馬天鵬，李 想，林 丹，謝毅強(qiáng)*

（1.海南醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571199；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025）

食管癌是常見的惡性腫瘤，2018 年全世界約有57.2 萬例新發(fā)病例和50.9 萬例死亡病例［1]。轉(zhuǎn)移是實(shí)體瘤的一個主要惡性生物學(xué)行為，因?yàn)檫@種現(xiàn)象與不良預(yù)后密切相關(guān)，并且導(dǎo)致大多數(shù)癌癥相關(guān)死亡［2]。目前認(rèn)為，腫瘤轉(zhuǎn)移仍然是食管癌相關(guān)死亡的主要原因，因此，有必要鑒定或開發(fā)具有抗轉(zhuǎn)移能力的藥物用于其治療。

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多步驟的過程，細(xì)胞外基質(zhì)降解就是其主要步驟，而基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）在這個過程中起著不可或缺的作用［3]。PI3K/Akt 通路過度激活常存在于食管癌中，并與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過程均相關(guān)，已有研究證明它通過促進(jìn)MMPs 的分泌而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［4]。PI3K/Akt 途徑的激活可以影響多種細(xì)胞外信號，包括哺乳動物雷帕霉素受體蛋白（mTOR）途徑的激活。因此，PI3K/Akt/mTOR 是抑制食管癌轉(zhuǎn)移的一個重要通路。

姜黃素是從姜黃Curcumin 屬植物根莖中提取的一種天然植物多酚。姜黃素具有多種藥理作用，如抗炎、抗氧化、抗血管生成、鎮(zhèn)痛和抗菌作用［5]。先前的研究表明，姜黃素具有廣泛的抗腫瘤作用［6-8]。除抗癌特性外，姜黃素因其低毒性和患者的良好耐受性被認(rèn)為是一種安全的化合物，表明姜黃素有潛力成為一種新型的抗癌劑。但鮮有食管癌相關(guān)研究的報道，因此，本研究首先觀察姜黃素對食管癌細(xì)胞的影響，尤其是其侵襲和遷移能力的改變，并對其潛在機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料

1.1 藥物與試劑 人食管鱗癌細(xì)胞株Kyse-150 由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心提供。姜黃素（貨號458-37-7，純度≥98.0%）購自上海詩丹得生物技術(shù)有限公司，經(jīng)二甲基亞砜（DMSO）溶解成母液，儲存于-20 ℃，后經(jīng)完全培養(yǎng)基稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度，于4 ℃保存?zhèn)溆茫籆CK-8 試劑盒購自上海東仁實(shí)業(yè)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；胎牛血清和RPMI 1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；Transwell 小室和Matrigel 膠購自美國Corning 公司；總RNA 提取試劑購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；β-actin、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein 9，MMP-9）和基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）兔抗人單克隆抗體及HRP 標(biāo)記的二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；Akt、p-Akt（Ser473）、mTOR和p-mTOR（Ser2448）購自英國Abcam 公司。

1.2 儀器 全自動全波長酶標(biāo)儀購自美國MD 公司；實(shí)時熒光定量PCR 儀購自美國Thermo 公司；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 食管癌Kyse-150 細(xì)胞用RPMI 1640 培養(yǎng)基放在37 ℃、含5% CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)添加10%的胎牛血清和1%的青霉素、鏈霉素。待單層細(xì)胞融合度達(dá)80%～90% 時，進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞消化、傳代，以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖抑制 CCK-8 法測定姜黃素細(xì)胞毒性。Kyse-150 細(xì)胞接種在96 孔板中（3×103/孔），在37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育過夜，并加入不同濃度（10～160 nmol/L）的姜黃素處理24、48 h。同批細(xì)胞經(jīng)含0.1% DMSO（經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其對細(xì)胞生長無明顯影響）的培養(yǎng)液處理后作為對照組。隨后，向每個孔中加入10 μL CCK-8 溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm 處測量光密度值（OD），并設(shè)定對照組細(xì)胞存活率為100%，抑制率=［1-（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）] × 100%。

2.3 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞平面遷移能力 將Kyse-150細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板（1×106/孔）中培養(yǎng)24 h，生長良好的單層細(xì)胞用200 μL 移液器尖端劃傷，用PBS 洗去不黏附的細(xì)胞。加入含10、20 nmol/L 姜黃素的完全培養(yǎng)基分別處理24、48 h，倒置顯微鏡下每孔選擇5 個視野，拍攝劃痕傷口的圖像。

2.4 Transwell 小室法檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力 用無血清培養(yǎng)基將常規(guī)培養(yǎng)的Kyse-150 細(xì)胞稀釋至5×105/mL，將100 μL 懸浮液添加到Transwell 上室，涂以用無血清培養(yǎng)基1∶4 稀釋后的Matrigel。在下室中，向24 孔板中加入600 μL含有15%胎牛血清、10 nmol/L 或20 nmol/L 姜黃素的RPMI-1640 培養(yǎng)基。細(xì)胞在37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，隨后用甲醇在-20 ℃固定10 min。用棉簽去除上室Matrigel 內(nèi)側(cè)的細(xì)胞。侵襲到膜下側(cè)的細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫在室溫染色20 min，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)侵襲成功的細(xì)胞。Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)中，Transwell 上室未涂覆Matrigel，其余步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

2.5 RT-PCR 檢測各組細(xì)胞mRNA 表達(dá) 用10、20 nmol/L的姜黃素處理Kyse-150 細(xì)胞24 h，采用TRIzol 法提取各組細(xì)胞總RNA，每個樣品離心后，取1 μL RNA 進(jìn)行cDNA合成。每個cDNA 樣本加入3 個復(fù)孔，整個過程按照RTPCR 試劑盒說明書操作。引物序 列： β-actin 正向5′-TGTTTGAGACCTTCAACACCC-3′，反向5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAGG-3′；Akt 正向5′-GCAGGATGTGGACCAACGTGAG-3′，反向5′-GCAGGCAGCGGATGATGAAGG-3′；mTOR正向5′-GAGATACGCTGTCATCCCTTTA-3′，反向 5′-CTGTATTATTGACGGCATGCTC -3′；MMP-2 正向5′-CACCTACACCAAGAACTTCCGTCTG-3′，反向 5′-GTGCCAAGGTCAATGTCAGGAGAG-3′；MMP-9 正向5′-TCCTGGTGCTCCTGGTGCTG-3′，反向5′-CTGCCTGTCGGTGAGATTGGTTC-3′。PCR 擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性，10 min；變性95 ℃，15 秒；退火/延伸60 ℃，1 min，共40 個循環(huán)。

2.6 Western blot 檢測各組細(xì)胞中蛋白表達(dá) 用10、20 nmol/L的姜黃素處理培養(yǎng)在100 mm 培養(yǎng)皿中的Kyse-150 細(xì)胞，24 h 后收獲細(xì)胞并用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞。使用BCA 試劑盒測量蛋白質(zhì)含量。煮沸變性后，等量的蛋白樣品（30 μg）用4%～10% SDSPAGE 電泳分離，隨后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜2 h，用一抗4 ℃孵育過夜，然后與二抗（1：10 000）在室溫下孵育1 h。使用凝膠成像系統(tǒng)檢測目標(biāo)蛋白，通過Image J 軟件分析印跡灰度，從而對目的蛋白進(jìn)行半定量，以β-actin 作為內(nèi)參。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。 P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 姜黃素對食管癌Kyse-150 細(xì)胞增殖的抑制作用 圖1顯示，10～160 nmol/L 姜黃素可抑制Kyse-150 細(xì)胞的增殖，且隨著藥物濃度的增加越明顯。姜黃素在Kyse-150 細(xì)胞中24、48 h 的半數(shù)抑制濃度分別為59.55、41.51 nmol/L，為避免高細(xì)胞毒性對細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響，選擇10、20 nmol/L 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 姜黃素對食管癌Kyse-150 細(xì)胞增殖的抑制作用（n=3）

3.2 姜黃素對食管癌Kyse-150 細(xì)胞遷移的抑制作用 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，姜黃素的處理在一定程度上減慢了細(xì)胞平面遷移的速度和能力，對照組的傷口在24 h 時幾乎完全融合，而姜黃素處理組的傷口在48 h 仍未愈合，劃痕愈合率降低（P＜0.01）（圖2）。另外，與對照組相比，10、20 nmol/L 姜黃素組細(xì)胞遷移成功細(xì)胞減少（P＜0.01）（圖3A）。以上結(jié)果表明，經(jīng)姜黃素處理后Kyse-150 細(xì)胞的遷移能力減弱。

圖2 姜黃素對Kyse-150 細(xì)胞平面遷移的抑制作用（×40，n=3）

3.3 姜黃素對食管癌Kyse-150 細(xì)胞侵襲的抑制作用 與對照組相比，10、20 nmol/L 的姜黃素組細(xì)胞侵襲成功細(xì)胞減少（P＜0.01）（圖3B），表明姜黃素可以抑制Kyse-150細(xì)胞的侵襲能力。

圖3 姜黃素對Kyse-150 細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用（×200，n=3）

3.4 姜黃素對食管癌Kyse-150 細(xì)胞中侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白mRNA 表達(dá)的抑制作用 如表1 所示，姜黃素10 nmol/L 組MMP-2、MMP-9 mRNA 表達(dá)低于DMSO 對照組（P＜0.01）；姜黃素20 nmol/L 組MMP-2、MMP-9 mRNA 表達(dá)也低于DMSO 對照組（P＜0.01）。然而，無論是姜黃素10 nmol/L還是20 nmol/L，Akt 和mTOR mRNA 表達(dá)均無變化。

表1 姜黃素對Kyse-150 細(xì)胞中Akt、 mTOR、 MMP-2、 MMP-9 mRNA 表達(dá)的影響（，n=3）

表1 姜黃素對Kyse-150 細(xì)胞中Akt、 mTOR、 MMP-2、 MMP-9 mRNA 表達(dá)的影響（，n=3）

注：與DMSO 組比較，**P＜0.01。

3.5 姜黃素下調(diào)食管癌Kyse-150 細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 如圖4 所示，姜黃素使Kyse-150 細(xì)胞中Akt、mTOR 的磷酸化水平降低（P＜0.05），尤其是20 nmol/L 組蛋白磷酸化水平下降（P＜0.01），但總的Akt、mTOR 的表達(dá)水平無變化。此外，侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP2 和MMP-9 的表達(dá)在藥物治療后也下調(diào)（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，姜黃素可抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路。

圖4 姜黃素對Kyse-150 細(xì)胞中蛋白相對表達(dá)的影響（，n=3）

4 討論

到目前為止，化療是治療轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性癌癥不可或缺的選擇。姜黃素是姜黃屬植物主要的活性成分，它在多種癌細(xì)胞中顯示出強(qiáng)大的抗增殖活性［5-7]，本研究旨在證明姜黃素具有抗食管癌活性。先前的研究表明，姜黃素可以抑制肝癌、乳腺癌、肺癌和淋巴瘤等多種實(shí)體瘤的增殖、侵襲和遷移［8]，本研究首次證實(shí)姜黃素對人Kyse-150 食管癌細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性，且呈劑量依賴性。此外，本研究使用不同轉(zhuǎn)移細(xì)胞模型觀察姜黃素對細(xì)胞侵襲和遷移的影響，發(fā)現(xiàn)姜黃素可以顯著抑制Kyse-150 細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，細(xì)胞外基質(zhì)降解是一個重要的步驟。MMPs 是一個具有多方面作用的內(nèi)肽酶家族，最著名的是它們降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的能力。它們在腫瘤細(xì)胞侵襲中起關(guān)鍵作用，并參與腫瘤轉(zhuǎn)移的許多步驟。眾所周知，MMP-2 和MMP-9 的上調(diào)與食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。已有研究表明，姜黃素可以通過減弱上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、減少血管生成和阻止MMPs 降解細(xì)胞外基質(zhì)等多種機(jī)制抑制腫瘤的遷移和侵襲［9]。在本研究中，實(shí)時熒光定量PCR 和Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在姜黃素處理后的Kyse-150 細(xì)胞中MMP-2 和MMP-9 基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平均下調(diào)。這一結(jié)果與已經(jīng)報道的關(guān)于姜黃素抗癌機(jī)制的研究相似，提示姜黃素可以抑制人食管癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，且這一現(xiàn)象與MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)減少有關(guān)。

接下來，本研究進(jìn)一步探討姜黃素下調(diào)MMPs 的可能機(jī)制。研究表明，PI3K/Akt/mTOR 信號通路的過度表達(dá)參與了食管鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展［10]。先前的研究表明，姜黃素可以抑制PI3K/Akt 及其下游靶標(biāo)mTOR 的磷酸化［11-12]。PI3K/Akt/mTOR 信號通路保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡，并在調(diào)節(jié)各種癌細(xì)胞的生長、遷移和凋亡中發(fā)揮重要作用［13]，而mTOR［14]則作為細(xì)胞增殖、生長和存活的重要調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，其過度表達(dá)被證明是一種獨(dú)立的不良預(yù)后因素［8]。有研究證實(shí)PI3K/Akt/mTOR 過度活化后影響下游多種效應(yīng)分子MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)，在癌細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮促進(jìn)增殖、遷移侵襲等關(guān)鍵作用［15]。因此，本研究關(guān)注這一途徑，發(fā)現(xiàn)經(jīng)姜黃素處理后，隨著食管癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的下降，MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)也隨之減少，而AKT 和mTOR 磷酸化水平降低，但AKT 和mTOR 的基因轉(zhuǎn)錄和總蛋白改變不大?；谶@些結(jié)果，本研究認(rèn)為姜黃素可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR 通路的磷酸化，進(jìn)而下調(diào)MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)。

綜上所述，本研究證實(shí)姜黃素通過抑制PI3K/Akt/mTOR 通路下調(diào)MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)，從而抑制食管癌細(xì)胞侵襲和遷移。姜黃素可能是一種潛在的抗食管癌轉(zhuǎn)移的藥物。

致謝：本實(shí)驗(yàn)在海南醫(yī)學(xué)院中醫(yī)方藥實(shí)驗(yàn)室完成，感謝課題組老師和師兄師姐的指導(dǎo)。