趙松浩，陶秋爽，沈建仁，王文達(dá)

中國科學(xué)院植物研究所 中國科學(xué)院光生物學(xué)重點實驗室，北京 100093

1 硅藻光合作用

光合作用是地球上最重要的化學(xué)反應(yīng)之一。它可以大規(guī)模地利用太陽光能，以二氧化碳、水等無機物為主要原料，合成碳水化合物等有機物，并產(chǎn)生氧氣。氧氣的出現(xiàn)直接改變了地球表面大氣層的成分和結(jié)構(gòu)，并形成臭氧層，為生物大爆發(fā)和高等生命的出現(xiàn)以及人類進化提供了前提條件。光合作用合成的有機物也為人類和動物等提供生命活動所必需的食物，并直接或間接地為人類社會發(fā)展提供煤和石油等化石燃料，是現(xiàn)代文明中農(nóng)業(yè)和工業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)(圖1)。

圖1 光合作用與人類社會

光合作用分為光反應(yīng)和暗反應(yīng)兩個階段，其中負(fù)責(zé)光反應(yīng)的色素-蛋白復(fù)合物主要進行捕光、傳能、原初電荷分離和傳遞電子以及跨膜質(zhì)子轉(zhuǎn)運[1]，并為接下來的暗反應(yīng)固碳提供能量和還原力。為實現(xiàn)高效的捕光以驅(qū)動光合作用的進行，色素-蛋白復(fù)合物分為捕光天線復(fù)合物和反應(yīng)中心兩種模塊，分別主要負(fù)責(zé)光能的捕獲和光化學(xué)反應(yīng)[2]。光合生物為了更好地適應(yīng)不同的環(huán)境，經(jīng)歷了多個階段的進化，比如從不產(chǎn)氧光合細(xì)菌到產(chǎn)氧光合細(xì)菌，從原核藍(lán)細(xì)菌到真核單細(xì)胞藻類再到多細(xì)胞高等植物。數(shù)十億年的進化過程導(dǎo)致光合生物的多樣性，出現(xiàn)了光合細(xì)菌、微藻、苔蘚以及高等植物等光合物種，也演化出多彩多樣的色素-蛋白復(fù)合物，出現(xiàn)I型和II型兩種反應(yīng)中心以及外圍的水溶性捕光蛋白和膜蛋白兩種捕光天線。反應(yīng)中心和捕光天線進一步組裝成超級復(fù)合物，在光合膜上發(fā)揮作用，比如紫細(xì)菌中的反應(yīng)中心和捕光天線超級復(fù)合物(reaction center-light harvesting 1 supercomplex, RC-LH1)[3]、藍(lán)藻和紅藻中的光系統(tǒng)II-藻膽體復(fù)合物(photosystem II-phycobilisomes, PSII-PBS)[4-5]、綠藻和植物中的光系統(tǒng)II-捕光天線復(fù)合物(photosystem II-light harvesting complex II, PSII-LHCII)[6]和光系統(tǒng)I-捕光天線復(fù)合物(photosystem I-light harvesting complex I, PSI-LHCI)[7]。進化過程中豐富多彩的光合色素-蛋白復(fù)合物為我們認(rèn)識和研究光合作用機理提供了不同的視角。

硅藻是地球光合生物的重要分支之一。十多億年前，原核藍(lán)藻內(nèi)共生而產(chǎn)生兩支主要的真核光合生物類群，其中：原始的綠藻進化為現(xiàn)代綠藻和陸地植物，成為綠色分支；而以單細(xì)胞紅藻開始的紅色分支(紅系)經(jīng)歷了二次或者三次內(nèi)共生演化出隱藻、褐藻、硅藻和甲藻等類群。硅藻大約誕生于侏羅紀(jì)，其葉綠體因為二次內(nèi)共生具有四層膜，不同于常見高等植物的葉綠體雙層膜結(jié)構(gòu)[8]。從細(xì)胞結(jié)構(gòu)看，硅藻為單細(xì)胞生物，表面為硅質(zhì)外殼，細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)對稱性，并根據(jù)對稱方式的不同，分為中心對稱的中心綱和兩側(cè)對稱的羽紋綱兩類[9-10]。硅藻具有極強的適應(yīng)能力，能在高原和南極等極端條件下生存。硅藻對光合產(chǎn)量的貢獻(xiàn)巨大，其凈原初產(chǎn)量在全球每年的光合原初生產(chǎn)量中約占1/5，相當(dāng)于陸地?zé)釒в炅值墓夂显跎a(chǎn)量之和[11]，這與其高效的光能利用效率和超強的光適應(yīng)能力有關(guān)。

2 硅藻光合膜蛋白與結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究

硅藻特有的紅系捕光天線是其實現(xiàn)高效光能捕獲的分子基礎(chǔ)。硅藻的捕光天線為巖藻黃素-葉綠素a/c蛋白(fucoxanthin-chlorophyll a/c protein, FCP)，可以捕獲藍(lán)綠光和綠光[12]，這也是硅藻細(xì)胞顏色呈現(xiàn)紅棕色的原因(圖2)。從結(jié)合的色素種類上看，硅藻的主要捕光色素為葉綠素a、葉綠素c、巖藻黃素和硅甲藻黃素等。高等植物、苔蘚和綠藻等綠色系統(tǒng)光合生物的主要捕光色素除了葉綠素a外，還有葉綠素b、葉黃素和紫黃質(zhì)等。硅藻中巖藻黃素等類胡蘿卜素與葉綠素的相對比例高于常見的綠色系統(tǒng)光合生物，適合在深水弱光環(huán)境下有效地捕獲光能。另外，硅藻的光系統(tǒng)反應(yīng)中心與其他物種相比起來是保守的，但是催化裂解水并釋放氧氣的相關(guān)蛋白也有獨到之處。與其他綠色微藻和植物相比，硅藻獨特的光系統(tǒng)和捕光天線復(fù)合物使硅藻不僅在弱光條件下可以有效地捕獲藍(lán)綠光和綠光，保持光系統(tǒng)的水裂解活性，而且在強光下可以有效地淬滅過多激發(fā)能，防止活性氧產(chǎn)生而導(dǎo)致?lián)p傷，因此硅藻具有極強的光環(huán)境適應(yīng)能力[13]。

硅藻光系統(tǒng)和捕光天線的光合特性和結(jié)構(gòu)解析研究一直比較滯后，缺乏足夠的結(jié)構(gòu)生物學(xué)證據(jù)，極大地限制了人們對于硅藻光合作用機理的認(rèn)識[14-16]。為精確和深入了解硅藻的光系統(tǒng)和捕光天線，中國科學(xué)院植物研究所的科研團隊首先以羽紋綱的三角褐指藻為研究材料，純化和表征了其雙體FCP天線，篩選和優(yōu)化了FCP晶體(圖2)，最終解析得到1.8 ?(1 ? =10-10m)分辨率的雙體FCP結(jié)構(gòu)[17]。通過光譜定性或者定量分析硅藻光合膜蛋白的色素和亞基的組成，研究其捕獲和傳遞光能的特點相對比較容易，難點在于將高純度的FCP天線蛋白規(guī)則地培養(yǎng)成晶體。由于膜蛋白結(jié)合了生物膜上的大量不規(guī)則的脂分子，這一步通常需要耗費科研人員數(shù)年的時間和心血。在準(zhǔn)備好形狀規(guī)則的漂亮晶體后(圖2)，科研人員在我國上海的第三代同步輻射光源取得晶體的X-射線衍射圖樣，最終通過一系列復(fù)雜的運算，在原子分辨率下搭建出蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)模型(圖3)。一般蛋白質(zhì)中的化學(xué)鍵長度和強相互作用的距離在1.0～3.0 ?之間，而1.8 ?分辨率意味著科研人員可以準(zhǔn)確地判斷蛋白質(zhì)中碳、氮、氧原子的距離，并以此為基礎(chǔ)分析硅藻 FCP捕光天線中蛋白和色素網(wǎng)絡(luò)的細(xì)節(jié)，探索硅藻光合作用的分子機理。

圖2 硅藻FCP捕光天線蛋白的純化和結(jié)晶

圖3 硅藻第一個FCP二聚體晶體結(jié)構(gòu)

除了晶體學(xué)技術(shù)外，另一種重要的結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)——單顆粒冷凍電鏡，是目前研究大分子量蛋白結(jié)構(gòu)的重要手段，而且節(jié)省了培養(yǎng)蛋白質(zhì)晶體的繁瑣步驟，只需要將蛋白質(zhì)冷凍在玻璃態(tài)的冰層中，并在300 kV的高壓透射電子顯微鏡下采集“照片”(圖4)?？蒲腥藛T將照片中的蛋白顆粒挑選出來，進行分類和電子密度的構(gòu)建，就可能獲得近原子分辨率的結(jié)構(gòu)模型。硅藻的光系統(tǒng)Ⅱ-捕光天線超級復(fù)合體(PSII-FCPII)的分子量超過1 400 kDa，非常適合冷凍電鏡技術(shù)；而此前FCP捕光天線蛋白分子量較小，在電子顯微鏡下的投影很弱，其結(jié)構(gòu)適合通過晶體學(xué)技術(shù)來解決。2019年中國科學(xué)院植物研究所團隊與清華大學(xué)的研究團隊合作，以單顆粒冷凍電子顯微鏡為研究手段，解析得到3.0 ?分辨率的PSII-FCPⅡ超級復(fù)合物的結(jié)構(gòu)[18]。這兩項結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究首次展現(xiàn)了硅藻光系統(tǒng)反應(yīng)中心和天線的結(jié)構(gòu)，使我們對硅藻色素-蛋白復(fù)合物中捕光、傳能和能量轉(zhuǎn)化，以及快速適應(yīng)光環(huán)境的機制有了更加具體和深刻的認(rèn)識。

圖4 硅藻PSII-FCPⅡ的單顆粒冷凍透射電鏡：從負(fù)染電鏡檢查表征到單顆粒冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集、二維顆粒分類處理和三維密度重構(gòu)計算的流程。綠色線條圈出的是光合膜蛋白顆粒在冰層中的分布

3 硅藻FCP天線和光系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及組裝

科研人員發(fā)現(xiàn)三角褐指藻雙體FCP的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)二重對稱性(圖3)，兩個FCP蛋白亞基以“頭對頭”的方式結(jié)合形成二聚體，這顛覆了此前國際上FCP三聚體的主流觀點。單體FCP的結(jié)構(gòu)與高等植物和綠藻的LHC捕光天線蛋白的三維結(jié)構(gòu)相似，主要由三個跨膜α-螺旋組成，而主要區(qū)別在FCP蛋白末端區(qū)域。雖然以硅藻為代表的紅色光合生物跟綠藻和高等植物為代表的綠色光合生物是平行進化，但是兩者最終都選擇了以三個跨膜螺旋為主要特征的天線結(jié)構(gòu)作為基本組裝單元[19]，殊途同歸。這也體現(xiàn)了生命進化和自然選擇的奇妙之處。

晶體結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，三角褐指藻FCP的Lhcf4蛋白亞基結(jié)合7個葉綠素a、2個葉綠素c、7個巖藻黃素和1個硅甲藻黃素。在硅細(xì)胞內(nèi)每個天線是有序組合和流水線生產(chǎn)的，可以形象地認(rèn)為捕光天線的蛋白和色素復(fù)合體像樂高玩具一樣拼插，而零件就是每個蛋白亞基和色素。FCP蛋白和色素組裝成復(fù)合體后再進一步與光系統(tǒng)反應(yīng)中心組裝成超級復(fù)合物，最終有序且高效地將太陽光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能。

FCP單體進一步組裝以雙體和四體形式為主，不同于高等植物和綠藻的三體LHCII(圖5(e)～(g))。雙體組裝模式中，兩個Lhcf4單體之間的相互作用主要由C螺旋上精氨酸和絲氨酸形成的兩個強氫鍵以及跨膜區(qū)域的疏水作用介導(dǎo)，以“頭對頭”的形式組裝(圖5(e))，區(qū)別于LHCII三體的“頭尾相接”模式。相反，四聚體組裝模式中，F(xiàn)CP-A單體則以“頭尾相接”的方式組裝，整體形狀類似碗狀：碗底由FCP-A基質(zhì)側(cè)的環(huán)(loop)結(jié)構(gòu)域相互聚攏而成；碗壁處的相互作用由相鄰單體的色素和脂質(zhì)分子等的配位作用介導(dǎo)[20]；碗口則朝向囊腔側(cè)，相互距離較大，呈相對開放狀態(tài)(圖5(g))。高等植物三體LHCII中，C-末端的色氨酸和N-末端的“WYGPDR”氨基酸序列起到了各單體之間的重要介導(dǎo)作用(圖5(f))，而FCP中則缺少這些序列，可能是導(dǎo)致FCP沒有形成三聚體的重要原因[20]。

圖5 硅藻FCP天線和植物L(fēng)HC天線的蛋白結(jié)構(gòu)圖：(a)～(c)分別為3種FCP的單體結(jié)構(gòu)；(d)為綠藻和植物的LHC單體天線(CP29亞基)結(jié)構(gòu)；(e)～(g)分別為硅藻FCP二聚體、植物L(fēng)HC三聚體和硅藻FCP-A四聚體的結(jié)構(gòu)示意圖。穩(wěn)定亞基聚合的氨基酸和色素等被相應(yīng)標(biāo)記出

硅藻的光系統(tǒng)II和FCP捕光天線組裝成的超級復(fù)合體更加復(fù)雜，它包含了70個蛋白亞基和500多個色素分子(圖6)。超級復(fù)合體是由2個PSII-FCPII單體組成，每個PSII-FCPⅡ單體包括1個PSII核心、2個FCP-A四聚體亞基和3個FCP單體(FCP-D/E/F)亞基。硅藻光系統(tǒng)II反應(yīng)中心核心共包括19個跨膜亞基和5個放氧亞基，其中Psb34、PsbG和Psb31是硅藻中新發(fā)現(xiàn)的3個亞基。Psb34和PsbG是跨膜蛋白，位于外圍天線和反應(yīng)中心的交界面處，幫助FCP天線四體與反應(yīng)中心的結(jié)合以及天線向反應(yīng)中心的能量傳遞。Psb31是硅藻特有的放氧亞基，位于囊腔側(cè)膜表面，起到了優(yōu)化裂解水的質(zhì)子產(chǎn)物排出的過程，進而保護水裂解催化中心(圖6)。

圖6 硅藻PSII-FCPII結(jié)構(gòu)與功能示意圖

PSII-FCPII的整體組裝與高等植物和綠藻的C2S2M2型PSII-LHCII(C：核心；S和M：與核心結(jié)合較強和較弱的LHCII)超級復(fù)合物相似：有一個四聚體FCP-A直接結(jié)合到PSII核心，被稱為ST(strongly-associated tetramer)；另一個四聚體通過FCP-D和FCP-E與核心間接結(jié)合，被稱為MT(moderately-associated tetramer)，最外圍的FCP-F結(jié)合在MT一側(cè)。與植物和綠藻的PSIILHCII的主要區(qū)別表現(xiàn)在兩個方面：一是硅藻外圍天線主要以四聚體形式組裝，不同于LHCII的三體形式；二是與PSII結(jié)合力較強的四聚體位于反應(yīng)中心的CP47一側(cè)，與PSII-LHCII中的S-LHCII相反。

另外，新發(fā)現(xiàn)的Psb34和PsbG亞基對于復(fù)合物的組裝起到了重要作用，展現(xiàn)了硅藻光系統(tǒng)II獨特的穩(wěn)定性和靈活性。其中，PsbG核心小亞基負(fù)責(zé)介導(dǎo)ST四聚體和PSII的連接，Psb34有輔助功能。另外，F(xiàn)CP-D單體天線亞基處在CP43和2個四聚體構(gòu)成的三角形中間，起到強化外圍天線的組裝穩(wěn)定性和連接外圍亞基與PSII核心的作用。硅藻進化出區(qū)別于綠色系統(tǒng)光合生物的獨特光系統(tǒng)和捕光天線的結(jié)構(gòu)，是為了更好地適應(yīng)特定的生存光環(huán)境。那晶體結(jié)構(gòu)解析的二聚體FCP亞基的位置在哪里呢？目前科學(xué)家還沒給出答案，據(jù)推測可能結(jié)合在四聚體的外圍，或者也可以直接結(jié)合在PSII核心外圍。

4 硅藻捕獲藍(lán)綠光機理

硅藻的FCP捕光天線結(jié)合了大量葉綠素a、葉綠素c、巖藻黃素、硅甲藻黃素等，捕獲的光能需要最終傳遞至反應(yīng)中心，驅(qū)動原初電荷分離以及電子傳遞鏈。其中，葉綠素a和葉綠素c除了吸收紅光外，葉綠素a還捕獲藍(lán)光(400～460 nm)，葉綠素c捕獲藍(lán)綠光(460～500 nm)，而巖藻黃素可以根據(jù)蛋白質(zhì)內(nèi)的結(jié)合環(huán)境，延伸自己的捕光能力到綠光區(qū)域(500～560 nm)。FCP天線中巖藻黃素等類胡蘿卜素的數(shù)量很高，可以達(dá)到綠藻和高等植物的LHCI/LHCII的相應(yīng)色素的兩倍，這極大強化了硅藻對藍(lán)綠光的捕獲能力。更重要的是可以根據(jù)FCP天線中的巖藻黃素結(jié)合環(huán)境，推斷某些結(jié)合在親水蛋白環(huán)境中的巖藻黃素分子因為溶劑效應(yīng)，吸收光譜紅移到藍(lán)綠光區(qū)域(圖7)，這是FCP使硅藻呈現(xiàn)紅棕色的主要原因。

圖7 硅藻、綠藻和植物捕光天線的捕光范圍

FCP天線捕獲的能量直接或者間接傳遞給光系統(tǒng)II反應(yīng)中心。能量傳遞的核心原則是由高能態(tài)的色素分子傳遞到低能態(tài)的分子。有意思的是，2個或2個以上的葉綠素分子接近形成葉綠素對，通過能量偶聯(lián)降低它們的能級，在能量傳遞中扮演了重要作用。這些能量偶聯(lián)的葉綠素對大部分處于外圍FCP天線向反應(yīng)中心傳輸能量的關(guān)鍵樞紐位置，因此可以有效調(diào)控不同光環(huán)境條件下的能量傳輸過程。另外，由它們接收的能量也可以傳遞到附近的一些類胡蘿卜素分子，在強光下幫助葉綠素清除過剩的光能，避免受到光損傷[20]。

5 結(jié)語

硅藻雙體FCP和PSII-FCPII的結(jié)構(gòu)解析，破解了硅藻光系統(tǒng)和捕光天線的分子結(jié)構(gòu)與功能之謎，向我們展示了硅藻光系統(tǒng)中獨特的色素-蛋白網(wǎng)絡(luò)，揭示了硅藻光系統(tǒng)蛋白在捕獲藍(lán)綠光、高效傳能和光保護等方面的分子機制，為后續(xù)深入研究光合系統(tǒng)的能量高效利用奠定了堅實的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是光合作用領(lǐng)域重要的科學(xué)突破。為此，美國《科學(xué)》雜志評論硅藻的光系統(tǒng)和捕光天線研究是里程碑性質(zhì)的工作[21]。該成果入選了科技部評選的“2019年度中國科學(xué)十大進展”，兩院院士評選的“2019年中國十大科技進展新聞”和中國科協(xié)生命科學(xué)學(xué)會聯(lián)合體評選的“2019年度中國生命科學(xué)十大進展”。硅藻光合作用新的分子機制也將為人工模擬光合作用機理、指導(dǎo)設(shè)計新型高光效作物、打造智能化植物工廠提供新策略和新思路，有望為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟生產(chǎn)提供新助力以及促進新產(chǎn)業(yè)的生成。