梅紫薇，徐艷艷，田偉強(qiáng)*，石森林，黎啟帆，吳查青

（1.麗水市中心醫(yī)院，浙江 麗水 323000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053；3.麗水市食品藥品與質(zhì)量技術(shù)檢驗(yàn)檢測(cè)院，浙江 麗水 323000）

黃連為毛茛科黃連Coptis chinensis Franch、三角葉黃連C.deltoidea C.Y Cheng et Hsiao 或云連C.teeta Wall.的干燥根莖，功效清熱燥濕、瀉火解毒等［1]，主要成分為生物堿［2]，其中小檗堿、巴馬汀堿、黃連堿、表小檗堿、藥根堿具有較強(qiáng)的藥理活性［3-4]。研究表明，黃連總生物堿對(duì)應(yīng)激所致的胃黏膜損傷具有保護(hù)作用；抑制肉芽組織增長(zhǎng)，減弱特異性免疫功能［5-6]；抑制幽門螺旋桿菌和胃酸分泌，防止其附著于胃壁，預(yù)防胃潰瘍的形成；明顯降低胃蛋白酶活性，減少其對(duì)胃黏膜的侵害，從而保護(hù)胃黏膜［7-8]。課題組前期研究了黃連總生物堿在家兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)其t1/2短，口服生物利用度差［9]，故再將其制成胃內(nèi)漂浮型緩釋片，使其黏附于胃黏膜，延長(zhǎng)作用時(shí)間，增加藥物吸收［10-11]。

穩(wěn)定性是制劑在保存過程中重要的考察指標(biāo)之一，對(duì)其制備與質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要作用，而溶解性、表觀油水分配系數(shù)是考察藥物理化性質(zhì)重要的參數(shù)。為了將黃連總生物堿制成安全有效、質(zhì)量可控的胃內(nèi)漂浮型緩釋片，本實(shí)驗(yàn)考察其穩(wěn)定性、溶解性、表觀油水分配系數(shù)，以期為相關(guān)制劑工藝的研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 黃連總生物堿（自制，批號(hào)20190822）。鹽酸小檗堿（批號(hào)M24A10K86772）、鹽酸黃連堿（批號(hào) Z22A10X94861）、藥根堿（批號(hào)Z11M8S35794）、鹽酸巴馬汀（批號(hào)Z16J10X79792）、表小檗堿（批號(hào)F26O10X95974）對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司）。胰酶（批號(hào)A25N10L103650）、胃蛋白酶（批號(hào)L05N10J102095）（上海源葉生物科技有限公司）。磷酸二氫鉀（批號(hào)20180308）、乙酸乙酯為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；十二烷基硫酸鈉為分析純（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；磷酸、乙醇為分析純（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；甲醇、正辛醇為分析純（上海麥克林生化科技有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純（默克股份兩合公司）；水為超純水。

1.2 儀器 XS105DU 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；TU-1901 紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Milli-Advantagea A10 超純水系統(tǒng)［默克化工技術(shù)（上海）有限公司]；Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；KQ-300DB 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；酸度計(jì)［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；LABOPORT 真空泵N816（德國KNF 公司）；振蕩器（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）

2 方法與結(jié)果

2.1 黃連總生物堿含量測(cè)定

2.1.1 溶液制備

2.1.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品1.6 mg，甲醇超聲溶解并定容至50 mL，搖勻，即得。

2.1.1.2 供試品溶液 精密稱取黃連總生物堿提取物8.5 mg，甲醇超聲溶解并定容至100 mL，搖勻，再精密量取0.95 mL，甲醇稀釋至10 mL，搖勻，即得。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)確定 吸取對(duì)照品、供試品溶液適量，置于紫外分光光度計(jì)中，在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果顯示，2 種溶液均在345 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液1.0、1.2、1.3、1.5、1.8、2.0 mL，分別用甲醇稀釋并定容至10 mL，置于紫外分光光度計(jì)中，在345 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程為A=0.067 6X-0.000 3（r=0.999 9），在3.2～6.4 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定6 次吸光度，測(cè)得其RSD 為0.035%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取提取物6 份，按“2.1.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，測(cè)得黃連總生物堿含量RSD 為0.08%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份提取物，按“2.1.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，測(cè)得其RSD 為1.83%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 加樣回收試驗(yàn) 稱取9 份黃連總生物堿含量已知的提取物，分成3 組，分別加入80%、100%、120%水平的對(duì)照品，甲醇超聲溶解并定容至100 mL，精密量取1 mL，甲醇溶解定容至10 mL，搖勻，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果，黃連總生物堿平均加樣回收率為99.07%，RSD 為0.99%。

2.2 5 種生物堿含量測(cè)定

2.2.1 溶液制備

2.2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品鹽酸小檗堿1.1 mg、鹽酸黃連堿1.4 mg、藥根堿0.8 mg、鹽酸巴馬汀1.9 mg、表小檗堿0.9 mg，置于同一量瓶中，甲醇超聲溶解并定容至25 mL，搖勻，即得（鹽酸小檗堿44 μg/mL、鹽酸黃連堿56 μg/mL、藥根堿32 μg/mL、鹽酸巴馬汀76 μg/mL、表小檗堿36 μg/mL）。

2.2.1.2 供試品溶液 精密稱取黃連總生物堿提取物1.1 mg，甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，即得。

2.2.2 色譜條件 ZORBAX SB-C18色譜柱；流動(dòng)相乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀（38∶62），每100 mL 加入十二烷基硫酸鈉0.4 g（磷酸調(diào)pH 至4.0）；體積流量1.0 mL/min；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)與專屬性考察 取對(duì)照品、供試品溶液，在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，5 種生物堿色譜峰峰形良好，均能達(dá)到基線分離（分離度均大于1.5），對(duì)稱因子均在0.92～1.05 之間，理論塔板數(shù)均大于10 000，甲醇不干擾測(cè)定。

圖1 各生物堿HPLC 色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL，甲醇稀釋并定容 至10 mL，搖勻，在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程分別為鹽酸小檗堿Y=35.784X-7.094 5（r=0.999 9），在2.2～22 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；鹽酸黃連堿Y=30.382X-9.167 2（r=0.999 8），在3.0～30 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；藥根堿Y=32.552X-3.265（r=0.999 9），在1.6～16 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；鹽酸巴馬汀Y=8.492 1X-5.123 4（r=0.999 5），在3.8～38 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；表小檗堿Y=39.595X-8.089 6（r=0.999 8），在1.8～18 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得各生物堿峰面積RSD 分別為鹽酸小檗堿0.872%、鹽酸黃連堿0.830%、藥根堿0.909%、鹽酸巴馬汀0.974%、表小檗堿0.977%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份提取物，按“2.2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各生物堿峰面積RSD 分別為鹽酸小檗堿0.80%、鹽酸黃連堿0.82%、藥根堿2.10%、鹽酸巴馬汀0.49%、表小檗堿1.01%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取6 份提取物，每份約為8.5 mg，精密稱定，按“2.2.1.2”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各生物堿含量RSD分別為鹽酸小檗堿0.820%、鹽酸黃連堿0.825%、藥根堿2.506%、鹽酸巴馬汀0.611%、表小檗堿1.207%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 稱取各生物堿含量已知的提取物9份，分成3 組，分別加入80%、100%、120% 水平的鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀、表小檗堿，按“2.2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，鹽酸小檗堿平均加樣回收率為98.91%，RSD 為0.68%；鹽酸黃連堿平均加樣回收率為98.53%，RSD 為0.53%；藥根堿平均加樣回收率為98.89%，RSD 為0.41%；鹽酸巴馬汀平均加樣回收率為98.58%，RSD 為0.137%；表小檗堿平均加樣回收率為98.89%，RSD 為0.41%。

2.3 穩(wěn)定性研究

2.3.1 高濕試驗(yàn) 根據(jù)《原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》（以下簡(jiǎn)稱《指導(dǎo)原則》），稱取提取物適量，置于培養(yǎng)皿中，攤成≤5 mm 厚的薄層，分別敞口置于溫度25 ℃、相對(duì)濕度92.5%（KNO3飽和溶液）及溫度25 ℃、相對(duì)濕度75%（NaCl 飽和溶液）的密閉容器中，于放置后第0、5、10 天取樣，準(zhǔn)確稱定實(shí)驗(yàn)前后供試品質(zhì)量，結(jié)果見表1。由此可知，在2 種相對(duì)濕度條件下，提取物吸濕增重均＜5%。

表1 高濕試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.3.2 高溫試驗(yàn) 根據(jù)《指導(dǎo)原則》 稱取提取物適量，置于培養(yǎng)皿中，攤成≤5 mm 厚的薄層，敞口置于60 ℃下，于放置后第0、5、10 天取樣，測(cè)定含量，結(jié)果見表2。由此可知，在該溫度下各成分含量無明顯變化。

表2 高溫試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.3.3 強(qiáng)光照試驗(yàn) 根據(jù)《指導(dǎo)原則》 稱取提取物適量，置于培養(yǎng)皿中，攤成≤5 mm 厚的薄層，室溫下敞口置于4 500 lx光照強(qiáng)度下，于放置后第0、5、10 天取樣，觀察供試品外觀，測(cè)定含量，結(jié)果見表3。由此可知，供試品外觀、各成分含量均無明顯變化。

表3 強(qiáng)光照試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.4 溶解度測(cè)定 量取pH 2.3、3.5、4.2 的磷酸鹽緩沖液，超純水，0.1 mol/L HCl，甲醇，乙醇，乙酸乙酯，正辛醇各5 mL，加入過量提取物，置于恒溫振蕩器中，在（37±0.5）℃下120 r/min 振搖24 h 充分溶解，靜置，微孔濾膜過濾，按“1.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算溶解度，結(jié)果見表4。

表4 溶解度測(cè)定結(jié)果

2.5 表觀油水分配系數(shù)測(cè)定 吸取適量正辛醇溶液，分別與同體積pH=2.6、pH=4.0、pH=6.8 磷酸鹽溶液，超純水，人工胃液，人工腸液混合后置于試管中，在（37±0.5）℃下120 r/min 振搖24 h，12 000 r/min 離心10 min，分別取上、下層，其中上層（油相）為水飽和正辛醇溶液，下層（水相）為正辛醇飽和水溶液。

精密吸取上層溶液（油相）至試管中，加入過量提取物，置于恒溫振蕩儀中，在（37±0.5）℃下120 r/min 振搖24 h，離心，取水層，0.45 μm 微孔濾膜過濾，按“1.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算質(zhì)量濃度C0；精密吸取上層溶液（油相）3 mL 至試管中，加入下層溶液（水相），置于恒溫振蕩器中，在（37±0.5）℃下120 r/min 振搖24 h，離心，取水層，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，按“1.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算質(zhì)量濃度Cw，再計(jì)算表觀油水分配系數(shù)P，公式為P=（C0-Cw）/Cw，結(jié)果見表5。

表5 表觀油水分配系數(shù)測(cè)定結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了黃連總生物堿UV、HPLC 含量測(cè)定方法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，發(fā)現(xiàn)其準(zhǔn)確度高；考察了該成分分別在高溫、高濕、強(qiáng)光照條件下含量變化，發(fā)現(xiàn)均無明顯變化，表明它在上述條件下性質(zhì)穩(wěn)定，再通過指標(biāo)成分法研究該成分在不同介質(zhì)中的溶解性［12]，發(fā)現(xiàn)pH 為2.3～4.2 時(shí)其溶解性呈下降趨勢(shì)，在pH=2.3 磷酸鹽緩沖液中溶解量最大，表明在酸性溶液中該成分溶解性較號(hào)。

油水分配系數(shù)可模擬藥物在生物體內(nèi)水相和生物相之間的分配情況，從而預(yù)測(cè)藥物在腸道的吸收情況。大部分藥物的溶解度參數(shù)為8～12，而正辛醇為10.24，接近細(xì)胞膜溶解度參數(shù)10.3，可使藥物形成近似理想的溶液，具有更好的極性和溶解性，故選擇該溶劑作為油相來模擬生物膜［13]。

表觀油水分配系數(shù)P 的對(duì)數(shù)（lgP）在-1～2 范圍內(nèi)時(shí)，可認(rèn)為藥物在胃腸道吸收較好［14-16]。人體胃腸道pH值在1.4～8 之間，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃連總生物堿在上述pH范圍內(nèi)的lgP 為-1～2，表明其滲透性較好，為藥物最佳吸收范圍，可被胃腸道吸收，而且在人工胃液中的滲透性優(yōu)于其他溶液，可為相關(guān)劑型制備工藝開發(fā)提供參考。