梁天堅(jiān)李黎明李本杰秦燕瓊呂金燕曹 云陳 睿*梁 燕

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，廣西 南寧 530222；3.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021）

高脂血癥（Hyperlipidemia，HLP）是導(dǎo)致心腦血管疾病的重要誘因，其發(fā)生發(fā)展多與患者飲食、作息及情志等多方面因素有關(guān)［1]，當(dāng)前治療多用西藥干預(yù)，但常伴有一定不良反應(yīng)，因此，需要尋找更為安全有效的方法［2]。大柴胡湯是中醫(yī)經(jīng)典名方，由柴胡、黃芩、大黃、枳實(shí)、半夏、白芍、大棗、生姜組成［3]，臨床治療HLP 具有顯著療效［4-5]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（Network pharmacology）基于系統(tǒng)生物學(xué)及藥理學(xué)范疇，通過(guò)構(gòu)建藥物與靶點(diǎn)、靶點(diǎn)和疾病等之間的關(guān)聯(lián)互作網(wǎng)絡(luò)，從整體來(lái)預(yù)測(cè)中藥活性成分及其藥理機(jī)制［6-7]，這一整體網(wǎng)絡(luò)策略十分契合中藥整體作用特點(diǎn)，與中藥精準(zhǔn)應(yīng)用的過(guò)程一致。

為了進(jìn)一步研究大柴胡湯治療HLP 的作用機(jī)制，本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)大柴胡湯的活性成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)性，發(fā)掘其治療HLP 的作用機(jī)制，以期為該方臨床精準(zhǔn)應(yīng)用提供方法支持和理論依據(jù)。

1 方法

1.1 活性成分篩選和潛在靶點(diǎn)收集 利用TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）數(shù)據(jù)庫(kù)［8]，收集大柴胡湯組方中各單味藥的化學(xué)成分并進(jìn)行ADME 分析，根據(jù)口服利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）初步篩選出該復(fù)方的主要活性成分，收集活性成分對(duì)應(yīng)的潛在藥效靶點(diǎn)，并利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)，將靶點(diǎn)名稱（Protein name）統(tǒng)一為基因名稱（Gene name）。

1.2 HLP 作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)與篩選 以“hyperlipidemia”為關(guān)鍵詞，利用人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)［9]Genecards（https：//www.genecards.org）和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）數(shù)據(jù)庫(kù)［10]進(jìn)行檢索，獲取HLP相關(guān)疾病靶標(biāo)。將疾病靶標(biāo)與上述活性成分潛在藥效靶點(diǎn)相匹配，所得共同靶標(biāo)即為潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 利用String（https：//string-db.org/）在線數(shù)據(jù)庫(kù)［11]對(duì)大柴胡湯治療HLP 潛在靶蛋白之間相互作用（Protein protein interaction，PPI）進(jìn)行分析，選擇關(guān)聯(lián)度大的互作蛋白作為核心靶點(diǎn)，并利用Cytoscape3.7.1 網(wǎng)絡(luò)可視化軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO 基因功能注釋和KEGG 通路富集分析 將PPI 網(wǎng)絡(luò)中篩選所得核心靶點(diǎn)導(dǎo)入生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)［12]DAVID 6.8（http：//david.Ncifcrf.gov/）中進(jìn)行基因本體（Gene ontology，GO）注釋分析和京都基因與基因百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，并限定靶基因名稱列表為人。

1.5 網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建及分析 將收集到的活性成分及其潛在靶點(diǎn)篩選結(jié)果，利用Cytoscape3.7.1 網(wǎng)絡(luò)可視化軟件構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”（Compound-Target，C-T）網(wǎng)絡(luò)圖；根據(jù)KEGG 通路富集分析結(jié)果中P 值大小，選擇顯著富集的前15 條信號(hào)通路，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”（Compound-Target-Pathway，C-T-P）網(wǎng)絡(luò)圖?；诙戎担╠egree）和介數(shù)（betweenness）設(shè)置節(jié)點(diǎn)（node）顏色和大小，活性成分與其作用靶點(diǎn)、靶點(diǎn)與其相關(guān)信號(hào)通路之間用邊（edge）相連，以反映大柴胡湯治療HLP 的主要活性成分及其潛在作用靶點(diǎn)和相關(guān)通路。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證活性成分-核心靶點(diǎn) 基于上述分析結(jié)果，選擇關(guān)聯(lián)度最高的活性成分作為配體，KEGG 富集結(jié)果中最為顯著的信號(hào)通路所涉及靶點(diǎn)蛋白作為受體，經(jīng)RCSB Protein Data Bank（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）平臺(tái)［13]篩選并下載關(guān)鍵蛋白及其共結(jié)晶，利用Sybyl2.0 軟件對(duì)受體蛋白及配體小分子進(jìn)行準(zhǔn)備工作，刪除水分子，添加極性氫原子，構(gòu)建活性口袋，選擇柔性對(duì)接模式，對(duì)活性成分與核心靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接結(jié)果利用LigPlus 軟件進(jìn)行分析，其氫鍵和疏水鍵，預(yù)測(cè)二者的結(jié)合性能，從而驗(yàn)證本研究結(jié)果的可靠性。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選及潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 經(jīng)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選，共收集到大柴胡湯活性成分133 種，有9 種共有成分，均表現(xiàn)出較高的口服生物利用度和類藥性。其中，柴胡活性成分17 種，黃芩活性成分36 種，大黃活性成分15 種，枳實(shí)活性成分22 種，半夏活性成分13 種，白芍活性成分13 種，大棗活性成分29 種，生姜活性成分5 種，具體信息見(jiàn)表1。

表1 大柴胡湯活性成分

續(xù)表1

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到柴胡的潛在作用靶標(biāo)314個(gè)，黃芩507 個(gè)，大黃306 個(gè)，枳實(shí)306 個(gè)，半夏174 個(gè)，生姜75 個(gè)，大棗281 個(gè)，白芍123 個(gè)，得到大柴胡湯133 種活性成分對(duì)應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)288 個(gè)，共有靶標(biāo)見(jiàn)表2。

表2 大柴胡湯所含中藥之間的共有靶標(biāo)數(shù)量（個(gè)）

2.2 疾病靶點(diǎn)篩選及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 經(jīng)Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，共得到249 個(gè)HLP 相關(guān)疾病靶標(biāo)，將以上249 個(gè)疾病靶標(biāo)與大柴胡湯活性成分相對(duì)應(yīng)的288個(gè)潛在作用靶點(diǎn)取交集進(jìn)行分析，得到55 個(gè)共有靶標(biāo)（圖1），共有靶標(biāo)即為大柴胡湯治療HLP 的潛在作用靶點(diǎn)。將55 個(gè)潛在靶點(diǎn)信息導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇“Homo sapiens”，以蛋白相互作用綜合得分＞0.9 作為篩選條件，得到46 個(gè)靶點(diǎn)的蛋白互作結(jié)果，將結(jié)果文件導(dǎo)入Cytoscape

圖1 大柴胡湯疾病-成分靶點(diǎn)韋恩圖

3.1.1 軟件，構(gòu)建上述46 個(gè)靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖2），各靶點(diǎn)信息見(jiàn)表3。

表3 大柴胡湯治療HLP 核心靶點(diǎn)

圖2 大柴胡湯治療HLP 作用靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.3 活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape 3.1.1軟件將篩選所得大柴胡湯活性成分及其治療HLP 相關(guān)聯(lián)的核心靶點(diǎn)相連構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”（C-T）網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3 所示，網(wǎng)絡(luò)中共包含119 個(gè)節(jié)點(diǎn)nodes（73 個(gè)活性成分和46 個(gè)核心靶點(diǎn)）；左邊藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表活性成分，右邊紅色節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，而邊則表示活性成分與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。表4 所示為大柴胡湯治療HLP 活性成分及核心靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)度和介數(shù)值，其中MOL000098（quercetin）度數(shù)最大（31 個(gè)節(jié)點(diǎn)），其次是MOL000422（kaempferol）有28個(gè)節(jié)點(diǎn)、MOL000358（β-sitosterol）有18 個(gè)節(jié)點(diǎn)，為3 個(gè)主要活性成分；4 個(gè)主要靶點(diǎn)基因，包括PTGS1（67 節(jié)點(diǎn)）、NOS2（29 節(jié)點(diǎn)）、F2（25 節(jié)點(diǎn)）、ESR1（23 節(jié)點(diǎn)）。

表4 大柴胡湯治療HLP 活性成分及核心靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)度和介數(shù)值

圖3 大柴胡湯治療高脂血癥C-T 網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO 基因功能注釋分析和KEGG 通路富集分析 將46個(gè)核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO 基因功能注釋分析和KEGG 通路富集分析，共映射到172 個(gè)GO term，包括124 個(gè)生物過(guò)程（Biological Process，BP）、19 個(gè)細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）和29 個(gè)分子功能（Molecular Function，MF）。按照P 值大?。≒＞0.01），挑選出最顯著富集的15 個(gè)GO term 進(jìn)行作圖，結(jié)果如圖4 所示。在分子功能中，絲氨酸內(nèi)肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）和血紅素結(jié)合（heme binding）相關(guān)性最大；在細(xì)胞組分中，細(xì)胞外空腔（extracellular space）和細(xì)胞表面（cell surface）相關(guān)性最大；在生物過(guò)程中，葡萄糖穩(wěn)態(tài)（glucose homeostasis）與蛋白質(zhì)磷酸化正調(diào)控（positive regulation of protein phosphorylation）相關(guān)性最大。

圖4 GO 富集圖

通過(guò)KEGG 富集分析，活性成分潛在藥效靶點(diǎn)共參與48 條信號(hào)通路，根據(jù)P 值大小（P＞0.01），挑選出最顯著富集的15 個(gè)KEGG 通路進(jìn)行作圖，獲得相關(guān)基因31 個(gè)。如圖5 所示，最顯著富集的通路是HIF-1 signaling pathway、TNF signaling pathway 和Insulin resistance，相關(guān)靶點(diǎn)包括AKT1、SREBF1、PPARA、IL6、TNF、SLC2A4、NOS3、PTPN1、INSR、HIF1A、VEGFA、SERPINE1、NOS2、VCAM1、CCL2、MMP9、MMP3、SELE。

圖5 KEGG 富集圖

2.5 活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了直觀地反映活性成分與靶點(diǎn)和主要通路之間的關(guān)系，根據(jù)KEGG 通路富集分析結(jié)果，選擇富集度最高的前15 條信號(hào)通路為研究對(duì)象，采用Cytoscape3.7.1 軟件構(gòu)建大柴胡湯治療HLP“活性成分-靶點(diǎn)-主要通路”（C-T-P）網(wǎng)絡(luò)模型。如圖6 所示，大柴胡湯8 個(gè)組分（橙色節(jié)點(diǎn)）的52 個(gè)活性成分（藍(lán)色節(jié)點(diǎn)）共對(duì)應(yīng)到30 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)（綠色節(jié)點(diǎn)），主要生物信號(hào)通路15 條（黃色節(jié)點(diǎn)），節(jié)點(diǎn)顏色越深表示與此節(jié)點(diǎn)相連的邊越多，它的度數(shù)越大，節(jié)點(diǎn)也就越大。從C-TP 網(wǎng)絡(luò)可以發(fā)現(xiàn)，活性成分MOL000098（quercetin）作為關(guān)聯(lián)度最高的活性成分，可作用于NOS2、F2、ESR1、AKT1 和F7 等多個(gè)高關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)，涉及多條信號(hào)通路，各靶點(diǎn)相互協(xié)調(diào)，共同參與其藥理作用的發(fā)揮。

圖6 大柴胡湯治療高脂血癥C-T-P 網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證關(guān)鍵通路 通過(guò)GO 基因功能注釋分析和KEGG 通路富集分析，得到最顯著富集的通路是HIF-1 signaling pathway，相關(guān)基因 IL6、HIF1A、VEGFA、SERPINE1、NOS3、NOS2、INSR、AKT1，與關(guān)聯(lián)度最高的5 種活性成分槲皮苷（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、漢黃芩素（wogonin）、毛地黃黃酮（luteolin）和異鼠李素（isorhamnetin）進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果如表5 所示，可知5 種活性成分與HIF-1 signaling pathway 的絕大部分相關(guān)基因獲得較好的對(duì)接分?jǐn)?shù)，驗(yàn)證了本研究結(jié)果的可靠性。

表5 分子對(duì)接結(jié)果

NOS2 靶點(diǎn)是C-P-T 網(wǎng)絡(luò)圖的核心節(jié)點(diǎn)，分子對(duì)接結(jié)果顯示，關(guān)聯(lián)度最高的5 種活性成分與NOS2 對(duì)接活性均高于其他靶點(diǎn)。其中，關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)quercetin（槲皮苷）能穩(wěn)定地接入NOS2 蛋白的活性口袋，通過(guò)與蛋白活性中心口袋的卟啉基團(tuán)和GLU377 氨基酸形成分子間氫鍵，與PRO350、TYR373 和VAL352 形成分子間疏水鍵，維持NOS2 蛋白活性口袋的穩(wěn)定，如圖7 所示。

圖7 活性成分quercetin（槲皮苷）與NOS2（PDB：2nsi） 相互作用的分子對(duì)接圖

3 討論

高脂血癥可直接引發(fā)多種嚴(yán)重危害人體健康的疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、胰腺炎等，中醫(yī)通常采用健脾益氣、補(bǔ)益肝腎、化濕泄?jié)?、祛瘀化痰等方法進(jìn)行治療［14]。大柴胡湯為治療少陽(yáng)陽(yáng)明合病方，有清利肝膽、通腑泄?jié)?、和中健脾的作用，因此很多醫(yī)家用其治療高脂癥，并取得很好的療效［15]。本研究通過(guò)TCMPS 數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出大柴胡湯8 種組分的化學(xué)成分133 個(gè)，大柴胡湯相對(duì)應(yīng)的疾病靶點(diǎn)288 個(gè)，通過(guò)共有靶標(biāo)分析，8 味中藥均存在多個(gè)共同靶標(biāo)，說(shuō)明它們之間存在多種協(xié)同或拮抗作用，多味藥中不同的化學(xué)成分可以相繼與靶點(diǎn)分子結(jié)合，形成疊加效應(yīng)共同發(fā)揮作用，不同的靶點(diǎn)又可能隸屬同一通路，彼此交織形成網(wǎng)絡(luò)，可能是大柴胡湯治療高血脂癥的原因所在。

通過(guò)口服利用度和類藥性篩選，得到大柴胡湯活性成分133 個(gè)，槲皮苷在C-T 網(wǎng)絡(luò)和C-T-P 網(wǎng)絡(luò)中均為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，并且經(jīng)過(guò)分子對(duì)接證明了其與對(duì)多個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)均具有良好的對(duì)接活性。槲皮苷是一種黃酮類單體化合物，廣泛存在于植物中，藥理研究表明，其具有降血糖、降血脂、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理作用［16]，邢影等［17]發(fā)現(xiàn)槲皮苷能顯著降低高脂血癥大鼠血清和肝臟中總膽固醇和甘油三酯水平，調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠的血脂代謝，抑制肝臟脂肪沉積。

通過(guò)對(duì)大柴胡湯C-T 網(wǎng)絡(luò)、C-T-P 及PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，認(rèn)為PTGS1、NOS2、VEGFA、IL6 等靶點(diǎn)是大柴胡湯治療高血脂癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。PTGS1（環(huán)氧化酶），可調(diào)節(jié)花生四烯酸類物質(zhì)的生成，后者調(diào)節(jié)可促進(jìn)血管壁動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成的生理過(guò)程，包括血小板聚集、控制血管張力及局部炎癥反應(yīng)［18]。NOS2（一氧化氮合酶）和IL6（白細(xì)胞介素6）是兩個(gè)重要的炎癥因子，研究表明高血脂癥與主要炎癥因子具有一定相關(guān)性，常一川等研究發(fā)現(xiàn)大柴胡湯對(duì)高脂高膽固醇大鼠心肌組織內(nèi)TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)［19-20]；VEGFA（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A）是PDGF/VEGF 生長(zhǎng)因子家族的成員，在血管生成、血管發(fā)生和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞遷移、抑制凋亡并誘導(dǎo)血管通透性，可以調(diào)節(jié)脂肪組織分化、基因表達(dá)和生物學(xué)功能的平衡［21]。

經(jīng)GO 基因功能注釋，發(fā)現(xiàn)大柴胡湯活性成分對(duì)葡萄糖穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、巨噬細(xì)胞衍生泡沫細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路和膽固醇代謝過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程有一定影響，并在大柴胡湯治療高血脂癥所涉及的作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路中有所體現(xiàn)。KEGG 通路富集顯示，HIF-1 signaling pathway（低氧誘導(dǎo)因子1 信號(hào)通路）、TNF signaling pathway（腫瘤壞死因子信號(hào)通路）和Insulin resistance（胰島素抵抗）通路是主要的富集通路，研究表明，通過(guò)HIF-1 signaling pathway 可以調(diào)節(jié)HIF-1 的活性，能激活多種缺氧反應(yīng)基因的表達(dá)，組織缺氧可誘導(dǎo)HIF-1的活性上調(diào)并激活其下游因子內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的高表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化，減小高血脂癥對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損失［22]；TNF signaling pathway 中的TNF-α 是脂肪細(xì)胞的分泌產(chǎn)物之一，其可促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞、脂肪細(xì)胞凋亡，抑制前體脂肪細(xì)胞分化，抑制脂肪合成，也可以刺激脂肪細(xì)胞脂質(zhì)分解加速，導(dǎo)致游離脂肪酸升高，并抑制胰島素信號(hào)通路，導(dǎo)致胰島素抵抗［23-24]；Insulin resistance 與高血脂癥關(guān)系密切，高血脂患者容易導(dǎo)致胰島素抵抗，同時(shí)，胰島素抵抗使胰島素靶細(xì)胞對(duì)胰島素不敏感，血漿葡萄糖不能被靶細(xì)胞攝取導(dǎo)致血漿葡萄糖水平升高，機(jī)體需要攝取血漿中過(guò)多的葡萄糖合成脂肪儲(chǔ)存于靶細(xì)胞，維持著糖代謝平衡，引起高血脂癥［25-26]。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法挖掘大柴胡湯治療高血脂癥的活性成分，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及通路富集闡述了活性成分與作用靶點(diǎn)和通路之間的聯(lián)系，揭示了大柴胡湯治療高血脂癥的潛在分子機(jī)制，為該方臨床應(yīng)用及深入研究提供了理論依據(jù)。