張 晰，馬丙祥，張建奎，王怡珍，陳恬恬，李華偉，黨偉利，周榮易

（河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，早產(chǎn)兒存活率較前有大幅提高［1]，但早產(chǎn)兒腦損傷發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)并無(wú)下降，一項(xiàng)Meta分析表明，早產(chǎn)、低體質(zhì)量、宮內(nèi)感染、缺氧等因素均是我國(guó)早產(chǎn)兒腦損傷的危險(xiǎn)因素［2]，其中宮內(nèi)感染顯著提高了早產(chǎn)兒腦損傷發(fā)病率［3-4]，是造成胎膜早破引發(fā)早產(chǎn)、低體重的主要原因之一［5]，故早產(chǎn)兒腦損傷與宮內(nèi)感染關(guān)系密切［6]。早產(chǎn)兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不完善，其主要損傷類(lèi)型包括腦室周?chē)踪|(zhì)軟化（periventricular leukomalacia，PVL）、腦室周?chē)?腦室內(nèi)出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血、缺氧缺血性腦病等［1，7]，遺留神經(jīng)后遺癥的風(fēng)險(xiǎn)較高，這同時(shí)也增加了腦性癱瘓（cerebral palsy，CP）發(fā)生的幾率［8]。CP 是早產(chǎn)兒腦損傷最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，臨床表現(xiàn)為姿勢(shì)發(fā)育障礙、活動(dòng)受限，常伴有感知覺(jué)異常、認(rèn)知障礙等多種問(wèn)題［9]。CP 的治療并無(wú)特效藥物，需要多專(zhuān)業(yè)聯(lián)合終身康復(fù)，這給家庭及社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)［10]。故探索宮內(nèi)感染致早產(chǎn)腦損傷的早期干預(yù)藥物，盡可能在疾病早期減輕神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，顯得尤為重要。

蒲金口服液為河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科馬丙祥教授的經(jīng)驗(yàn)方，由石菖蒲、郁金、丹參、紅花四味中藥組成，本方經(jīng)過(guò)大量的臨床應(yīng)用，臨床驗(yàn)證有效。方中石菖蒲為君藥，宣氣豁痰開(kāi)竅，醒神益智；臣以丹參，以活血祛瘀生新；輔以紅花、郁金二味，加強(qiáng)君臣活血行氣通絡(luò)破積之功。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，蒲金顆粒治療小兒痙攣型腦癱痰瘀阻竅證，可有效改善腦癱患兒粗大運(yùn)動(dòng)功能、肌張力、智力、言語(yǔ)、中醫(yī)證候評(píng)分［11]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，蒲金口服液能有效降低缺氧缺血性腦損傷大鼠腦組織一氧化氮合酶（NOS）水平，對(duì)抗氧自由基［12-13]，降低宮內(nèi)感染致早產(chǎn)PVL 大鼠腦組織TNF-α、IL-6 炎性因子表達(dá)，抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞（OL）及其前體細(xì)胞（OPC）的凋亡，下調(diào)髓鞘軸突生長(zhǎng)抑制因子（Nogo）-A、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白（OMgp）等髓鞘相關(guān)抑制因子（myelin-associated inhibitor factors，MAIFs）的表達(dá)［14-16]，改善神經(jīng)損傷癥狀。為進(jìn)一步探索本藥的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用宮內(nèi)感染致早產(chǎn)PVL仔鼠模型，通過(guò)高、低劑量蒲金口服液在不同時(shí)期干預(yù)，檢測(cè)仔鼠腦組織勿動(dòng)蛋白受體（nogoreceptor，NgR）和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體（p75 neurotrophin receptor，p75NTR）的表達(dá)量，觀察蒲金口服液對(duì)NgR、p75NTR 表達(dá)的影響，進(jìn)一步探索其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)成熟SD 雌性大鼠36 只，體質(zhì)量（250±50）g；成熟SD 雄性大鼠18 只，體質(zhì)量（300±50）g，分籠喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，按時(shí)通風(fēng)，實(shí)驗(yàn)室溫度控制在20～27 ℃，相對(duì)濕度控制在40%～70%，定期更換墊料，清洗籠具，消毒，保持動(dòng)物房的安靜環(huán)境，由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（豫）2015-0004。實(shí)驗(yàn)通過(guò)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（編號(hào)YFYDW2016022）。

1.2 藥物及試劑 蒲金口服液含石菖蒲、郁金、丹參、紅花四味中藥，成藥制作工藝由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑研究室提供，低劑量組含生藥1.2 g/mL，高劑量組含生藥2.4 g/mL；銀杏葉提取物（德國(guó)威瑪舒培博士藥廠，批號(hào)7140315）；脂多糖（LPS 血清型O55：B5，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)530F035）；兔多抗NgR（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)bs-20486R）；兔多抗p75NTR（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)55014-1-AP）；小鼠單抗βactin（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)BM0627）。

1.3 儀器 EG1150 型全自動(dòng)石蠟包埋機(jī)、2016 型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；BX53 型生物顯微鏡（日本Olympus 公司）；HI650 型離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；DYCZ-24DN 型垂直電泳槽（北京六一儀器廠）；Muliskan MK3 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）等。

2 方法

2.1 模型制備與分組 將36 只SD 雌性大鼠與18 只雄性大鼠以2∶1 比例于下午17：00 合籠，次日上午08：00 將雌雄大鼠分籠，受孕成功后孕鼠另籠飼養(yǎng)。將受孕大鼠隨機(jī)分為L(zhǎng)PS 組（30 只）與對(duì)照組（6 只）；參照李曉捷等［17]制作宮內(nèi)感染致早產(chǎn)鼠腦性癱瘓動(dòng)物模型的方法，LPS 組于妊娠第16、17 天連續(xù)2 d 每日腹腔注射LPS（350 μg/kg），對(duì)照組注射同等劑量的生理鹽水；以孕期≤21 d 判定為早產(chǎn)造模成功。隨機(jī)選取LPS 組早產(chǎn)模型仔鼠80 只，隨機(jī)分為4 組，每組20 只，分為蒲金口服液高劑量（24 g/kg）組、蒲金口服液低劑量（12 g/kg）組、銀杏葉提取物（30 mg/kg）組、模型組，分別給予高劑量蒲金口服液、低劑量蒲金口服液、銀杏葉提取物及生理鹽水灌胃。4 組各隨機(jī)分為早期、晚期干預(yù)組各10 只。

2.2 藥物干預(yù) 早期干預(yù)組于生后第1 天灌胃給藥；晚期干預(yù)組生后第8 天灌胃給藥；灌胃容量為0.1 mL/10 g，連續(xù)7 d，每日1 次。同條件喂養(yǎng)至21 日齡。劑量換算方法根據(jù)徐淑云《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》 所述人與動(dòng)物間體表面積折算，按照說(shuō)明書(shū)用藥劑量折算出大鼠用量，把人的等效劑量記為低劑量，2 倍等效劑量記為高劑量。

2.3 模型病理學(xué)觀察及組織病理學(xué)評(píng)分

2.3.1 孕鼠宮內(nèi)感染 仔鼠出生即刻隨機(jī)選取LPS 組和對(duì)照組孕鼠各4 只，取子宮及胎盤(pán)，組織固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，HE 染色，觀察孕鼠宮內(nèi)感染情況。對(duì)孕鼠子宮組織參照劉國(guó)生等［18]的方法進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分，①腔壁結(jié)構(gòu)病變，“-”各層結(jié)構(gòu)正常記0 分，“+”黏膜固有層腺體結(jié)構(gòu)消失記1 分，“++”肌層與黏膜層分界不清記2分，“+++”分層結(jié)構(gòu)不清記3 分；②上皮細(xì)胞變性壞死，“-”單層柱狀上皮記0 分，“+”上皮細(xì)胞扁平或脫落＜1/3 記1 分，“++”上皮細(xì)胞扁平或脫落1/3～2/3 病變記2分；“+++”全層上皮細(xì)胞變性壞死記3 分；③炎細(xì)胞侵潤(rùn)，“-”無(wú)炎細(xì)胞侵潤(rùn)記0 分，“+”小數(shù)散在或灶性且僅在黏膜固有層內(nèi)記1 分，“++”散在或灶性但深入肌層記2分，“+++”多數(shù)散在或?qū)訝罱?rùn)并累及全層記3 分；④內(nèi)膜充血水腫，“-”無(wú)內(nèi)膜充血水腫記0 分，“+”固有膜輕微充血水腫記1 分，“++”明顯充血水腫記2 分，“+++”全層充血水腫記3 分。

胎盤(pán)組織從血管充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度方面進(jìn)行評(píng)分，0 分為無(wú)損傷，1 分為病變范圍＜25%，2 分為病變范圍25%～50%，3 分為病變范圍51%～75%，4 分為病變＞75%，總分8 分。

2.3.2 新生仔鼠腦組織腦室旁白質(zhì)區(qū)損傷 隨機(jī)選LPS 組早產(chǎn)仔鼠及對(duì)照組仔鼠各10 只，斷頭取腦組織，進(jìn)行組織固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，HE 染色，觀察新生仔鼠腦組織腦室旁白質(zhì)區(qū)損傷情況。采用孔雷等［19]的方法每張切片隨機(jī)選擇10 個(gè)高倍視野（×200），光鏡下對(duì)腦組織神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和血管分別作組織學(xué)評(píng)分。出現(xiàn)少量神經(jīng)元、神經(jīng)纖維水腫等計(jì)1 分，散在星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫計(jì)1 分，部分毛細(xì)血管擴(kuò)張、水腫計(jì)1 分；出現(xiàn)廣泛神經(jīng)元水腫、神經(jīng)纖維疏松化，胞核形態(tài)不規(guī)則，核固縮、神經(jīng)元凋亡，神經(jīng)纖維網(wǎng)結(jié)構(gòu)破壞計(jì)2 分；廣泛膠質(zhì)細(xì)胞水腫計(jì)2 分；廣泛毛細(xì)血管擴(kuò)張及水腫、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞計(jì)2 分；出現(xiàn)核固縮、神經(jīng)元凋亡計(jì)3 分；嗜神經(jīng)元現(xiàn)象，腦膿腫計(jì)3 分；毛細(xì)血管壞死，腦實(shí)質(zhì)內(nèi)點(diǎn)、片狀出血計(jì)3 分，總分為18 分。

2.4 腦組織NgR、p75NTR 表達(dá)的檢測(cè) 隨機(jī)取LPS 組及對(duì)照組新生仔鼠各10 只斷頭取腦，取一側(cè)腦組織進(jìn)行組織固定、脫水、透明、浸蠟、包埋。取另一側(cè)腦組織放置于2 mL 凍存管內(nèi)，并快速放入液氮罐內(nèi)凍存?zhèn)溆?，分別進(jìn)行免疫組化染色及Western blot 檢測(cè)。同樣方法取21 日齡80 只模型仔鼠腦組織，分別進(jìn)行免疫組化及Western blot 檢測(cè)。

2.4.1 免疫組化檢測(cè) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，熱抗原修復(fù)，過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，5% BSA 封閉，滴加稀釋的兔抗大鼠NgR 多克隆IgG 一抗/兔抗大鼠p75NTR多克隆IgG 一抗（1∶50/1∶50），生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG/p75NTR 二抗，37 ℃恒溫箱孵育20 min；試劑SABC，DAB 顯色試劑盒顯色，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗，脫水，透明，封片，光學(xué)顯微鏡觀察。光鏡下細(xì)胞漿有棕黃色顆粒沉著為陽(yáng)性細(xì)胞。400 倍視野下，白質(zhì)部位隨機(jī)取3 個(gè)視野拍照，采用美國(guó)Image-Pro Plus 軟件對(duì)免疫組化染色圖片進(jìn)行吸光度（A）測(cè)定，取均值。

2.4.2 Western blot 檢測(cè) 取腦組織加RIPA 裂解混合液200 μL 冰上裂解30 min，離心取上清，BCA 法提取蛋白、測(cè)定濃度、蛋白變性。制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉。分別加入一抗NgR（1∶300）、p75NTR（1∶200），4 ℃孵育8 h。加羊抗兔二抗孵育2 h（1∶5 000），洗滌，顯影，曝光。Bio-Red Image Lab 5.1 軟件分析各泳道條帶灰度值，以β-actin 為參照，以目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值表述目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以（）表示。若各組樣本數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，且符合方差齊性（采用Levene 檢驗(yàn)方法驗(yàn)證），則采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。若各組樣本數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，但不符合方差齊性（采用Levene 檢驗(yàn)方法驗(yàn)證），則兩兩比較采用Dunnett’ s 檢驗(yàn)，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若樣本數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察

3.1.1 LPS 對(duì)雌鼠孕產(chǎn)情況的影響 造模孕鼠11 只流產(chǎn)，1 只死亡，其余18 只孕鼠均提前分娩，產(chǎn)出102 只活仔鼠，可見(jiàn)死產(chǎn)仔鼠。對(duì)照組6 只孕鼠全部足月分娩，共產(chǎn)出62只仔鼠，無(wú)死產(chǎn)仔鼠。較對(duì)照組相比，造模孕鼠產(chǎn)仔數(shù)量減少（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

3.1.2 LPS 對(duì)新生仔鼠出生情況的影響 與對(duì)照組比較，LPS 組仔鼠出生時(shí)皮膚顏色紫暗，主動(dòng)活動(dòng)少，對(duì)刺激反應(yīng)弱，體質(zhì)量低（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 脂多糖對(duì)孕鼠產(chǎn)仔數(shù)和仔鼠出生體質(zhì)量的影響（）

表1 脂多糖對(duì)孕鼠產(chǎn)仔數(shù)和仔鼠出生體質(zhì)量的影響（）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01。

3.2 LPS 對(duì)孕鼠子宮、胎盤(pán)及新生仔鼠腦組織病理學(xué)的影響 LPS 組孕鼠胎盤(pán)組織可見(jiàn)血管充血水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，子宮組織可見(jiàn)組織結(jié)構(gòu)紊亂，上皮細(xì)胞變性壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)及充血水腫；對(duì)照組孕鼠子宮及胎盤(pán)組織未見(jiàn)炎性細(xì)胞及充血水腫等病理改變。與對(duì)照組比較，LPS 組孕鼠胎盤(pán)及子宮組織病理評(píng)分升高（P＜0.05）；LPS 組仔鼠腦白質(zhì)區(qū)組織結(jié)構(gòu)稀疏，細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)不清，間隙增寬，組織間隙出血、水腫。對(duì)照組仔鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列均勻整齊，胞核較大，未見(jiàn)組織出血水腫，與對(duì)照組比較，LPS 組仔鼠病理評(píng)分升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 LPS 對(duì)孕鼠子宮、胎盤(pán)及新生仔鼠腦組織病理學(xué)的影響（A～D，HE，×200；E～F，HE，×100）

表2 孕鼠子宮、胎盤(pán)及新生仔鼠腦組織病理學(xué)評(píng)分比較（，n=4）

表2 孕鼠子宮、胎盤(pán)及新生仔鼠腦組織病理學(xué)評(píng)分比較（，n=4）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

3.3 LPS 對(duì)新生仔鼠腦組織NgR、p75NTR 水平的影響與對(duì)照組仔鼠比較，LPS 組仔鼠腦組織中NgR、p75NTR 的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖2～3、表3～4。

表3 免疫組化法檢測(cè)LPS 對(duì)仔鼠腦組織NgR、p75NTR表達(dá)的影響（，n=10）

表3 免疫組化法檢測(cè)LPS 對(duì)仔鼠腦組織NgR、p75NTR表達(dá)的影響（，n=10）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖2 脂多糖對(duì)仔鼠腦組織NgR、p75NTR 表達(dá)的影響（IHC，×400）

圖3 脂多糖對(duì)仔鼠腦組織NgR、p75NTR 表達(dá)的影響

表4 脂多糖對(duì)仔鼠腦組織NgR、p75NTR 表達(dá)的影響（，n=5）

表4 脂多糖對(duì)仔鼠腦組織NgR、p75NTR 表達(dá)的影響（，n=5）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 蒲金口服液對(duì)仔鼠腦組織NgR、p75NTR 表達(dá)的影響 與同時(shí)相模型組相比，蒲金口服液高、低劑量組及銀杏葉提取物組NgR、p75NTR 的表達(dá)均減少（P＜0.05，P＜0.01）；與銀杏葉提取物組相比較，高劑量蒲金口服液組NgR、p75NTR 表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.01）；與藥物不同時(shí)相比較，高、低劑量蒲金口服液、銀杏葉提取物早期干預(yù)下調(diào)NgR、p75NTR 的表達(dá)均較晚期（P ＜0.05）。見(jiàn)圖4～6、表5～6。

圖4 蒲金口服液對(duì)仔鼠腦組織NgR 表達(dá)的影響（IHC，×400）

圖5 蒲金口服液對(duì)仔鼠腦組織p75NTR 表達(dá)的影響（IHC，×400）

圖6 蒲金口服液對(duì)大鼠腦組織NgR、p75NTR 蛋白表達(dá)的影響

表5 蒲金口服液對(duì)仔鼠腦組織NgR、p75NTR 表達(dá)的影響（）

表5 蒲金口服液對(duì)仔鼠腦組織NgR、p75NTR 表達(dá)的影響（）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與銀杏葉提取物組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與晚期組比較，＄P＜0.05，＄＄P＜0.01。

表6 蒲金口服液對(duì)大鼠腦組織NgR、p75NTR 蛋白表達(dá)的影響（）

表6 蒲金口服液對(duì)大鼠腦組織NgR、p75NTR 蛋白表達(dá)的影響（）

注：與模型組比較，*P ＜0.05；與銀杏葉提取物組比較，＃P ＜0.05；與晚期組比較，＄P＜0.05。

4 討論

早產(chǎn)兒腦發(fā)育不成熟，具有易損傷的特點(diǎn)，圍產(chǎn)期感染、缺氧缺血等高危因素導(dǎo)致炎癥因子大量激活、興奮氨基酸堆積、氧自由基釋放，容易發(fā)生早產(chǎn)兒腦病，不僅引起腦組織的損傷，還造成以后的發(fā)育障礙［20]。研究表明，宮內(nèi)感染致早產(chǎn)腦損傷的發(fā)生不僅與炎性反應(yīng)有關(guān)，同時(shí)與血管因素、膠質(zhì)細(xì)胞損傷、神經(jīng)損傷的修復(fù)和功能重組障礙、內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制不完善等多種因素密切相關(guān)［21]。腦神經(jīng)受損后可以再生，但受損神經(jīng)元所處的局部微環(huán)境及其內(nèi)在特性是軸突再生失敗的主要原因，外源性的抑制軸突的因子有MAIFs，膠質(zhì)瘢痕，炎癥等［22]。受損神經(jīng)產(chǎn)生的MAIFs 以少突膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的Nogo-A、髓鞘相關(guān)糖蛋白（MAG）、OMgp 為經(jīng)典代表，通過(guò)與抑制分子受體結(jié)合，激活下游信號(hào)分子RhoA，導(dǎo)致神經(jīng)生長(zhǎng)錐崩潰，可引起中樞神經(jīng)再生失敗。研究證實(shí)，NgR 是MAIFs 的高親和力受體，在以少突膠質(zhì)前體細(xì)胞系為主要成分的早產(chǎn)兒PVL 再生抑制機(jī)制中起關(guān)鍵作用［23-25]。p75NTR 是結(jié)合所有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的TNF-α 受體超家族的成員，參與介導(dǎo)NgR 的跨膜信號(hào)傳導(dǎo)，主要調(diào)節(jié)它們的促凋亡作用［26-28]。NgR、p75NTR 的表達(dá)上調(diào)，使軸突生長(zhǎng)被抑制，阻礙神經(jīng)的結(jié)構(gòu)修復(fù)和功能重組。因此，檢測(cè)腦組織中NgR、p75NTR 的表達(dá)，可進(jìn)一步明確蒲金口服液可能的作用機(jī)制。

研究表明，大鼠童年時(shí)期發(fā)育迅速，21 日齡即相當(dāng)于人類(lèi)1 歲［29]，在6 周左右即可達(dá)到性成熟，而PVL 的好發(fā)時(shí)期在大鼠相當(dāng)于生后第2～3 天時(shí)段，在人類(lèi)則胎齡23～32 周，此時(shí)在白質(zhì)部位以晚期OL 前體占主導(dǎo)地位，髓鞘尚未形成，細(xì)胞對(duì)免疫攻擊具有高度敏感性，而晚期OLs是PVL 病變的主要靶細(xì)胞，在PVL 的發(fā)病機(jī)理中起著關(guān)鍵作用［30]。臨床對(duì)于腦性癱瘓的診斷年齡通常為1 歲之后，近年來(lái)隨著方法學(xué)的進(jìn)展，可以在校正年齡5 月齡之前做出腦癱診斷或風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)［31]。對(duì)于本病的預(yù)防提倡早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療，高危兒的臨床干預(yù)多于生后即進(jìn)行［32-34]，故實(shí)驗(yàn)時(shí)早期干預(yù)時(shí)間為生后至7 日齡，觀察期限一般不小于14 天。采用早期干預(yù)及晚期干預(yù)是相對(duì)而言對(duì)于治療時(shí)機(jī)的探索，以便于尋找蒲金口服液最有效的治療時(shí)機(jī)。

本實(shí)驗(yàn)采用LPS 制備早產(chǎn)PVL 仔鼠動(dòng)物模型，選用高、低劑量蒲金口服液干預(yù)，于不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，探討蒲金口服液對(duì)宮內(nèi)感染致早產(chǎn)腦損傷大鼠腦組織NgR、p75NTR 表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，孕鼠注射LPS 后，可造成宮內(nèi)感染，導(dǎo)致胎盤(pán)及子宮組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，組織病理學(xué)評(píng)分增高，有流產(chǎn)及死產(chǎn)現(xiàn)象，且產(chǎn)仔數(shù)少、新生仔鼠活力差，皮膚顏色紫紺，出生體質(zhì)量低，仔鼠腦組織病理評(píng)分升高。通過(guò)檢測(cè)仔鼠腦組織中NgR、p75NTR 表達(dá)，驗(yàn)證了LPS 可致仔鼠腦組織中NgR、p75NTR 的表達(dá)上調(diào)。這提示了宮內(nèi)感染可促使腦組織中MAIFs 受體表達(dá)增多，推測(cè)這可能是腦損傷后促使神經(jīng)再生再生失敗的原因之一。藥物干預(yù)后，各給藥組仔鼠腦組織中NgR、p75NTR的表達(dá)均較模型組減少（P＜0.01）；各給藥組之間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，高劑量蒲金口服液作用更明顯，低劑量蒲金口服液組與銀杏葉提取物組之間無(wú)明顯差異。推測(cè)高劑量蒲金口服液可能通過(guò)下調(diào)NgR、p75NTR 的表達(dá)，從而降低NgR、p75NTR 介導(dǎo)的信號(hào)通路活性，抑制下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)生長(zhǎng)椎的生長(zhǎng)，從而發(fā)揮對(duì)受損神經(jīng)的保護(hù)作用。通過(guò)不同介入時(shí)點(diǎn)觀察，發(fā)現(xiàn)早期干預(yù)組均較晚期干預(yù)組下調(diào)NgR、p75NTR 的表達(dá)作用明顯，推測(cè)這可能與此時(shí)期大腦白質(zhì)部位以晚期OL 前體占主導(dǎo)地位，髓鞘尚未形成，且神經(jīng)系統(tǒng)具有可塑性有關(guān)［32]，提示了早期干預(yù)的重要性和必要性。

從中醫(yī)方面來(lái)講，血管因素所致“血瘀”為公認(rèn)的致病因素，臨床多采用“活血化瘀”法治療本病。本課題組通過(guò)長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐及探索發(fā)現(xiàn)，“痰”同樣是本病的重要致病因素，“痰”和“瘀”是宮內(nèi)感染所致早產(chǎn)兒腦室周?chē)踪|(zhì)軟化的主要病理因素，其病機(jī)特點(diǎn)為“痰瘀阻竅，經(jīng)絡(luò)不通”?！疤怠庇杏行闻c無(wú)形之分，瘀血阻滯氣機(jī)，氣運(yùn)失司，水液不布，水停痰生，痰隨氣行，流注經(jīng)絡(luò)，膠著纏綿，痰瘀互阻，從而發(fā)??；針對(duì)以上病機(jī)，本課題組提出采用“化痰活瘀”的治則對(duì)早產(chǎn)腦損傷進(jìn)行干預(yù)，這對(duì)臨床治療本病提供了新的思路。蒲金口服液是目前課題組運(yùn)用中醫(yī)臨床思維通過(guò)辨證選藥，發(fā)揮中醫(yī)特色，且經(jīng)過(guò)臨床實(shí)踐有效的經(jīng)驗(yàn)方，具有服用簡(jiǎn)便，痛苦小的優(yōu)點(diǎn)。本方由石菖蒲、郁金、丹參、紅花四味中藥組成，全方藥物精煉，有活血化瘀、化痰開(kāi)竅之效，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明蒲金口服液可使腦損傷仔鼠腦組織中MAIFs 受體NgR、p75NTR 表達(dá)減少，驗(yàn)證其治療本病的有效性，推測(cè)宮內(nèi)感染/炎癥致早產(chǎn)腦損傷的中醫(yī)病理因素主要是“痰”和“瘀”，這為活血化瘀、化痰開(kāi)竅中藥臨床早期干預(yù)治療本病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

銀杏葉提取物是目前臨床使用最為廣泛的中藥提取物之一，現(xiàn)代藥理研究表明，其主要含銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯等有效成分，具有促進(jìn)神經(jīng)突觸生長(zhǎng)、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、拮抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性，清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、擴(kuò)張腦部血管、調(diào)血脂、拮抗血小板活化因子等多種藥理作用［35-36]。本課題組對(duì)蒲金口服液前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了其具有抑制OL 及其OPC 的凋亡，抑制MAIFs 的表達(dá)，及抗氧化、抑制TNF-α、IL-6 等炎癥因子釋放，保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞的作用機(jī)制，這與銀杏葉提取物的藥理作用機(jī)制相似。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，銀杏葉提取物能促進(jìn)新生缺氧缺血性腦損大鼠腦組織Nestin 蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，促進(jìn)神經(jīng)髓鞘的形成細(xì)胞OL 表達(dá)，促進(jìn)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的Bcl-2 上調(diào)和caspase-3 下調(diào)，對(duì)腦缺血再灌注后的神經(jīng)細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用，促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)。銀杏葉提取物亦可降低腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，下調(diào)TNF-α、IL-6 表達(dá)，抑制相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（ROCK）、肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）、金屬基質(zhì)蛋白酶2（MMP-2）表達(dá)，減小腦梗死體積，減輕血腦屏障損傷。其不同作用機(jī)制不同程度的保護(hù)了神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生及發(fā)展，減少了疾病對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷［37-43]。

宮內(nèi)感染引起腦損傷的作用機(jī)制復(fù)雜，涉及炎性反應(yīng)、血管因素、膠質(zhì)細(xì)胞損傷、神經(jīng)損傷的修復(fù)和功能重組障礙、內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制不完善等多種因素，但本實(shí)驗(yàn)僅從神經(jīng)再生修復(fù)機(jī)制方面對(duì)蒲金口服液可能的作用機(jī)制做了探索，具有一定的局限性，其可能的其他方面的作用機(jī)制尚未探明，接下來(lái)課題組會(huì)進(jìn)行進(jìn)一步深入的研究。