王宇寧樊 暉梁克利

（1.沈陽(yáng)市第七人民醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110000；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110847；3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150076）

紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.為唇形科紫蘇屬植物，具有較高的食用及藥用價(jià)值，在我國(guó)應(yīng)用歷史悠久，紫蘇葉可做香料使用，紫蘇種子油可供食用，也可用于工業(yè)防腐用途［1]，我國(guó)資源豐富，華北、華中、華南、西南及臺(tái)灣省均有野生種和栽培種，印度、緬甸、日本、朝鮮、韓國(guó)、印度尼西亞、俄羅斯等國(guó)家均有分布［2]，具有宣肺化痰、解表散寒、行氣和胃等功效，傳統(tǒng)臨床常用于胃炎、支氣管炎、以及腎炎等炎癥性疾病的治療［3]。目前關(guān)于紫蘇葉的抗炎作用尤其是治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用越來(lái)越得到重視，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其提取物抗炎作用與抑制炎癥介質(zhì)釋放、調(diào)控活性氧簇一氧化氮水平等機(jī)制有關(guān)［4]，它含有豐富的揮發(fā)油、酚酸、黃酮等成分，被認(rèn)為是其主要的抗炎活性物質(zhì)［5-7]。因此，本課題組在相關(guān)文獻(xiàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)紫蘇葉的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，并以RAW264.7 細(xì)胞為評(píng)價(jià)模型，采用Western-blot 法檢測(cè)化合物對(duì)iNOS 及COX-2 等相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，初步對(duì)其抗炎活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料

Bruker-400 核磁共振儀（德國(guó)Bruker 公司，內(nèi)標(biāo)TMS）；Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司，UV 檢測(cè)器）；電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析儀（上海天能科技有限公司）；柱色譜用硅膠（青島海洋化工廠）；大孔吸附樹(shù)脂D101 填料（滄州寶恩樹(shù)脂科技有限公司）；ODS 填料（美國(guó)Welch公司）。DMSO（美國(guó)Sigma 公司）；Peroxidaseconjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit 及Anti-β-actin（美國(guó)Proteintech 公司）；P-Tau Rabbit mAb（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）；Tau Rabbit mAb（英國(guó)Abcam 公司）；Marker（上海信裕生物科技有限公司）；細(xì)胞裂解液、PMSF、ECL 發(fā)光液等（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；TEMED 及PVDF 膜（沈陽(yáng)鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司）；RAW264.7 細(xì)胞株（美國(guó)ATCC 公司）。紫蘇葉購(gòu)自遼河大藥房，由沈陽(yáng)市第七人民醫(yī)院王宇寧中藥師鑒定為紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.干燥葉。甲醇等溶劑均購(gòu)自于天津大茂化學(xué)試劑有限公司。

2 提取與分離

紫蘇葉干燥全草15 kg 粉碎后，采用8 倍量75%乙醇回流提取2 次，每次2 h，提取液合并后減壓濃縮至無(wú)醇味，得到提取物浸膏2.3 kg，蒸餾水溶解后用D101 大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行分離，以乙醇-水（0～100%）梯度洗脫，60%洗脫部分經(jīng)正相硅膠柱，二氯甲烷-甲醇（100∶0～1∶1）梯度洗脫，取20∶1 洗脫部分進(jìn)行分離，經(jīng)ODS 反相柱，分別采用10%、30%、50%、70%、100% 甲醇-水洗脫，進(jìn)一步采用半制備型HPLC，以甲醇-水洗脫純化，其中10% 部分經(jīng)過(guò)純化分離，得化合物1；30%部分經(jīng)過(guò)純化分離，得到化合物2～4、5、6～7。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無(wú)定形粉末。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）中顯示δH1.15（3H，d，J=6.3 Hz，H-10），1.10（3H，s，H-13），1.01（3H，s，H-12），0.73（3H，s，H-11）提示為4 個(gè)甲基上的氫信號(hào)，δH5.69（1H，dd，J=15.9，0.9 Hz，H-7），5.68（1H，dd，J=15.9，5.9 Hz，H-8）為一組反式雙鍵上的氫信號(hào)。 δH1.50（1H，d，J=12.0 Hz，H-2），1.27（1H，dd，J=12.0，3.0 Hz，H-2）和δH1.59（2H，m，H-4）為兩組亞甲基上的氫信號(hào)；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）中顯示δC27.3，27.1，26.0，24.8 提示為4 個(gè)甲基碳信號(hào)，δC135.1，129.2 為一組雙鍵上的碳信號(hào)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［8] 基本一致，故鑒定為（3R，5S，6S，7E，9S）-megastiman-7-ene-3，5，6，9-tetrol。

化合物2：無(wú)色油狀物。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6） δ：6.92（1H，d，J=8.2 Hz，H-6′），6.78（1H，d，J=1.9 Hz，H-3′），6.66（1H，dd，J=8.2，1.9 Hz，H-5′），4.44（2H，m，H-9′），4.06（1H，m，H-2），3.72（3H，s，2′-OCH3），3.54（2H，m，H-1），3.54（2H，m，H-3），2.62（2H，m，H-7′），1.68（2H，m，H-8′）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6） δ：60.4（C-1），81.5（C-2），60.4（C-3），145.7（C-1′），150.0（C-2′），116.6（C-3′），135.7（C-4′），120.3（C-5′），113.1（C-6′），31.5（C-7′），34.7（C-8′），60.5（C-9′），55.7（2′-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［9] 基本一致，故鑒定為 2-［4-（3-hydroxypropyl）-2-methoxyphenoxy] propance-1，3-diol。

化合物3：黃色油狀物。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6） δ：6.97（1H，d，J=8.2 Hz，H-6′），6.79（1H，d，J=1.8 Hz，H-3′），6.67（1H，dd，J=8.2，1.8 Hz，H-5′），4.29（1H，m，H-2），4.29（2H，m，H-9′），4.19（1H，d，J=7.8 Hz，H-1″），4.05（1H，m，H-6″），3.92（1H，m，H-5″），3.88（2H，m，H-3），3.73（3H，s，2′-OCH3），3.63（1H，m，H-4″），3.59（1H，m，H-3”），3.58（1H，m，H-6″），3.57（2H，d，J=11.1 Hz，H-1），3.28（1H，m，H-2″），2.53（2H，m，H-7′），1.69（2H，m，H-8′）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：68.0（C-1），78.9（C-2），60.1（C-3），145.1（C-1′），149.6（C-2′），116.1（C-3′），135.6（C-4′），120.0（C-5′），112.8（C-6′），31.3（C-7′），34.5（C-8′），60.2（C-9′），55.5（2′-OCH3），103.5（C-1″），73.4（C-2″），76.7（C-3″），70.0（C-4″），76.9（C-5″），61.0（C-6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［10] 基本一致，故鑒定為 1-O-（β-Dglucosyl）-2-［2-methoxy-4-（-hydroxypropyl）-phenoxy] -propan-3-ol。

化合物4：黃色油狀物（甲醇）。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6） δ：6.38（1H，brs，H-2′），6.63（1H，brs，H-2），6.38（1H，brs，H-6′），6.15（1H，brs，H-5），4.62（1H，d，J=8.0 Hz，H-7′），3.78（2H，m，H-9），3.74（3H，s，3-OCH3），3.72（3H，s，3′-OCH3），3.72（3H，s，5′-OCH3），2.72（2H，m，H-7），3.20（2H，m，H-9′），2.18（1H，m，H-8′），1.68（1H，t，J=8.4 Hz，H-8）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6） δ：132.7（C-1），112.0（C-2），145.7（C-3），144.3（C-4），116.3（C-5），127.3（C-6），32.4（C-7），38.3（C-8），63.8（C-9），136.3（C-1′），106.9（C-2′），148.0（C-3′），134.0（C-4′），148.0（C-5′），106.9（C-6′），49.0（C-7′），46.4（C-8′），60.0（C-9′），55.7（3-OCH3），56.2（3′-OCH3），56.2（5′-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［11] 基本一致，故鑒定為 5-methoxyisolariciresinol。

化合物5：黃色油狀物（甲醇）。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6） δ：7.00（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），6.84（1H，brs，H-2），6.84（1H，brs，H-2′），6.72（1H，d，J=8.0 Hz，H-5′），6.70（1H，brd，J=8.0 Hz，H-6），6.70（1H，d，J=8.0 Hz，H-6′），4.85（1H，d，J=7.3 Hz，H-7），4.67（1H，d，J=6.8 Hz，H-1″），3.87（1H，m，H-9′），3.76（6H，s，3，3′-OCH3），3.68（2H，m，H-9），3.62（1H，m，H-6″），3.57（1H，m，H-9′），3.47（1H，m，H-6″），3.26（1H，m，H-3″），3.25（1H，m，H-5″），3.20（1H，m，H-4″），3.17（1H，m，H-7′），3.12（1H，m，H-2″），2.88（1H，m，H-8′），2.61（1H，m，H-7′），2.47（1H，m，H-8）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6） δ：134.9（C-1），110.2（C-2），149.0（C-3），145.7（C-4），115.6（C-5），118.4（C-6），82.0（C-7），52.5（C-8），58.8（C-9），134.9（C-1′），113.3（C-2′），147.4（C-3′），145.0（C-4′），115.2（C-5′），120.6（C-6′），32.4（C-7′），42.0（C-8′），72.0（C-9′），55.8（3，3′-OCH3），100.6（C-1″），73.4（C-2″），77.2（C-3″），69.9（C-4″），77.0（C-5″），60.9（C-6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12] 基本一致，故鑒定為lariciresinol 4′-O-β-D-glucopyranoside。

化合物6：白色結(jié)晶（甲醇）。1H-NMR（CDCl3）譜中的δH7.99 和δH6.91 顯示各有2 個(gè)氫存在，分別被鄰位、間位相互偶合裂分為dd 峰，表明苯環(huán)為對(duì)位取代；由13C-NMR 和1H-NMR 可知該化合物含有苯環(huán)，1 個(gè)甲基，4 個(gè)亞甲基，3 個(gè)次甲基，3 個(gè)季碳。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13] 基本一致，故鑒定為butyl p-hydroxybenzoate。

化合物7：黃綠色無(wú)定形粉末。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6） δ：8.10（1H，s，H-7），7.65（1H，s，H-8′），7.46（1H，d，J=8.4 Hz，H-6），7.25（1H，d，J=8.4 Hz，H-5），7.24（1H，s，H-6′），6.60（1H，s，H-3′）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6） δ：123.2（C-1），123.2（C-2），136.2（C-3），141.1（C-4），119.8（C-5），121.3（C-6），127.3（C-7），127.2（C-8），167.7（C-9），110.2（C-1′），145.0（C-2′），104.0（C-3′），148.2（C-4′），142.7（C-5′），108.3（C-6′），126.6（C-7′），110.9（C-8′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14] 基本一致，故鑒定為mongolicumin A。

4 抗炎活性篩選

將RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)與DMEM 培養(yǎng)基中（含有10% FBS），細(xì)胞按每孔8×104/0.5 mL 濃度接種至24 孔板內(nèi)，孵育24 h。待測(cè)化合物（DMSO 溶解，終濃度為80 μmol/L）及陽(yáng)性藥10 μg/mL地塞米松（DEX）預(yù)處理1 h 后，脂多糖（LPS，質(zhì)量濃度為100 ng/mL）刺激18 h。再提取細(xì)胞總蛋白，用于iNOS 和COX-2 蛋白的電泳及檢測(cè)。

結(jié)果顯示，經(jīng)LPS 刺激后iNOS 和COX-2 蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示造模成功。DEX 在10 μg/mL質(zhì)量濃度下可顯著抑制iNOS、COX-2 蛋白表達(dá)，而化合物2可顯著抑制iNOS 蛋白表達(dá)，提示它有一定的抗炎活性。見(jiàn)圖1。

圖1 各化合物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞中iNOS、COX-2蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of various compounds on protein expressions of iNOS and COX-2 in RAW264.7 cells model

5 結(jié)論

誘導(dǎo)型iNOS 是利用一氧化氮的氧化應(yīng)激，協(xié)助巨噬細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中對(duì)抗病原體的一類(lèi)酶。其在細(xì)胞受到刺激而被激活后才發(fā)揮功效，并且所生成的一氧化氮數(shù)量較多。COX 又稱(chēng)前列腺素過(guò)氧化物合成酶，是前列腺素（PG）合成過(guò)程中一個(gè)重要的限速酶，可將花生四烯酸代謝成各種前列腺素產(chǎn)物，從而在機(jī)體的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮作用。以上兩者均為重要的炎癥介質(zhì)，其表達(dá)程度可以作為炎癥的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

本研究對(duì)紫蘇葉乙醇提取物中化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分離純化，得到7 個(gè)化合物，并對(duì)分離得到的各單體化合物體外抗炎活性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。其中化合物2在80 μmol/L 時(shí)可以顯著的抑制iNOS 的蛋白表達(dá)，顯示出一定的抗炎活性。以期該研究為紫蘇葉開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供部分前期工作基礎(chǔ)。