數(shù)顯著減少（P＜0.01）。同時與模型組比較，百里醌低劑量和高劑量組大鼠逃避潛伏期均顯著縮短（P＜0.05），目標(biāo)象限的停留時間顯著增加（P＜0.05），穿越原平臺象限次數(shù)明顯增多（P＜0.05）。結(jié)果表明：百里醌可顯著改善SHRsp 大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。見表2-4。

表2 百里醌對SHRsp 大鼠逃避潛伏期的影響Tab.2 The effect of thymoquinone on the escape latency of SHRsp rats±s

表2 百里醌對SHRsp 大鼠逃避潛伏期的影響Tab.2 The effect of thymoquinone on the escape latency of SHRsp rats±s

注：與對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

劑量逃避潛伏期（s）組別對照組模型組低劑量百里醌組高劑量百里醌組（mg/kg）25 50第1 天38.43±2.18 42.00±1.14##40.30±0.94*39.35±1.93**第2 天19.33±3.11 32.15±3.49##27.77±3.53*25.95±3.73**第3 天12.13±3.77 25.29±3.08##21.11±3.88*18.40±2.71**第4 天10.83±2.18 20.60±4.47##16.57±3.34*14.90±3.54**第5 天9.90±2.54 20.33±13.30##15.02±2.21**14.24±3.94**

表3 百里醌對SHRsp 大鼠目標(biāo)象限停留時間的影響Tab.3 The effect of thymoquinone on the residence time in the target quadrant of SHRsp rats±s

表3 百里醌對SHRsp 大鼠目標(biāo)象限停留時間的影響Tab.3 The effect of thymoquinone on the residence time in the target quadrant of SHRsp rats±s

注：與對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

組別劑量（mg/kg）目標(biāo)象限停留時間（s）對照組模型組低劑量百里醌組高劑量百里醌組25 50 45.94±5.97 32.79±7.58##39.79±4.50*42.81±4.25**

2.1.2 百里醌對SHRsp 大鼠短期、長期記憶的影響在短期和長期記憶試驗中，模型組大鼠與對照組比較，探索新物體的時間縮短（P＜0.01），表明模型組大鼠存在明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙。與模型組比較，百里醌低劑量和高劑量組大鼠探索新物體的時間顯著增長（P＜0.05），見表5、6。鑒別指數(shù)表明，模型組大鼠區(qū)分新物體和舊物體的能力降低。百里醌治療使SHRsp大鼠在短時和長時記憶試驗中區(qū)分新物體和舊物體的能力升高，見表7、8?；谏鲜鼋Y(jié)果，表明百里醌可顯著改善SHRsp 大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

表4 百里醌對SHRsp 大鼠穿越原平臺象限次數(shù)的影響Tab.4 The effect of thymoquinone on the number of times that SHRsp rats cross the original platform±s

表4 百里醌對SHRsp 大鼠穿越原平臺象限次數(shù)的影響Tab.4 The effect of thymoquinone on the number of times that SHRsp rats cross the original platform±s

注：與對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

組別劑量（mg/kg）穿越原平臺象限次數(shù)（次）對照組7.70±0.82模型組低劑量百里醌組高劑量百里醌組25 50 2.50±0.93##4.30±0.95*6.20±0.79**

表5 百里醌對SHRsp 大鼠短期記憶的影響Tab.5 The effect of thymoquinone on short-term memory in SHRsp rats±s

表5 百里醌對SHRsp 大鼠短期記憶的影響Tab.5 The effect of thymoquinone on short-term memory in SHRsp rats±s

注：與對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

劑量探索新物體的時間（s）mg/kg）1 周2 周3 周4 周組別對照組模型組低劑量百里醌組高劑量百里醌組（25 50 8.29±1.37 3.87±0.76##5.25±1.35*6.53±1.57**7.65±1.68 3.54±1.24##5.39±1.81*6.85±1.57**7.60±1.68 3.43±1.24##5.31±1.81*6.39±1.57**7.41±1.68 3.13±1.24##4.87±1.81*6.21±1.57**

表6 百里醌對SHRsp 大鼠長期記憶的影響Tab.6 The effect of thymoquinone on the long-term memory of SHRsp rats±s

表6 百里醌對SHRsp 大鼠長期記憶的影響Tab.6 The effect of thymoquinone on the long-term memory of SHRsp rats±s

注：與對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

劑量探索新物體的時間（s）（mg/kg）1 周2 周3 周4 周7.38±1.707.14±1.707.10±1.707.05±1.70組別對照組模型組低劑量百里醌組高劑量百里醌組25 50 3.40±1.22##5.30±1.35*6.05±1.57**3.33±1.22##4.91±1.35*5.86±1.57**3.08±1.22##4.74±1.35*5.80±1.57*2.95±1.22##4.55±1.35*5.46±1.57**

表7 百里醌對SHRsp 大鼠短期記憶辨別指數(shù)的影響Tab.7 The effect of thymoquinone on the short-term memory discrimination index of SHRsp rats±s

表7 百里醌對SHRsp 大鼠短期記憶辨別指數(shù)的影響Tab.7 The effect of thymoquinone on the short-term memory discrimination index of SHRsp rats±s

注：與對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

劑量探索新物體的辨別指數(shù)（%）（mg/kg）1 周2 周3 周4 周0.58±0.050.59±0.060.58±0.070.57±0.05組別對照組模型組低劑量百里醌組高劑量百里醌組25 50 0.49±0.04#0.54±0.06*0.56±0.04*0.47±0.05#0.53±0.04*0.57±0.04*0.46±0.06#0.52±0.05*0.56±0.06*0.45±0.04#0.52±0.03*0.55±0.06*

表8 百里醌對SHRsp 大鼠長期記憶辨別指數(shù)的影響Tab.8 The effect of thymoquinone on the long-term memory discrimination index of SHRsp rats±s

表8 百里醌對SHRsp 大鼠長期記憶辨別指數(shù)的影響Tab.8 The effect of thymoquinone on the long-term memory discrimination index of SHRsp rats±s

注：與對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

劑量探索新物體的辨別指數(shù)（%）組別對照組模型組低劑量百里醌組高劑量百里醌組（mg/kg）25 50 1 周0.56±0.04 0.45±0.05#0.57±0.05*0.58±0.04*2 周0.54±0.06 0.43±0.05#0.56±0.06*0.58±0.07*3 周0.57±0.07 0.44±0.06#0.54±0.06*0.56±0.04*4 周0.56±0.08 0.41±0.06#0.55±0.08*0.57±0.09*

2.2 百里醌可抑制SHRsp 大鼠腦部的氧化應(yīng)激SHRsp 大鼠模型組相比對照組，腦中的SOD、CAT 的活性和GSH 的含量顯著減少（P＜0.01），MDA、ROS 的水平明顯增加（P＜0.01）。百里醌低劑量和高劑量組與模型組比較，腦中SOD、CAT（P＜0.05）的活性和GSH（P＜0.01）的含量明顯增加，MDA、ROS 的水平較模型組明顯減少（P＜0.05）上述實驗結(jié)果表明：百里醌對SHRsp 大鼠具有抗氧化的功能。見表9。

表9 百里醌對SHRsp 大鼠氧化應(yīng)激的影響Tab.9 The effect of thymoquinone on oxidative stress in SHRsp rats±s

表9 百里醌對SHRsp 大鼠氧化應(yīng)激的影響Tab.9 The effect of thymoquinone on oxidative stress in SHRsp rats±s

注：與對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

kg）氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)組別對照組模型組低劑量百里醌組高劑量百里醌組劑量（mg/25 50 SOD（U/mg）17.88±2.93 5.36±0.95##8.57±0.85*14.46±2.65**CAT（U/mg）11.41±2.54 3.73±0.44##5.50±1.32*9.26±1.93**MDA（nmol/mg）0.13±0.03 0.46±0.08##0.33±0.05*0.27±0.07**GSH（μg/mg）5.65±2.00 1.15±0.42##2.76±0.86**4.47±1.02**ROS（U/mL）1.01±0.01 3.26±0.05##2.73±0.95*2.31±0.19**

3 討論

CSVD 是一種全身性的慢性重大疾病，是老年人中常見的腦血管疾病，為老齡化社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。認(rèn)知功能障礙為其常見的臨床表現(xiàn)。CSVD 引起的認(rèn)知損害主要涉及注意力、處理速度、執(zhí)行功能等認(rèn)知域，而對記憶的損害相對較輕［11］。目前，CSVD 的發(fā)病機(jī)制涉及腦慢性缺血/低灌注、血腦屏障受損、內(nèi)皮功能障礙、氧化應(yīng)激以及炎癥等［12］。其中，氧化應(yīng)激是其關(guān)鍵作用機(jī)制，抗氧化干預(yù)成為治療CSVD 的新策略［13-14］。

本研究采用SHRsp 大鼠模型，該模型大鼠在10 周前自行發(fā)展出穩(wěn)定的動脈高壓，逐漸進(jìn)展致9 ～10 個月內(nèi)可出現(xiàn)腦卒中或腦出血，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能嚴(yán)重受損［15］。SHRsp 大鼠尾狀核、胼胝體等腦區(qū)存在腦部小血管血栓形成和腦白質(zhì)病變，與CSVD 的病變特征一致［16］。

氧化應(yīng)激是CSVD 的主要病理機(jī)制，由于腦組織代謝旺盛，需氧量高，導(dǎo)致生成大量的ROS，但腦組織自身缺乏抗氧化物質(zhì)，更容易受到后者侵害［17-18］。MDA 是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其水平高低可反映細(xì)胞損傷的程度。GSH、SOD、CAT均是體內(nèi)重要的抗氧化劑，可清除細(xì)胞中ROS，具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，CSVD 患者血漿中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量顯著高于正常人群，且其臨床不良預(yù)后與其基線氧化應(yīng)激水平正相關(guān)［19-20］。

目前，CSVD 相關(guān)認(rèn)知障礙尚無特效藥，改善微循環(huán)、營養(yǎng)腦神經(jīng)對其治療作用有限。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，CSVD 相關(guān)認(rèn)知障礙屬“癡呆病”的范疇，本病與脾關(guān)系密切，脾虛失運是其形成的主要內(nèi)因，脾運正常，則腎精得充，神機(jī)得用［21］?！鹅`樞·平人絕谷論》中指出：“故神者，水谷之精氣也”，認(rèn)為氣血充盛是神志活動的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。脾為后天之本，氣血生化之源，其與情志的關(guān)系可概括為：“脾藏意”。脾無法發(fā)揮運化的功能，氣血生化乏源，最終無法承載思維、記憶功能而發(fā)為癡呆。筆者認(rèn)為CSVD 相關(guān)認(rèn)知障礙以脾虛為本，痰濕交阻為標(biāo)，病位在腦，當(dāng)以健脾益氣、祛痰化濕為主。

苜蓿的主要功能為“清脾胃、利大小腸，下膀胱結(jié)石”，《本草綱目》中記載其“安中利入，可久食、利五臟、輕身健人?！逼馓撈⑹Ы∵\，氣血失調(diào)導(dǎo)致抗氧化酶活性降低，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)［22］。既往研究［23］表明，補(bǔ)脾中藥可提高機(jī)體抗氧化的能力，進(jìn)而改善認(rèn)知功能。百里醌作為苜蓿的提取物，通過健脾益氣達(dá)到祛痰化濕的作用，從而通利五臟氣機(jī)，氣血運行通暢，治療本病。綜上所述，百里醌可能通過抑制SHRsp 大鼠的氧化應(yīng)激，從而改善CSVD 大鼠的認(rèn)知功能障礙。因此百里醌可能是臨床上應(yīng)用于治療CSVD 的有效中藥提取物，提供了科學(xué)的依據(jù)。但本研究樣本較小，觀察指標(biāo)有限，百里醌對CSVD 相關(guān)認(rèn)知功能障礙的治療作用機(jī)制仍待進(jìn)一步的研究。