朱 琪，李庚喜，曾 立，伍世清

（邵陽學(xué)院藥學(xué)院，湖南 邵陽 422000）

非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的特征是在沒有飲酒史的前提下，肝臟脂肪變性，許多研究顯示肥胖會顯著增加NAFLD 的發(fā)生率［1]。隨著生活節(jié)奏的加快和飲食習(xí)慣的改變，肥胖癥等慢性病患者迅速增加，這引發(fā)了全球公共衛(wèi)生工作者對現(xiàn)代社會健康問題的關(guān)注［2]。此外，NAFLD 和肥胖是許多代謝疾病的重要誘發(fā)因素，例如2 型糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪肝炎、肝硬化和癌癥，因此，尋找一種安全和有效的治療方法已成為公共衛(wèi)生目標(biāo)［3]。

玉竹具有養(yǎng)陰潤燥、生津止渴的功效［4]，玉竹多糖是其主要功效成分之一，由D-果糖、D-甘露糖、D-葡萄糖及半乳糖醛酸組成［5]。已有研究報道，玉竹多糖具有抗氧化、抗糖尿病和增強(qiáng)免疫活性等功能［6-8]，但關(guān)于它對改善肥胖以及非酒精性脂肪肝癥狀的機(jī)制研究報道不多。本研究通過建立高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖模型大鼠，從體質(zhì)量、血脂參數(shù)、肝功能酶、肝臟氧化應(yīng)激、炎癥因子和肝臟病理研究等多角度出發(fā)，探究玉竹多糖改善高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠肥胖癥狀和預(yù)防NAFLD，以期為開發(fā)相關(guān)功能產(chǎn)品提供參考。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量145～160 g，來自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2016-0002，分籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。高脂飲食參照《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范-輔助降血脂功能評價方法》（2012 年修訂），配方為基礎(chǔ)飲食63.6%、蔗糖20.0%、豬油15.0%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%。

1.2 藥物與試劑 玉竹多糖購自于蘭州沃特萊斯科技有限公司（批號WTLS-010），純度≥30%，再采用水提醇沉法，經(jīng)Sevag 分離純化制得［9]，采用苯酚硫酸法測得樣品中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)約58%。甘油三酯（Triglyceride，TG，批號20180324）、總膽固醇（Total cholesterol，TC，批 號20180412）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C，批號20180323）、低密度脂蛋白膽固醇（Density lipoprotein cholesterol，LDL-C，批號20180330）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase，ALT，批號20180403）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate transaminase，AST，批號20180403）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD，批號20180415）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA，批號20180420）、抗過氧化物酶（Catalase，CAT，批號20180420）和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px，批號20180416）等試劑盒購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor，TNF-α，貨號EK0526）和白細(xì)胞介素-6（（Interleukin 6，IL-6，貨號EK0412）等ELISA 試劑盒購自于武漢博士德生物工程公司；總RNA 提取試劑盒（貨號9767）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號RR047A）、RT-PCR 試劑盒（貨號RR820A）購于日本TakaRa 公司；引物購于廣州擎科生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（貨號P0009）購于上海碧云天生物技術(shù)公司；p-p65 蛋白抗體（貨號8242S）購于美國CST 公司；二抗（貨號ab20272）購于英國Abcam 公司；ECL 發(fā)光劑（貨號29050）購于北京英格恩生物有限公司。

1.3 儀器 多功能酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾科技公司）；MIKRO22R 型臺式冷凍離心機(jī)（德國Hettich 公司）；電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；冷凍干燥機(jī)（廣州三元科技有限公司）；PowerGen 125 高速勻漿機(jī)（中國賽默飛世爾科技公司）；7060 全自動生化分析檢測儀（日本Hitachi 公司）；移液槍（美國Thermo 公司）；病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；FluorChem FC2 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（南京非同科學(xué)儀器有限公司）；Applied Biosystems 實(shí)時熒光定量PCR 儀器（美國賽默飛世爾科技公司）。

2 方法

2.1 大鼠肥胖模型建立 將40 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，正常組8 只和高脂飲食組32 只。正常組正常飲食，高脂飲食組喂食高脂飲食。喂養(yǎng)4 周后，從高脂飲食組中選擇24 只肥胖大鼠進(jìn)一步灌胃玉竹多糖。肥胖模型大鼠的標(biāo)準(zhǔn)是高脂飲食組大鼠體質(zhì)量比正常組平均體質(zhì)量至少多20%。

2.2 分組、給藥 正常組中的8 只大鼠通過管飼法用蒸餾水進(jìn)行處理，32 只肥胖大鼠喂食高脂飲食分別為模型組，玉竹多糖低劑量組（200 mg/kg）、玉竹多糖中劑量（400 mg/kg）、玉竹多糖高劑量組（600 mg/kg）。正常組喂食普通飲食，其余4 組喂食高脂飲食。各組大鼠每日灌胃1 次，持續(xù)給藥6 周。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前禁食12 h，所有大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后立即從腹主動脈抽取血液，分離血清離心，解剖收集肝臟、腎周脂肪，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 檢測指標(biāo)

2.3.1 體質(zhì)量、腎周脂肪質(zhì)量 大鼠體質(zhì)量每7 d 稱重1次，處死后解剖得到腎周白色脂肪組織，并稱重記錄。

2.3.2 血清脂質(zhì)水平 將收集的血液靜置45 min 后，3 000×g 離心15 min 分離血清。血清TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平按照試劑盒說明方法檢測。

2.3.3 肝功能指標(biāo) 按照試劑盒說明書方法，采用自動生化分析儀測量血清中ALT 和AST 的水平。

2.3.4 肝臟氧化指標(biāo) 按照肝臟∶生理鹽水（1 g∶9 mL）制備肝臟組織勻漿液，離心之后取上清液，按照試劑盒說明書方法，測定SOD、CAT、GSH-Px、MDA 水平。

2.3.5 組織病理學(xué)分析 大鼠肝臟病理切片制備。隨機(jī)取3 只大鼠肝臟同一部位，4%多聚甲醛固定液固定。標(biāo)本石蠟包埋，將切片置于油紅O 染液中10 min，用自來水沖洗30 min，甘油封片。將制備好的切片放在100×光學(xué)顯微鏡下攝像并觀察染色情況，評價其脂質(zhì)積累程度。

2.3.6 肝臟炎癥因子TNF-α 和IL-6 mRNA 表達(dá) 提取肝臟組織的總RNA，將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR 檢測炎癥因子TNF-α 和IL-6 mRNA 基因表達(dá)。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.3.7 肝臟炎癥因子TNF-α 和IL-6 釋放及p-p65 蛋白表達(dá)按照ELISA 試劑盒提供的說明方法，采用酶標(biāo)儀測量肝組織TNF-α 和IL-6 釋放量。將收集的肝臟組織提取總蛋白，并將配制好的一抗（1∶1 000）和二抗（1∶10 000）進(jìn)行免疫印跡，以GAPDH 作為內(nèi)參。顯影后，計(jì)算光密度值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)和單因素方差分析。 P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同劑量的玉竹多糖對肥胖大鼠體質(zhì)量及腎周脂肪的影響 通常肥胖產(chǎn)生的過程中往往伴隨著白色脂肪的增多，具體表現(xiàn)為白色脂肪質(zhì)量增加［10]，而腎周脂肪組織是典型的白色脂肪組織，大鼠體質(zhì)量變化結(jié)合腎周脂肪重量的變化更能有效判斷肥胖。由圖1 可知，與正常組相比，高脂飲食大鼠的體質(zhì)量和腎周脂肪質(zhì)量均提高（P＜0.01），與模型組相比，中劑量玉竹多糖組可降低體質(zhì)量（P＜0.05），高劑量玉竹多糖組降低體質(zhì)量（P＜0.01），低、中、高劑量玉竹多糖組均降低腎周脂肪質(zhì)量（P＜0.01）。

圖1 玉竹多糖對大鼠體質(zhì)量及腎周脂肪質(zhì)量的影響（，n=8）

3.2 不同劑量的玉竹多糖對大鼠血脂生化指標(biāo)的影響 由圖2 可知，與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG 和LDL-C 水平增高（P＜0.01），HDL-C 水平下降（P＜0.01），表明造模成功；與模型組比較，低、高劑量玉竹多糖組大鼠血清TC 水平降低（P＜0.01），低、中、高劑量玉竹多糖組大鼠血清TG 水平降低（P＜0.01），高劑量玉竹多糖組大鼠血清LDL-C 水平下降（P＜0.05），HDL-C 水平上升（P＜0.05）。

圖2 玉竹多糖對大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平的影響（，n=8）

3.3 不同劑量的玉竹多糖對大鼠肝功能酶的影響 由表2 可知，模型組大鼠的ALT 和AST 水平高于正常組（P＜0.01），說明高脂飲食組大鼠發(fā)生肝功能損傷；在玉竹多糖的干預(yù)下，肥胖大鼠的ALT 和AST 水平均低于模型組（P＜0.01）。

表2 玉竹多糖對大鼠AST 和ALT 水平的影響（，n=8）

表2 玉竹多糖對大鼠AST 和ALT 水平的影響（，n=8）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.4 不同劑量的玉竹多糖對大鼠肝臟抗氧化酶活性（SOD、CAT 和GSH-Px）和過氧化產(chǎn)物MDA 水平的影響 如圖3 所示，與正常組比較，模型組MDA 水平升高，抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）水平降低（P＜0.01）；經(jīng)玉竹多糖處理后，高劑量組MDA 水平降低（P＜0.05），低、中、高劑量組均能提高抗氧化酶水平（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 玉竹多糖對大鼠肝臟抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活性和過氧化產(chǎn)物（MDA）水平的影響（，n=8）

3.5 不同劑量玉竹多糖對大鼠肝臟脂質(zhì)積累的影響 由圖4 可知，正常組大鼠肝臟切片未發(fā)現(xiàn)明顯脂滴；與正常組比較，模型組大鼠肝臟切片出現(xiàn)明顯脂肪變性，脂滴增加明顯。隨著玉竹多糖干預(yù)劑量的增加，脂滴明顯減少，其中高劑量玉竹多糖的脂滴減少更明顯，這進(jìn)一步表明玉竹多糖能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠肝臟脂質(zhì)積累。

圖4 玉竹多糖對大鼠肝臟脂質(zhì)積累的影響（×100）

3.6 不同劑量的玉竹多糖對大鼠肝臟中TNF-α 和IL-6 mRNA 表達(dá)的影響 由圖5 可知，模型組較正常組肝臟中炎癥因子TNF-α 和IL-6 mRNA 表達(dá)增加（P＜0.01）；玉竹多糖干預(yù)后，上述炎癥因子mRNA 表達(dá)均有不同程度的降低，呈劑量依賴型，表明玉竹多糖能夠下調(diào)肥胖大鼠肝臟組織的炎癥因子TNF-α 和IL-6 mRNA 的表達(dá)。

圖5 玉竹多糖對大鼠肝臟中炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA 表達(dá)的影響（，n=8）

3.7 不同劑量的玉竹多糖對大鼠肝臟中TNF-α、IL-6 以及p-p65 蛋白表達(dá)的影響 如圖6 所示，與正常組相比，模型組大鼠肝臟中TNF-α、IL-6 及p-p65 蛋白表達(dá)增加（P ＜0.01）；玉竹多糖處理后，TNF-α、IL-6 及p-p65 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），且隨著其劑量增加，p-p65 的蛋白表達(dá)逐漸降低，可能與下調(diào)NF-κB 信號通路、抑制促炎因子TNF-α 和IL-6 的蛋白和mRNA 表達(dá)有關(guān)。

圖6 玉竹多糖對大鼠肝臟中炎癥因子TNF-α、IL-6、p-p65 蛋白表達(dá)的影響（，n=8）

4 討論

流行病學(xué)的研究表明，NAFLD 是全球最常見的慢性肝?。?1]。隨著國民物質(zhì)生活水平的提高，我國的肥胖患者數(shù)量迅速增加，肥胖所引起的NAFLD 的發(fā)病率呈快速增長趨勢［12]。血脂（包括甘油三酯與高、低密度脂蛋白）異常是肥胖患者常見的代謝標(biāo)志之一［13]，血脂水平能夠反映全身性的脂質(zhì)代謝狀態(tài)［14]。如今，高熱量飲食習(xí)慣的流行，飲食中攝入的脂肪增加，體內(nèi)的游離脂肪酸增多，積聚的甘油三酯也逐漸增多，一旦超過了肝臟存儲的極限，將會產(chǎn)生有毒的脂質(zhì)代謝物，這些代謝物又會導(dǎo)致肝損傷或肝功能障礙［15]，因此本試驗(yàn)中檢測血脂TC、TG、LDL-C 和HDL-C 和大鼠肝臟切片油紅O 染色來探究肥胖大鼠中脂肪聚集程度和NAFLD 損傷程度。在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠的過程中，由于肝臟積累了甘油三酯和游離脂肪酸，會產(chǎn)生過多的活性氧（ROS），體內(nèi)的自由基代謝平衡主要是通過抗氧化系統(tǒng)維持，主要包括SOD、GSH-Px 和CAT 等［16]。MDA 是脂質(zhì)過氧化物降解的主要產(chǎn)物，不僅能夠阻止線粒體的呼吸鏈電子傳遞，還能促進(jìn)炎癥反應(yīng)，因此促進(jìn)肝臟內(nèi)抗氧化酶活性（SOD、CAT 和GSH-Px）和抑制過氧化產(chǎn)物MDA 含量可以促進(jìn)脂質(zhì)代謝，預(yù)防肥胖所致NAFLD［17]。許多流行病學(xué)研究表明，肥胖與肝損傷風(fēng)險增加有關(guān)［18]。肥胖使肝細(xì)胞易于發(fā)生脂質(zhì)過氧化的同時，還會炎癥變性，從而增加NAFLD、肝纖維化、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌的可能性［19]。AST 和ALT 是肝臟代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)功能的常見指標(biāo)，一旦肝功能受損，其血清水平可顯著升高［20]。世界衛(wèi)生組織（WHO）把ALT 作為肝功能損傷最靈敏的測定指標(biāo)［21]，因?yàn)?% 的肝細(xì)胞發(fā)生壞死時，血清中ALT 含量就會上升1倍［22]。已有研究表明，脂肪組織與炎癥細(xì)胞之間存在密切關(guān)系［18]。肥胖往往會引起慢性炎癥，可進(jìn)一步造成全身性的炎癥狀態(tài)，造成代謝障礙，從而加快肥胖的進(jìn)程［23]?！肮粜浴毖仔约?xì)胞因子（如TNF-α、IL-6 等）的無序生成通常與代謝綜合征的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，而NF-κB 是機(jī)體內(nèi)調(diào)控促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6 等）的轉(zhuǎn)錄與合成的關(guān)鍵調(diào)控因子［24]。所以，通過NF-κB 信號通路調(diào)節(jié)機(jī)體免疫炎性反應(yīng)，可以積極改善肥胖所致NAFLD［19，24]。

本研究顯示，與正常組相比，模型組出現(xiàn)了許多與肥胖相關(guān)癥狀，包括NAFLD、高脂血癥、肝功能損傷、氧化還原狀態(tài)失衡和炎癥。玉竹多糖處理組在減輕體重，血脂，氧化應(yīng)激和脂肪源性和炎性細(xì)胞因子方面發(fā)揮了重要作用。在玉竹多糖干預(yù)下，肥胖大鼠的體重和腎周脂肪質(zhì)量均有不同程度的降低，其中高劑量組的玉竹多糖效果最好（P＜0.05）；肥胖大鼠的血清中TC、TG 和LDL-C 的水平減少，而HDL-C 水平增多，尤其是高劑量組效果明顯（P＜0.05）；低、中和高劑量的玉竹多糖均極顯著降低了高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠的血清ALT 和AST 水平（P＜0.01）；結(jié)合大鼠肝臟組織切片的油紅O 染色發(fā)現(xiàn)，高脂飲食組脂滴明顯高于正常組，并且隨著玉竹多糖濃度的增加，其脂滴數(shù)量明顯減少，肥胖大鼠肝臟脂質(zhì)積累現(xiàn)象得到顯著改善；不同劑量的玉竹多糖不僅能夠提升抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）水平，降低機(jī)體內(nèi)的MDA 水平，且呈劑量效應(yīng)；玉竹多糖下調(diào)了肥胖大鼠肝臟組織的炎癥因子TNF-α 和IL-6 mRNA 的表達(dá)，降低TNF-α 和IL-6 的釋放量和p-p65 的蛋白表達(dá)。其中，中濃度和高濃度玉竹多糖抑制p65 的磷酸化的效果越來越好。玉竹多糖抑制TNF-α 和IL-6 的釋放的機(jī)制可能與抑制NF-κB（p65）磷酸化，下調(diào)促炎因子TNF-α 和IL-6 mRNA 和蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，玉竹多糖可有效改善肥胖大鼠的肥胖和NAFLD，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，維持脂質(zhì)正常代謝，減輕肝臟組織炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)肝功能和降低脂質(zhì)過氧化水平帶來的毒性反應(yīng)有關(guān)（圖7）。在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，其處理效果與濃度呈正相關(guān)，高劑量組（600 mg/kg）玉竹多糖對肥胖大鼠的治療作用相對最佳。我們的實(shí)驗(yàn)為揭示玉竹多糖減肥和預(yù)防NAFLD 疾病作用提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。但機(jī)體內(nèi)信號通路錯綜復(fù)雜［25]，玉竹多糖可有效改善肥胖大鼠的肥胖和NAFLD 的分子作用機(jī)制可能不是唯一，今后可以結(jié)合基因組學(xué)和蛋白組學(xué)等分子生物學(xué)技術(shù)做進(jìn)一步的深入研究。

圖7 玉竹多糖對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠的減肥和預(yù)防NAFLD 作用可能的機(jī)制