辛 娟，易 華，談秀鳳，丁 玉

（1.黃河科技學(xué)院，河南 鄭州 450063；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203）

大黃是中藥制劑常用藥味之一［1-3]，大黃酚是其主要成分，具有清熱解毒、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、改善腦損傷、調(diào)血脂等多種作用［4-5]，但該成分在25 ℃時(shí)的溶解度僅為0.96 μg/mL，而且容易氧化，導(dǎo)致其口服吸收較差［6]，而且對(duì)胃腸道也有一定的刺激作用［6]。納米技術(shù)可有效促進(jìn)藥物吸收［7]，目前大黃酚相關(guān)制劑有脂質(zhì)體、納米囊、膠束等［6，8]，但存在制備工藝復(fù)雜、需使用表面活性劑、載藥量低等缺陷。

近年來，采用白蛋白作為納米載體的研究越來越多［9-11]，其分子結(jié)構(gòu)中的氨基酸以肽鍵一一相連，并在空間上扭曲成團(tuán)，形成了網(wǎng)狀空隙結(jié)構(gòu)和疏水區(qū)域，非常有利于攜帶、鑲嵌或結(jié)合藥物［12]，Bioscience 公司開發(fā)的NabTM技術(shù)所制備的紫杉醇白蛋白納米制劑Abraxane? 已被FDA 批準(zhǔn)用于臨床。因此，本實(shí)驗(yàn)采用來源廣泛的牛血清白蛋白，參考NabTM技術(shù)將大黃酚制成白蛋白納米粒，并對(duì)其進(jìn)行表征，以期通過白蛋白納米粒促進(jìn)該成分體外溶出和體內(nèi)吸收，并為相關(guān)制劑革新提供參考。

1 材料

U3000 型高效液相色譜儀（美國戴安公司）；Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)（美國Millipre 公司）；PL203 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DF-101S 型磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；BDF-86V55 型超低溫冰箱（山東博科再生醫(yī)學(xué)有限公司）；JY92-II 型超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BKFD10S 型凍干機(jī)（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；Master-sizer 型粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；MD200-2 型氮?dú)獯祾邇x（杭州奧威儀器有限公司）；Nanosep? 超濾離心管（截留相對(duì)分子質(zhì)量10 000，美國Pall 公司）；H-7240 型透射電鏡（日本Hitachi 公司）。

大黃酚對(duì)照品（批號(hào)110757-201808，純度98.6%，中國食品藥品檢定研究院）；大黃酚原料藥（批號(hào)170915，純度98.0%，武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司）；牛血清白蛋白（批號(hào)201901118，白蛋白純度≥98%，上海藍(lán)季生物科技公司）。甲醇（批號(hào)I1088607-017，德國默克公司）。SD 大鼠購自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（豫）2016-0001，先在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)3 d，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)選擇體質(zhì)量（300±20）g 者進(jìn)行研究。

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃酚白蛋白納米粒及其凍干粉制備 參考文獻(xiàn)［13] 報(bào)道的方法，稱取處方量大黃酚至一定體積二氯甲烷中，超聲處理30 s 溶解，作為有機(jī)相；蒸餾水配制含4%白蛋白的溶液80 mL，作為水相，將有機(jī)相緩慢滴加至水相中，并于細(xì)胞粉碎儀（功率300 W，每間隔2 s 工作2 s）超聲處理，得O/W 初乳，在45 ℃下減壓旋蒸除去有機(jī)相，過0.45 μm 微孔濾膜，加蒸餾水至80 mL，分裝至西林瓶中，置于-60 ℃超低溫冰箱中冷凍2 d，再迅速轉(zhuǎn)移至-40 ℃冷凍干燥機(jī)中2 d，即得。

2.2 大黃酚含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相0.1% 磷酸-甲醇（25∶75）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長429 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 方法學(xué)考察 稱取大黃酚對(duì)照品10 mg 至100 mL 量瓶中，1 mL 二甲基亞砜超聲溶解，甲醇定容至刻度，得100 μg/mL 貯備液，取適量，加入0.1% 磷酸-甲醇（25∶ 75）制成10、5、1、0.5、0.1、0.02 μg/mL 對(duì)照品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程為Y=1.821 5X-0.069 2（r=0.999 8），在0.02～10 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

取大黃酚白蛋白納米粒凍干粉約10 mg 至100 mL量瓶中，蒸餾水復(fù)溶后取2.5 mL 至10 mL量瓶中，甲醇沉淀蛋白，超聲處理5 min 后甲醇定容至刻度，過0.22 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液，平行6 份，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得大黃酚峰面積RSD 為1.37%，表明該方法重復(fù)性較好。取同一份供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得大黃酚峰面積RSD 為0.22%，表明儀器精密度較好。取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得大黃酚峰面積RSD 為0.49%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取9 份凍干粉，每份10 mg，置于100 mL量瓶中，分別加入大黃酚對(duì)照品0.65、1.30、1.95 mg 各3 份，蒸餾水復(fù)溶，取2.5 mL 至10 mL量瓶中，加入甲醇沉淀蛋白，超聲提取5 min，甲醇定容至刻度，過0.22 μm 微孔濾膜，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，大黃酚平均加樣回收率分別為100.38%、99.26%、100.11%，RSD 分別為0.43%、1.14%、0.83%。

2.3 包封率、載藥量測(cè)定 采用低溫超濾法。取1 mL 大黃酚白蛋白納米粒混懸液至超濾離心管（截留分子量為20 kDa）中，-4 ℃下6 000 r/min離心20 min，取濾液，HPLC 法測(cè)定游離大黃酚的量（m游離）；取1 mL 混懸液至10 mL 量瓶中，加入甲醇沉淀蛋白，超聲處理5 min 后甲醇定容至刻度，過0.22 μm 微孔濾膜，HPLC 法測(cè)定總量（m總），計(jì)算包封率、載藥量，公式分別為包封率=［（m總-m游離）/m總] × 100%、載藥量=［（m總-m游離）/m總質(zhì)量] ×100%，其中m總質(zhì)量為大黃酚白蛋白納米粒的總質(zhì)量。

2.4 單因素試驗(yàn) 前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，有機(jī)相體積、藥物用量、超聲功率、超聲時(shí)間均會(huì)對(duì)包封率、粒徑產(chǎn)生一定影響，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)上述因素進(jìn)行考察。另外，牛血清白蛋白除了作為載體外，還可當(dāng)做凍干保護(hù)劑，但其質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于3.5%時(shí)所制備凍干粉末的性質(zhì)不理想，故固定為4%。

2.4.1 有機(jī)相體積 固定藥物用量0.5 g、4%白蛋白溶液體積80 mL、超聲功率300 W、超聲時(shí)間6 min，通過改變有機(jī)相（二氯甲烷）體積（5、8、10、12 mL）來考察白蛋白納米粒對(duì)包封率、粒徑、PDI 的影響，結(jié)果見表1。由此可知，當(dāng)有機(jī)相體積為10 mL 時(shí)包封率最高，粒徑、PDI 相對(duì)理想；為12 mL 時(shí)雖然粒徑最小，但包封率有所下降，最終確定有機(jī)相體積為10 mL。

表1 有機(jī)相體積對(duì)包封率、粒徑、PDI 的影響（n=3）Tab.1 Effects of organic phase volume on encapsulation efficiency，particle size and PDI（n=3）

2.4.2 藥物用量 固定有機(jī)相體積10 mL、4%白蛋白溶液體積80 mL、超聲功率300 W、超聲時(shí)間6 min，通過改變藥物（大黃酚）用量（0.4、0.45、0.5、0.55 g）來考察白蛋白納米粒對(duì)包封率、粒徑、PDI 的影響，結(jié)果見表2。由此可知，當(dāng)藥物用量超過0.5 g 時(shí)包封率有所下降，而且粒徑、PDI 均有一定程度的上升，可見在一定條件下白蛋白攜帶藥物能力有一定限制，最終確定藥物用量為0.5 g。

表2 藥物用量對(duì)包封率、粒徑、PDI 的影響（n=3）Tab.2 Effects of drug consumption on encapsulation efficiency，particle size and PDI（n=3）

2.4.3 超聲功率 固定有機(jī)相體積10 mL、藥物用量0.5 g、4%白蛋白溶液體積80 mL、超聲時(shí)間6 min，通過改變超聲功 率（200、250、300、350 W）來考察白蛋白納米粒對(duì)包封率、粒徑、PDI 的影響，結(jié)果見表3。由此可知，隨著超聲功率增加粒徑逐漸下降，為350 W 時(shí)包封率開始下降，PDI 明顯上升，最終確定超聲功率為300 W。

表3 超聲功率對(duì)包封率、粒徑、PDI 的影響（n=3）Tab.3 Effects of ultrasonic power on encapsulation efficiency，particle size and PDI（n=3）

2.4.4 超聲時(shí)間 固定有機(jī)相體積10 mL、藥物用量0.5 g、4% 白蛋白溶液80 mL、超聲功率300 W，通過改變超聲時(shí)間（4、6、8、10 min）來考察白蛋白納米粒對(duì)包封率、粒徑、PDI 的影響，結(jié)果見表4。由此可知，當(dāng)超聲時(shí)間超過6 min后粒徑變化不大，但PDI 增加，包封率開始下降，最終確定超聲時(shí)間為6 min。

表4 超聲時(shí)間對(duì)包封率、粒徑、PDI 的影響（n=3）Tab.4 Effects of ultrasound time on encapsulation efficiency，particle size and PDI（n=3）

2.4.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選擇有機(jī)相體積為10 mL，藥物用量為0.5 g，超聲功率為300 W，超聲時(shí)間為6 min，所制得的大黃酚白蛋白納米粒外觀見圖1，平行3 批，測(cè)得平均包封率為（93.61±1.02）%，載藥量為（12.19±1.03）%。

圖1 大黃酚白蛋白納米粒外觀Fig.1 Appearance of chrysophanol albumin nanoparticles

2.5 粒徑、Zeta 電位、形態(tài) 取3 份大黃酚白蛋白納米粒，每份0.1 mL，加入10 mL 蒸餾水稀釋，激光粒度儀測(cè)定粒徑、PDI、Zeta 電位，結(jié)果見圖2～3，可知其平均粒徑為（156.5±6.7）nm，PDI為0.025±0.007，Zeta 電位為（-35.1±3.8）mV。再將白蛋白納米?；鞈乙河?.5%磷鎢酸負(fù)染，置于透射電鏡儀上觀察形態(tài)，結(jié)果見圖4，可知它呈球形。

圖2 大黃酚白蛋白納米粒粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of chrysophanol albumin nanoparticles

圖3 大黃酚白蛋白納米粒Zeta 電位Fig.3 Zeta potential of chrysophanol albumin nanoparticles

圖4 大黃酚白蛋白納米粒透射電鏡圖Fig.4 Transmission electron microscope image for chrysophanol albumin nanoparticles

2.6 溶解度測(cè)定 采用飽和溶劑法。取過量大黃酚及其白蛋白納米粒凍干粉，置于三角瓶中，加入5 mL蒸餾水得混懸液，25 ℃下800 r/min 磁力攪拌3 d，12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，大黃酚溶解度為（0.96±0.08）μg/mL，而其白蛋白納米粒升高至（34.75±0.92）μg/mL。

2.7 體外釋藥行為研究 取大黃酚及其白蛋白納米粒凍干粉適量（大黃酚量均為5 mg），加入3 mL溶出介質(zhì)，振蕩混勻后置于透析袋中（截留分子質(zhì)量為10 000 Da）。溶出介質(zhì)為900 mL 0.5%十二烷基硫酸鈉，轉(zhuǎn)速、溶出介質(zhì)溫度分別設(shè)定為75 r/min、37 ℃，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的取樣點(diǎn)取樣3 mL，同時(shí)補(bǔ)充3 mL 空白溶出介質(zhì)，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，繪制溶出曲線，結(jié)果見圖5。由此可知，原料藥48 h 內(nèi)累積溶出度僅為24.46%，而白蛋白納米粒升高至74.81%，表明該劑型對(duì)大黃酚具有明顯的促溶出作用，有利于增加藥物口服吸收，提高其生物利用度。

圖5 大黃酚體外溶出曲線（n=6）Fig.5 In vitro dissolution curves for chrysophanol（n=6）

2.8 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

2.8.1 分組、給藥與采血 取大鼠12 只，禁食過夜后隨機(jī)分為大黃酚組、大黃酚白蛋白納米粒組，每組6 只，自由飲用生理鹽水。取大黃酚及其白蛋白納米粒凍干粉適量，0.5% CMC-Na 溶液配制成5 mg/mL混懸液（臨用現(xiàn)配），并按20 mg/kg 劑量灌胃給藥。大黃酚組大鼠于0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8 h 眼眶采血約0.2 mL，大黃酚白蛋白納米粒組大鼠采血點(diǎn)增加10、12 h，血樣置于肝素浸潤的離心管中，2 500 r/min 離心2 min，上層血漿保存于-15 ℃冰箱中。

2.8.2 血漿樣品處理 根據(jù)文獻(xiàn)［14] 報(bào)道的方法，并對(duì)處理過程略作修改。精密量取血漿100 μL，加入500 μL 甲醇渦旋1 min，沉淀蛋白，8 000 r/min 離心10 min，分取上清液，置于氮吹儀中，50 ℃下緩慢吹干得殘?jiān)?，加?00 μL 流動(dòng)相復(fù)溶，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。

2.8.3 線性關(guān)系考察 取大黃酚對(duì)照品溶液，空白血漿制成0.05、0.2、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL血漿對(duì)照品溶液，按“2.8.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y=0.159 2X-0.018 5（r=0.996 4），在0.05～8.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.8.4 方法學(xué)考察 空白血漿配制0.05 μg/mL（低）、1.0 μg/mL（中）、8.0 μg/mL（高）血漿樣品，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，并與實(shí)際質(zhì)量濃度對(duì)比，測(cè)得平均加樣回收率分別為87.61%、91.02%、93.27%，RSD 分別為4.56%、3.78%、2.87%。取1.0、4.0、8.0 μg/mL 血漿對(duì)照品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得大黃酚峰面積RSD 分別為2.11%、1.63%、1.02%，表明儀器精密度良好。取血漿樣品，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得峰面積RSD 為3.47%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取0.05 μg/mL 血漿對(duì)照品溶液，空白血漿稀釋，按“2.8.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得定量限、檢測(cè)限分別為4、2 ng/mL。

2.8.5 結(jié)果分析 表5、圖6 顯示，與原料藥比較，白蛋白納米粒Tmax縮短（P ＜0.05），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），相對(duì)生物利用度增加至4.02 倍。

表5 大黃酚主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（，n=6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for chrysophanol（，n=6）

注：與大黃酚比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖6 大黃酚血藥濃度-時(shí)間曲線（n=6）Fig.6 Plasma concentration-time curves for chrysophanol（n=6）

3 討論

體外釋藥結(jié)果表明，大黃酚白蛋白納米粒呈現(xiàn)緩釋特征，但體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)發(fā)現(xiàn)其Tmax顯著提前，與文獻(xiàn)［12，15] 報(bào)道一致，其原因可能是納米?？稍谳^短時(shí)間內(nèi)經(jīng)消化道直接吸收進(jìn)入血液循環(huán)［16]，而本實(shí)驗(yàn)納米載體采用白蛋白，可能與機(jī)體血漿中的白蛋白發(fā)生快速交換［10]，從而加快藥物在血液中的釋放速度；也有觀點(diǎn)認(rèn)為，藥物與白蛋白分子之間的作用力可能較弱，導(dǎo)致藥物在體內(nèi)釋藥較快，最終使Tmax提前，也極大促進(jìn)了藥物體內(nèi)吸收［16-18]。

目前，已報(bào)道的大黃酚新型口服制劑有微囊［19]、包合物［20]等。本實(shí)驗(yàn)制備的白蛋白納米?？诜锢枚忍岣吡?.02 倍，與其他納米制劑［6，8，21]相比，它不僅載體生物相容性更好，安全性更高，而且載體本身也可作為凍干保護(hù)劑，減少了輔料使用，降低了成本，同時(shí)無需表面活性劑或交聯(lián)劑。但該制劑也有不足之處，例如在制備過程中采用有毒試劑二氯甲烷；雖然藥物水溶性有所提高，但其體外溶出仍較緩慢，而且脂溶性可能未得到改善，從而限制了其口服生物利用度的提高，今后將對(duì)此作進(jìn)一步改進(jìn)。