李 妍，吳 楠，張新建，解詩(shī)雨，高賢彪，吳 迪，馮 磊

(1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，天津 300384； 2.天津農(nóng)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院，天津300384；3.天津市農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 300061)

0 引言

2020年6月8日，生態(tài)環(huán)境部、國(guó)家統(tǒng)計(jì)局、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部聯(lián)合發(fā)布的《第二次全國(guó)污染源普查公報(bào)》顯示：2017年，秸稈產(chǎn)生量8.05億t，秸稈可收集資源量6.74億t，秸稈利用量5.85億t[1]。農(nóng)作物秸稈能夠?yàn)橥寥姥a(bǔ)充有機(jī)質(zhì)及氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫等營(yíng)養(yǎng)元素，肥料化已經(jīng)成為秸稈資源最主要的利用方式。

華北地區(qū)現(xiàn)有的夏秋/冬春作物輪作體系主要采用均壟栽培，秸稈還田大部分采用兩種方式。一是秸稈粉碎翻壓還田，把作物秸稈通過(guò)機(jī)械化粉碎，均撒田間后進(jìn)行耕地翻壓，大部分露在地表。由于秸稈量過(guò)大或不均勻?qū)е峦寥牢⑸锱c作物幼苗爭(zhēng)奪養(yǎng)分，甚至出現(xiàn)黃苗、死苗和減產(chǎn)等現(xiàn)象。秸稈在旱土翻壓還田后，上下茬作物種植時(shí)間間隔短，使土壤變得過(guò)松，影響下茬種子發(fā)芽生長(zhǎng)，甚至出現(xiàn)吊根。秸稈中的蟲(chóng)卵、帶菌體等一些病蟲(chóng)害，在秸稈直接粉碎過(guò)程中無(wú)法殺死，沒(méi)有充足的腐熟時(shí)間，還田后留在土壤里，造成蟲(chóng)害。二是秸稈粉碎直接覆蓋在地表還田。這種方式可以減少土壤水分的蒸發(fā)，達(dá)到保墑的目的，但秸稈腐解和作物出苗同時(shí)進(jìn)行，爭(zhēng)奪養(yǎng)分，秸稈腐解不完全，嚴(yán)重影響下茬作物出苗，同時(shí)給灌溉帶來(lái)不便，造成水資源的浪費(fèi)。

天津市農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所[2-3]發(fā)明了一種溝稈壟作栽培方法及秸稈撿拾開(kāi)溝還田機(jī)。該方法是在夏秋季和冬春季作物壟上寬窄行周年交替種植，秸稈在種植行內(nèi)交替犁溝掩埋，溝內(nèi)施肥、灌水。我國(guó)華北地區(qū)氣候干旱，降雨量少，水資源缺乏，如在該地區(qū)寬窄行種植基礎(chǔ)上采用溝內(nèi)秸稈還田模式，對(duì)解決農(nóng)作物秸稈的資源化率、優(yōu)化灌溉用水、節(jié)省人工成本等方面具有非常重要的作用和意義。但該方法對(duì)華北地區(qū)潮土理化特性、作物產(chǎn)量和土壤生態(tài)等方面的研究仍十分有限。因此，本研究探索溝內(nèi)秸稈還田下土壤群落結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，為評(píng)價(jià)該寬窄行種植秸稈溝內(nèi)還田模式對(duì)改良土壤生態(tài)系統(tǒng)、進(jìn)一步優(yōu)化寬窄行種植秸稈還田方法提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于天津市靜海區(qū)順民屯村(117°02’E，38°80’N)。該區(qū)域年平均氣溫11.9 ℃，年平均降水量590 mm，主要集中在7—8月，屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候。區(qū)域地勢(shì)平坦，海拔5 m，土壤類型為潮土。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2018年6月—2019年6月，在該地開(kāi)展試驗(yàn)研究。試驗(yàn)種植作物為玉米/小麥輪作。秸稈埋溝具體方法：在6月小麥?zhǔn)斋@后，在均壟栽培的田上設(shè)置寬窄行，寬行80 cm，窄行40 cm；窄行犁溝，麥秸填溝、施肥、溝土回填、灌水，窄行兩邊側(cè)播種玉米；10月玉米收獲后，寬行犁溝，將玉米秸稈埋入寬行溝內(nèi)，寬行種植小麥。通過(guò)秸稈撿拾開(kāi)溝還田機(jī)進(jìn)行機(jī)械化操作，秸稈全量撿拾粉碎還田，還田深度35 cm。溝內(nèi)施肥用復(fù)合肥0.67 t/(hm2·a-1)(N-P2O5-K2O=20-10-15)。試驗(yàn)共設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)面積480 m2(寬24 m×長(zhǎng)20 m)。每茬作物關(guān)鍵生育期溝內(nèi)灌水2～3次，每次灌水量900 m3/hm2。試驗(yàn)后土壤理化性質(zhì)如表1所示。

表1 不同深度土壤理化性質(zhì)

1.3 樣品采集

試驗(yàn)后，按照S型采樣法采集窄行和寬行土壤0～20、20～40和40～60 cm深度土層樣品進(jìn)行土壤生物多樣性測(cè)定。分別混合為6個(gè)樣品，并分別標(biāo)記為A1、A2、A3、B1、B2和B3。

1.4 微生物高通量測(cè)序

使用Power Soil DNA Isolation Kit(MOBIO Laboratories)試劑盒從樣品中提取總細(xì)菌DNA。通過(guò)260/280 nm和260/230 nm的比率評(píng)估DNA的質(zhì)量和數(shù)量。用引物擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA基因的V3-V4區(qū)域，用正向引物(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和反向引物(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增基因。PCR產(chǎn)物通過(guò)VAHTSTM DNA Clean Beads純化。使用百邁克生物科技公司的Illumina Hiseq 2500平臺(tái)(PE250)對(duì)純化的合并樣品進(jìn)行高通量測(cè)序分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)，并以SPSS 19.0進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。使用百邁克生物云平臺(tái)完成微生物多樣性分析。Pearson相關(guān)性分析繪圖采用R 3.5.0。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物Alpha多樣性

微生物Alpha多樣性指數(shù)如表2所示。測(cè)序覆蓋深度(Coverage指數(shù))均在0.99以上，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果基本反映了樣本中微生物的真實(shí)情況。窄行土壤(A1～A3)的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)隨土壤深度的增加而減少，表明群落豐富度隨土樣深度增加而降低，這與OTU數(shù)目變化情況一致。相反，寬行(B1～B3)的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)隨土樣深度增加而增加?？赡苁怯捎谡型寥捞幱谛莞麪顟B(tài)，淺層土壤受到還田秸稈的影響，部分微生物暫時(shí)不能適應(yīng)這種生存環(huán)境，因而微生物豐富度較低，而深層土壤微生物受外界干擾較小。Shannon指數(shù)指示了樣品的細(xì)菌多樣性程度。寬行和窄行的土壤物種多樣性都隨土壤深度增加而降低，這與薩如拉等[4]的研究結(jié)果一致。同一深度下，寬行土樣的Shannon指數(shù)(6.16～6.33)高于窄行土壤(5.92～6.21)，表明寬行土壤的物種多樣性普遍高于窄行。

表2 土樣微生物Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

通過(guò)對(duì)有效序列的聚類分析及數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，6個(gè)土樣共得到1 802個(gè)OTUs?；ò陥D(圖1)顯示6個(gè)土樣中所共有的OTU為779個(gè)，占總OTU的43.2%。只有2個(gè)土樣(A1和A3)特有的OTU≥10個(gè)，其余土樣中特有的OTU數(shù)目均<5個(gè)。

圖1 OTU分布韋恩圖Fig.1 OUT Venn graph

2.2 微生物Beta多樣性

微生物Beta多樣性分析是通過(guò)微生物群落構(gòu)成的比較，評(píng)估不同微生物群落間的差異情況?；赽ray_curtis算法的主成分分析(PCoA)(圖2)，根據(jù)兩點(diǎn)之間的距離判斷兩樣品微生物群落的差異性。第一主成分PC1的貢獻(xiàn)值32.71%，將寬行和窄行的樣品較好地分開(kāi)，表明窄行和寬行土壤樣品菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異。第二主成分PC2的貢獻(xiàn)值22.13%，2個(gè)地區(qū)的深層土樣(A2，A3，B2，B3)都分布在下方區(qū)域，與表層土樣(A1和B1)距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明不同深度土樣的微生物群落結(jié)構(gòu)存在較大的差異。UPGMA聚類分析結(jié)果(圖3)進(jìn)一步驗(yàn)證了PCoA分析結(jié)果，其中B2和B3群落結(jié)構(gòu)在0.164相似性水平上聚集于一起，表明群落結(jié)構(gòu)較其他樣品更為相似。而2個(gè)地區(qū)的表層土樣(A1和B1)的物種組成差異最大。

圖2 PCoA分析圖Fig.2 PCoA analysis chart

圖3 UPGMA聚類樹(shù)Fig.3 UPGMA Cluster tree

2.3 土壤微生物群落組成分析

由表3可知，6個(gè)土樣中微生物群落組成依據(jù)不同分類水平可分為29個(gè)菌門(mén)、74個(gè)綱、163個(gè)目、294個(gè)科、556個(gè)屬和619個(gè)種。

表3 樣品各等級(jí)物種統(tǒng)計(jì)

不同土樣中門(mén)水平上相對(duì)豐度排名前10位的物種如圖4所示。窄行和寬行土樣中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)和放線菌門(mén)(Acitinobacteria)，這與譚雪蓮等[5]的研究結(jié)果一致。其中變形菌門(mén)豐度最高，為41.1%～53.7%。傅敏等[6]的研究表明，作為相對(duì)豐度最高的變形菌門(mén)，為土壤系統(tǒng)的氮素及能量循環(huán)發(fā)揮重要作用。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，窄行變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度(分別為48.0%～53.7%和14.3%～16.2%)略高于寬行(變形菌門(mén)為41.1%～52.0%，擬桿菌門(mén)為9.0%～12.0%)。寬行中的芽單胞菌門(mén)(9.9%～13.0%)、酸桿菌門(mén)(8.1%～14.5%)、放線菌門(mén)(8.1%～10.0%)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi，2.5%～4.4%)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes，2.3%～3.5%)5個(gè)物種的相對(duì)豐度均高于窄行。田勝營(yíng)等[7]研究表明，小麥與玉米殘留秸稈中的微生物群落組成顯著不同，主要與其G+和G-不同有關(guān)。芽單胞菌門(mén)為革蘭氏陰性桿菌，是土壤9大細(xì)菌門(mén)類之一，其豐富度可作為土壤屬性變遷的生物學(xué)指標(biāo)之一。在寬行此類細(xì)菌多于窄行，其原因可能是還田的秸稈很大程度上增加了土壤的碳氮含量，使土壤理化性質(zhì)發(fā)生改變。此外，有研究發(fā)現(xiàn)酸桿菌具有許多編碼纖維素酶和半纖維素分解酶的基因[8]。因此，寬行的酸桿菌相對(duì)豐度高于窄行，可能與來(lái)自高纖維素含量的秸稈所施環(huán)境壓力有關(guān)。

圖4 門(mén)水平上的群落分布Fig.4 Species distribution in the level of phylum

隨著土樣深度的增加，寬行的變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度逐漸升高，而酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度逐漸降低。疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)在兩種土樣中的相對(duì)豐度無(wú)明顯差別。對(duì)于棲熱菌門(mén)(Deinococcus-Thermus)，窄行有少量檢出，但未存在于寬行。

在屬水平上(圖5)，窄行和寬行土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬有溶桿菌屬(Lysobacter，相對(duì)豐度3.1%～12.2%)，uncultured_bacterium_c_Subgroup_6(2.4%～6.5%)，uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae(2.4%～5.7%)，交替赤桿菌屬(Altererythrobacter，1.3%～5.0%)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，1.6%～3.9%)。

圖5 屬水平上的群落分布Fig.5 Species distribution in the level of genus

窄行和寬行的地表土壤(A1、B1)中的溶桿菌屬的相對(duì)豐度差別較小(分別為3.1%和3.2%)。隨著土壤深度增加(A2、B2)，中層土壤溶桿菌屬的豐度高于地表土壤，且這一現(xiàn)象在窄行的中層土樣更為明顯(A2)，可能是由于玉米秸稈還田量大，聚集了較多的溶桿菌屬而使其豐度升高[9]。ISAM T等[10]研究發(fā)現(xiàn)，溶桿菌Lysobactersp.SB-K88產(chǎn)生一種對(duì)甜菜瘁倒病有拮抗作用的抗生素xanthobaccinA。FOLMAN L B等[11]從溶桿菌屬Lysobactersp.3.1T8上分離出一種對(duì)黃瓜瘁倒病具有防治效果的抗生素。KOBAYASHI D Y等[12]研究產(chǎn)酶溶桿菌C3時(shí)發(fā)現(xiàn)一種能夠控制病害的抗生素物質(zhì)(HSAF)。

寬行的交替赤桿菌屬的相對(duì)豐度隨深度增加而升高，且均低于窄行；在窄行不同深度的土樣中，其相對(duì)豐度并無(wú)明顯變化。馬聰?shù)萚13]研究證明，交替赤桿菌屬中菌株MH-B5對(duì)類固醇激素污染的咸水環(huán)境具有修復(fù)作用。

鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)屬于變形菌門(mén)。常安然等[14]研究表明，鞘氨醇單孢菌是降解土壤有毒物質(zhì)最有效的微生物菌屬之一。與交替赤桿菌屬相反，物種分布圖顯示寬行的鞘氨醇單胞菌相對(duì)豐度(3.0%～3.9%)普遍高于窄行(1.6%～2.8%)，且與土壤深度無(wú)明顯關(guān)系。

2.4 微生物群落與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

將土壤微生物群落與土壤理化性質(zhì)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析(圖6，圖中*代表P<0.05，**代表P<0.01)，結(jié)果顯示全氮、堿解氮、速效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)與綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、放線菌門(mén)(Acitinobacteria)和芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)呈正相關(guān)，但與變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)等呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與王晶等[15]研究秸稈炭化還田的結(jié)果相似。其中變形菌門(mén)與堿解氮呈極顯著負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=-0.94，P<0.01)。周佳等[16]也發(fā)現(xiàn)水稻根際土中變形菌門(mén)相對(duì)豐度與堿解氮含量呈負(fù)相關(guān)。而綠彎菌門(mén)與堿解氮呈顯著正相關(guān)(r=0.87，P<0.05)。這說(shuō)明變形菌門(mén)和綠彎菌門(mén)可能與土壤氮素的利用相關(guān)。變形菌門(mén)與全氮、速效磷和有機(jī)質(zhì)也呈顯著負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=-0.87～-0.82，P<0.05)。此外，電導(dǎo)率與放線菌門(mén)和芽單胞菌門(mén)呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.95～-0.94，P<0.01)，而與變形菌門(mén)呈顯著正相關(guān)(r=0.86，P<0.05)。

圖6 土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌群落(門(mén)水平)的Pearson相關(guān)性分析Fig.6 Pearson relative analysis of soil physical and chemical properties and bacterial community composition(phylum level)

2.5 微生物功能預(yù)測(cè)分析

根據(jù)KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)代謝途徑的差異分析結(jié)果，在一級(jí)功能層共獲得6類生物代謝通路功能分析：代謝(metabolism)、遺傳信息處理(genetic information processing)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、細(xì)胞過(guò)程(cellular processes)、有機(jī)系統(tǒng)(organismal systems)和人類疾病(human diseases)。

其中，代謝和遺傳信息處理為其主要組成，占比分別為75.06%～75.32%和9.40%～9.47%。

對(duì)窄行和寬行的表層土樣A1和B1進(jìn)行第2層級(jí)下KEGG代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)，共有40個(gè)二級(jí)功能層預(yù)測(cè)基因的拷貝數(shù)存在顯著差異(圖7)。其中B1土樣中，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(Cell motility)，多糖生物合成和代 謝(Glycan biosynthesis and metabolism)，次生產(chǎn)物代謝的生物合成(Biosynthesis of other secondary metabolites)，能量代謝(Energy metabolism)，碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)等20個(gè)子功能預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)要顯著高于A1土樣。而A1土樣中，膜運(yùn)輸(Membrane transport)，氨基酸代謝(Amino acid metabolism)等子功能預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)要顯著高于B1土樣。

圖7 微生物群落KEGG代謝途徑差異分析Fig.7 EGG metabolic pathway difference analysis

秸稈還田進(jìn)入土壤后，成為土壤微生物主要碳源，在秸稈碳源的刺激下，促進(jìn)多數(shù)有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型微生物的增殖，從而導(dǎo)致土壤細(xì)菌、真菌、放線菌、硝化細(xì)菌和纖維素分解菌等的增加。已有研究報(bào)道秸稈直接還田過(guò)程中，土壤微生物主要利用的碳源為碳水化合物類、羧酸類和氨基酸類[17-18]。這與本文結(jié)果基本一致，即寬行B1土樣的碳水化合物代謝功能預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)要顯著高于窄行A1土樣。通過(guò)KEGG代謝途徑結(jié)果可知，各個(gè)樣品中微生物的碳水化合物代謝占比最多。王曉玥等[19]研究發(fā)現(xiàn)，小麥玉米秸稈腐解0.5 a和1 a后，碳水化合物與土壤微生物相關(guān)性較高。王晶等[15]也發(fā)現(xiàn)秸稈直接還田處理土壤微生物碳源代謝活性最高。周運(yùn)來(lái)等[20]研究小麥秸稈不同還田方式下土壤微生物碳代謝多樣性特征，認(rèn)為隨著土層的加深(0～5、5～10和10～20 cm)，微生物的碳源利用能力依次下降。

3 結(jié)論

(1)窄行土壤的微生物豐富度(Chao1指數(shù))隨土樣深度增加而降低，而寬行土壤的群落豐富度隨土壤深度的增加而增加。兩種土壤的微生物多樣性(Shannon指數(shù))都隨土壤深度增加而降低。在同一深度下，寬行土樣的物種多樣性要普遍高于窄行。窄行和寬行的土樣微生物群落構(gòu)成具有較大差異，同一地區(qū)的表層土壤與深層土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)也存在明顯差異。

(2)6個(gè)土樣共檢測(cè)到1 802個(gè)OTUs，隸屬于29門(mén)、74綱、163目、294科和556屬。兩種土樣中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和放線菌門(mén)。窄行變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度略高于寬行，而芽單胞菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、綠彎菌門(mén)和厚壁菌門(mén)低于寬行。在寬行，隨著土樣深度的增加，變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度逐漸升高，而酸桿菌門(mén)的豐度逐漸降低。在屬水平上，溶桿菌屬、交替赤桿菌屬和鞘氨醇單胞菌等為兩種土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬。

(3)土壤養(yǎng)分與微生物群落結(jié)構(gòu)組成具有一定的相關(guān)性。全氮、堿解氮、速效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)與綠彎菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、放線菌門(mén)和芽單胞菌門(mén)呈正相關(guān)，但與變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)等呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。其中變形菌門(mén)與堿解氮呈極顯著負(fù)相關(guān)。而綠彎菌門(mén)與堿解氮呈顯著正相關(guān)。變形菌門(mén)與全氮、速效磷和有機(jī)質(zhì)也呈顯著負(fù)相關(guān)。

(4)KEGG代謝途徑結(jié)果表明，土樣中微生物的碳水化合物代謝占比最多，且寬行表層土的碳水化合物代謝功能預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)要顯著高于窄行表層土樣。