田立霞，姜 丹，楊 瑾，周夢云，劉慧聰，黃小燕，顧祖曦，徐蓮薇，李 佶

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200043；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，上海 201203）

多囊卵巢綜合征（Polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡期女性最常見的內(nèi)分泌疾病，臨床表現(xiàn)高度異質(zhì)，是以生殖障礙、內(nèi)分泌異常、代謝紊亂和精神問題為特征的一組臨床綜合征［1]。其發(fā)病率為5%～11%之間［2]。多項研究提示卵巢分泌雄激素過多和機(jī)體存在胰島素抵抗是PCOS 病理生理變化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［3-4]；相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)多囊卵巢綜合征存在慢性炎癥，并且胰島素抵抗和慢性炎癥的有著密切的關(guān)系［5-6]，慢性炎癥如何影響著胰島素抵抗，其機(jī)制研究可能對PCOS 的治療有著一定的意義。在治療上，各種西醫(yī)的治療方法均不能有效的改善PCOS，因此研究中醫(yī)藥治療PCOS 變得尤為重要。促排湯是孫卓君教授的經(jīng)驗方，在先前的臨床研究中，治療效果較滿意［7]。該實驗以胰島素抵抗PCOS 大鼠模型為研究對象，觀察促排湯對模型大鼠胰島素抵抗以及炎癥微環(huán)境的調(diào)控作用，為促排湯的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 脫氫表雄酮（DHEA）（批號BCSW201708）購于西安韻禾生物科技有限公司；注射用大豆油（批號20170803）購于浙江田雨山藥用油有限公司；羧甲基纖維素鈉（批號2017080250）購于上海萬照精細(xì)化工有限公司；格華止（二甲雙胍片，850 mg，批號AAR3600，中美上海施貴寶制藥有限公司）。促排湯（肉蓯蓉12 g、三棱9 g、柴胡9 g、菟絲子12 g、山茱萸9 g、當(dāng)歸10 g、熟地黃10 g、覆盆子12 g），為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院新綠藥免煎劑型。

PCR 試劑盒（OX-LDL、TLR-4 mRNA）購于上海思兆生物科技有限公司；ELISA 試劑盒（IL-6、TNF-α、IRS-2、胰島素）購自上海奧威生物科技有限公司；RIPA 裂解液（WB0101 和WB0102）、BCA 蛋白定量試劑盒（WB0123 和WB2123）、SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒（WB0130）、5×SDS蛋白上樣緩沖液（WB0133）、ECL 超敏發(fā)光試劑盒（WB0164）、電泳液（WB0132）、轉(zhuǎn)膜液（WB0154）、一抗稀釋液（WB0158）、二抗稀釋液（WB0159）、封閉液（WB0161）TBE、6×Loading buffer 購于上海威奧生物科技有限公司；Trizol、隨機(jī)引物、RNA 酶抑制劑及First Strand cDNA synthesis Kit 購于美國英杰生物技術(shù)有限公司；QuantityNova SYBR Green PCR Kit 購于湖南凱杰科技有限公司。

1.2 儀器 末梢血糖儀（德國拜耳公司）；小型垂直電泳槽（165-8001）、小型Trans-Blot 轉(zhuǎn)印槽（170-3930，美國Bio-Rad 公司）；組織勻漿器（TL-2010S，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；超聲波細(xì)胞破碎儀（JY88-II，寧波新芝生物科技股份有限公司）；臺式高速冷凍離心機(jī)（Fresco21，美國Thermo 公司）高速臺式離心機(jī)（TGL-16B，上海安亭科學(xué)儀器廠）；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（GHP-9080，上海一恒科技有限公司）；脫色搖床（TS-1，海門其林貝爾儀器制造有限公司）；全波長酶標(biāo)儀（MutiskanTM GO，美國Thermo 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（GIS-1600，上海天能科技有限公司）；梯度PCR 儀（Veriti DX，美國Life 公司）；生物安全柜（BHC-1300，蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.3 動物 實驗用鼠為SPF 級雌性wistar 大鼠，21 日齡，購買于上海市西普爾必凱實驗動物有限公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2013-0016]，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)，飼料由該中心提供。大鼠自由攝食和飲水，25 ℃恒溫，50% 相對濕度，清潔級飼養(yǎng)，12 h 光照（6：00 至18：00）和12 h 黑暗（18：00 至6：00）周期交替進(jìn)行。

1.4 分組與給藥 按丁風(fēng)娟等［8]脫氫表雄酮造模法［9]，分組當(dāng)日給予病理模型組大鼠每日頸背部皮下注射溶于注射用大豆油的脫氫表雄酮（Dehydroepiandrosterone，DHEA）溶液60 mg/kg，而對照組大鼠給予同容量注射用大豆油，注射頸背部皮下。用藥20 d 后，采用甲藍(lán)染色法，觀察大鼠陰道脫落細(xì)胞學(xué)變化情況。陰道脫落上皮細(xì)胞呈角化狀態(tài)，持續(xù)10 d，提示為誘導(dǎo)成功的PCOS 模型大鼠。禁食12 h，眼眶取血測空腹血糖、胰島素及雄激素，測定HOMA 值。把造模成功的大鼠，依隨機(jī)數(shù)目法，分到促排湯組、陽性對照組和模型組，每組各10 只。促排湯組每日給予100 mg/kg 灌胃，陽性對照組每日給予格華止溶液100 mg/kg 灌胃，模型組和正常組均每日給予1%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。連續(xù)灌胃28 d 后，禁食禁水12 h，成功麻醉大鼠后，從腹主動脈采血，以2 000 r/min 離心15 min，分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采血后斷頸處死大鼠，把一側(cè)卵巢用10% 福爾馬林溶液固定，另一側(cè)于液氮冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 HOMA-IR 大鼠禁食12 h 后稱定質(zhì)量，采目內(nèi)眥取血法測定血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)PG）水平和ELISA 法測定胰島素（FINS）水平。采用穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR）評估胰島素抵抗程度，計算公式為HOMA-IR=FINS（mIU/L）×FPG（mmol/L）/22.5［10]。藥物干預(yù)結(jié)束后，復(fù)測以上指標(biāo)。

1.5.2 各組大鼠卵巢組織形態(tài)改變 通過蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin-eosin staining，HE）觀察大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)的改變，10%福爾馬林液固定后的卵巢組織流水沖洗30 min，放入50%～90%乙醇各1 h 脫水處理，再放入二甲苯中透明，隨放入石蠟中包埋，標(biāo)記好存放待用，將包埋好的蠟塊切片，厚度約5 μm，二甲苯脫蠟，酒精脫水，先后放于蘇木精溶液、伊紅染色液中染色，晾干，封片。

1.5.3 各組大鼠卵巢組織的炎性因子、受體底物水平 把包埋處理的卵巢組織進(jìn)行切片，通過免疫組織化學(xué)法檢測胰島素抵抗大鼠卵巢組織的炎性因子白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、胰島素受體底物-2（Insulin receptor substrate-2，IRS-2）水平。

把組織切片放入59 ℃恒溫箱中烘烤1 h 后，分別置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ溶液中各10 min，放入無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅲ各浸泡10 min，后蒸餾水浸泡沖洗15 min，進(jìn)行脫蠟和水化；用3% H2O2200 mL浸泡10 min 滅活，再用流水沖洗約10 min；稀釋1倍的修復(fù)液微波爐高火預(yù)熱2 min 中，加入組織片，加滿修復(fù)液，微波爐高火修復(fù)10 min，冷卻后進(jìn)行第2 次高火修復(fù)12 min，冷卻至室溫后倒去修復(fù)液，PBS 洗滌2 次，各15 min，滴加5% BSA 封閉液，室溫放置35 min，配制一抗，去除多余液體（不洗），滴加適量的一抗，4 ℃過夜；第二天取出組織片，PBS 沖洗4 次，每次15 min，擦去表明液體，滴加二抗，37 ℃下放置35 min，組織切片再用PBS 洗滌4 次，各15 min，顯色，觀察。依據(jù)試劑盒說明配制顯色液，顯色完流水沖洗十余分鐘，進(jìn)行復(fù)染，滴加蘇木素染液，浸染2 min，沖洗10 min，觀察顏色，脫水，在1 缸無水乙醇中涮一下，2 缸無水酒精及3 缸二甲苯中各方3 min，封片，加1 d 封片塑膠，蓋片。通過醫(yī)學(xué)圖像定量分析軟件分析，顯微鏡物鏡選×40（目鏡×10），去除免疫組化中的紫藍(lán)色背景，有效陰性區(qū)用藍(lán)色表示，有效陽性區(qū)用紅色表示。

1.5.4 大鼠卵巢組織Ox-LDL、TLR-4 mRNA 表達(dá) 應(yīng)用RT-PCR 法，具體引物序列（逆轉(zhuǎn)錄酶和引物）見表1。綠豆大小的卵巢組織勻漿，加入1 mL Trizol 提取總RNA，依照試劑盒說明配成20 μL 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，打勻后25 ℃，5 min，42 ℃下擴(kuò)增60 min；70 ℃下變性處理5 min；高速（＞5 000×g）離心5 s，-20 ℃保存，把11 μL 聚合酶鏈反應(yīng)體系在95 ℃下變性2 min，95 ℃下變性5 s，60 ℃下延伸30 s，變性，退火，延伸重復(fù)45 個循環(huán)，60 ℃下延伸5 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。取出5 μL 產(chǎn)物，在2%的瓊脂糖凝膠上給予80 V 電壓下電泳30 min，借助凝膠電泳成像系統(tǒng)拍照，取得條帶密度值和面積等數(shù)據(jù)，通過與內(nèi)標(biāo)基因（GAPDH）擴(kuò)增產(chǎn)物的灰度比來體現(xiàn)各基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.5.5 卵巢組織OX-LDL、TLR-4 蛋白表達(dá) 采用Western blot 法。提取標(biāo)本卵巢組織蛋白質(zhì)，應(yīng)用BCA 蛋白濃度測定試劑盒來測定蛋白濃度，標(biāo)本進(jìn)行TEMED 凝膠電泳，轉(zhuǎn)模，封閉，加入一抗OX-LDLR1（1∶400）、TLR4（1∶800）和GAPDH（1∶2 000），在4 ℃條件下孵育過夜。處理后的標(biāo)本洗滌后再加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（Jackson 1∶2000）和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠二抗（1∶2 000）混合后，在室溫下孵育2 h，充分洗滌，化學(xué)發(fā)光，顯影，定影，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。內(nèi)參選用GAPDH，結(jié)果利用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），2 組間比較采用雙側(cè)t 檢驗（two-tailed student’s t test）。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物一般情況 DHEA 溶液連續(xù)皮下注射20 d 后，觀察大鼠落細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化及HOMA-IR 值，其中30 只大鼠造模成功。把30 只模型大鼠按隨機(jī)數(shù)目表法隨機(jī)分為模型組、促排湯組以及陽性對照組，各10 只，另外10 只有規(guī)律性周期的大鼠作為正常對照組，繼續(xù)后續(xù)實驗。給藥28 d 后，性周期恢復(fù)情況為模型組中1 只，促排湯組中6只，陽性對照組中7 只。

2.2 不同組別大鼠卵巢形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 正常組大鼠卵巢鏡下可見各級卵泡及黃體多枚，優(yōu)勢卵泡的顆粒細(xì)胞層厚約8～9 層；模型組卵巢鏡下見囊性擴(kuò)張的卵泡，囊內(nèi)無卵母細(xì)胞及放射冠，卵泡內(nèi)僅3～4 層顆粒細(xì)胞，黃體減少；促排湯組和陽性對照組鏡下卵巢組織可見各期別卵泡及黃體數(shù)目增多，卵泡內(nèi)的顆粒細(xì)胞層數(shù)約3～7 層。具體見圖1。

圖1 各組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)（HE，×40）

2.3 不同組別大鼠胰島素抵抗指數(shù)的變化 與正常組比較，模型組大鼠HOMA-IR 值增高（P＜0.01）；促排湯組、陽性對照組大鼠HOMA-IR 值低于模型組（P＜0.01）；促排湯組大鼠HOMA-IR 值高于陽性對照組（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠胰島素抵抗HOMA-IR 值（，n=10）

表2 各組大鼠胰島素抵抗HOMA-IR 值（，n=10）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；促排湯與二甲雙胍組比較，☆P＜0.05。

2.4 促排湯對IL-6、TNF-α 的影響以及IRS-2 磷酸化表達(dá)的影響 模型組卵巢組織中IL-6、TNF-α 的陽性表達(dá)較正常組增高（P＜0.01）；促排湯組及陽性對照組卵巢組織中IL-6、TNF-α 陽性表達(dá)皆低于模型組（P＜0.01）；模型組IRS-2 磷酸化陽性表達(dá)較正常組降低（P＜0.01）；而促排湯組和陽性對照組IRS-2 磷酸化陽性表達(dá)均高于模型組（P＜0.01）。具體見圖2、表3。

表3 各組大鼠卵巢組織IL-6、TNF-α、IRS-2 表達(dá)（，n=5）

表3 各組大鼠卵巢組織IL-6、TNF-α、IRS-2 表達(dá)（，n=5）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；促排湯與二甲雙胍組比較，☆P＜0.05。

圖2 各組大鼠免疫組化圖（×40）

2.5 促排湯對OX-LDL、TLR-4 蛋白及mRNA 表達(dá)的影響模型組大鼠OX-LDL、TLR-4 mRNA 表達(dá)高于正常組（P＜0.01）；促排湯組與二甲雙胍組大鼠OX-LDL、TLR-4 mRNA表達(dá)水平低于模型組（P＜0.01），見表4。OX-LDL、TLR-4蛋白表達(dá)模型組最高，促排湯組大鼠與陽性對照組均有下降，見圖3。

表4 各組大鼠卵巢OX-LDL、 TLR-4 mRNA 表達(dá)（，n=4）

表4 各組大鼠卵巢OX-LDL、 TLR-4 mRNA 表達(dá)（，n=4）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

圖3 各組大鼠卵巢OX-LDL、TLR-4 蛋白表達(dá)

3 討論

3.1 PCOS 胰島素抵抗與PCOS 慢性炎癥 多囊卵巢綜合征主要病理生理的特點是卵巢雄激素功能異常，導(dǎo)致高雄激素血癥，出現(xiàn)了多毛，少或無排卵，以及多囊卵巢等臨床特征［11]，胰島素抵抗亦是多囊卵巢綜合征的主要特征之一［12]。在性激素生物合成途徑中，DHEA 通過△5 途徑促進(jìn)睪酮的合成，外源性給予DHEA 可以造成雄烯二酮水平增高，從而導(dǎo)致睪酮及雌酮水平升高，引起卵泡發(fā)育停滯，產(chǎn)生排卵障礙，提示DHEA 升高可能是導(dǎo)致PCOS 的一個主要原因［13]，并且是胰島素抵抗型PCOS 制備的理想模型［9]。在該動物實驗研究中，用DHEA 造模成功后，大鼠的胰島素釋放實驗、HOMA-IR 與正常組大鼠比較，明顯增高；大鼠卵巢的組織切片提示卵泡停止發(fā)育；上述結(jié)果提示高雄激素可導(dǎo)致幼鼠發(fā)育成多囊卵巢大鼠，并存在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，DHEA 注射法是制備胰島素抵抗PCOS 模型的有效方法之一。PCOS 胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制主要有受體前缺陷、受體缺陷以及受體后缺陷，因此PCOS 的發(fā)病機(jī)制之一是胰島素受體傳導(dǎo)缺陷［14]。模型大鼠的免疫組化結(jié)果提示，PCOS 大鼠的IRS-2 磷酸化表達(dá)降低，表明PCOS 胰島素抵抗模型在胰島素底物方面存在的異常。

近期的多項研究提示，PCOS 存在低度慢性炎癥，這種炎癥可能與機(jī)體的胰島素抵抗相關(guān)［15]。與免疫和炎癥相關(guān)的TLRs 樣受體是TLR-4，當(dāng)TLR-4 受體與配體結(jié)合后，激活一系列炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生IL-6、TNF-α 等炎性因子，導(dǎo)致了機(jī)體的微環(huán)境處于慢性炎癥狀態(tài)［16-17]，OX-LDL 是TLR-4 的內(nèi)源性配體［17]。有關(guān)研究證實PCOS 患者在糖代謝過程中，己糖支路活躍，導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激的激活，OX-LDL水平升高［18]。該研究數(shù)據(jù)提示，胰島素抵抗大鼠的卵巢組織TNF-α 及IL-6 明顯增加，TLR-4 及OX-LDL 基因及蛋白表達(dá)水平增高，提示多囊卵巢存在低度炎癥反應(yīng)。其機(jī)制可能是PCOS 患者因為糖的異常代謝，使得OX-LDL 水平增高，激活細(xì)胞Toll 樣受體，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)激活，引起IL-6、TNF-α 等炎性因子增加；另外卵巢組織中IRS-2 水平下降，導(dǎo)致胰島素信號傳導(dǎo)受限，而此時炎癥反應(yīng)活躍，炎癥信號通路與胰島素信號通路之間可能有交叉影響，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素信號傳導(dǎo)能力下降。

3.2 促排湯對PCOS 胰島素抵抗的治療作用 近年來研究認(rèn)為多囊卵巢綜合征的病機(jī)與腎、肝、脾三臟功能失調(diào)及痰濕、血瘀密切相關(guān)［19]，孫卓君教授的促排湯，君藥為菟絲子和肉蓯蓉，兩藥相須為用，共補腎陽。柴胡、紅花、三棱作為臣，疏肝理氣、破血活血，佐以滋腎填精養(yǎng)血的當(dāng)歸、熟地黃、山茱萸，全方即補益腎精，又能補腎陰陽，達(dá)到溫補而不燥，補而不峻，達(dá)到“陰陽調(diào)和”，以促排卵［20]。既往的臨床研究顯示，促排湯能較好的改善PCOS排卵情況，改善糖代謝異常［19]。本實驗研究提示，給予PCOS 胰島素抵抗模型大鼠促排湯中藥灌胃治療后，IL-6、TNF-α 等炎性因子較模型組明顯下降（P ＜0.05），另外TLR-4、OX-LDL 基因及蛋白與模型組比較均有降低（P＜0.05），提示促排湯可能通過抑制TLR-4 以及OX-LDL 的表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)。

多囊卵巢綜合征是伴隨女性一生的內(nèi)分泌失調(diào)性的慢性疾病，針對胰島素抵抗的基本特征，根據(jù)不同時期的需求進(jìn)行長期管理，是治療的基本原則。該課題以多囊卵巢綜合征胰島素抵抗與微環(huán)境炎癥的關(guān)系進(jìn)行探討。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，有關(guān)胰島素抵抗的信號通路是一個交織的信號通路網(wǎng)。本研究結(jié)果提示促排湯可以治療胰島素抵抗，胰島素抵抗與炎癥微環(huán)境間存在相互關(guān)聯(lián)，具體的信號通路可能與TLR/NF-κB 信號通路有關(guān)，有待進(jìn)一步的研究證明。