朱和權，馮 進，李春陽, ，吳承東，張 明，Chuon Mony Roth

（1.南京農業(yè)大學食品科技學院, 江蘇南京 210095；2.江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所, 江蘇南京 210014；3.鹽城市新洋農業(yè)試驗站, 江蘇鹽城 224005；4.柬埔寨農業(yè)漁業(yè)部農產品和食品實驗室, 金邊 10103）

植物多糖具有抗氧化[8]、調節(jié)免疫[9]、降血糖[10]、抗腫瘤[11]、調節(jié)腸道菌群[12]等多種藥理作用。植物多糖的提取技術有很多，除了傳統的水提醇沉法，還有酶法[13]、超聲波提取法[14]、酸提法[15]、堿提法[16]及新興的微波輔助提取法[17]和亞臨界水萃取法[18]等。超聲波法提取多糖具有效率高、提取時間短、提取溫度低以及操作簡單等優(yōu)點，Gu等[19]采用響應面法優(yōu)化了超聲波提取慈姑多糖的工藝，并發(fā)現超聲波法提取到的慈姑多糖具有良好的免疫調節(jié)活性。由于白首烏中淀粉含量較高，采用傳統水提醇沉法提取時需要加入α-淀粉酶及糖化酶處理，導致白首烏多糖得率偏低[20]。為了提高白首烏中非淀粉多糖的得率，本文根據白首烏中淀粉在較低溫度下不溶水的特性，選擇超聲波法在較低溫度下提取白首烏中非淀粉多糖，從而避免了通過α-淀粉酶-糖化酶聯用法除淀粉導致的多糖的損失。采用響應面法對超聲波提取工藝進行優(yōu)化，同時對超聲波法提取的白首烏多糖結構進行初步結構表征，為日后對白首烏多糖結構的進一步解析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白首烏粉末 鹽城果老首烏科技有限公司提供；無水乙醇，苯酚、濃硫酸、溴化鉀 為國產分析純；單糖標準品（巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸）及葡聚糖系列標準品 Sigma公司。

L3-5K臺式低速離心機 湖南可成儀器設備有限公司；EU-2600R紫外可見分光光度計 上海昂拉儀器有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；RE-52AA型真空減壓旋轉蒸發(fā)儀、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；KQ-400DE數控超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白首烏多糖的提取 稱取100 g白首烏超微粉末于燒杯中以蒸餾水作為提取溶劑，按照一定液料比、超聲功率、超聲溫度及超聲時間進行提取，提取結束后，將提取液倒入離心杯中，以4000 r/min的轉速離心10 min。將上清液轉入旋蒸瓶，旋轉蒸發(fā)至1/4體積，隨后采用Sevag法[21]除蛋白，加入4倍體積的無水乙醇置于4 ℃條件下過夜醇沉。將醇沉液于4000 r/min離心10 min，棄去上清液，將沉淀用80%的乙醇洗滌三次，最后用去離子水將沉淀復溶，透析48 h后凍干，得白首烏多糖。

1.2.2 單因素實驗 按照1.2.1中的提取方法，實驗基本條件定為：液料比20:1 mL/g，超聲時間40 min，超聲功率300 W和超聲溫度40 ℃。因素實驗條件為液料比（10:1、15:1、20:1、25:1、30:1 mL/g）、超聲時間（20、30、40、50、60 min）、超聲功率（200、250、300、350、400 W）和超聲溫度（20、30、40、50、60 ℃），分別考察液料比、超聲時間、超聲功率和超聲溫度對白首烏多糖得率得影響。

1.2.3 響應面優(yōu)化試驗設計 在單因素實驗結果的基礎上采用Box-Benhnken的中心組合設計對超聲輔助提取白首烏多糖工藝進行優(yōu)化，響應面優(yōu)化試驗因素和水平表見表1。根據響應面優(yōu)化設計試驗結果進行驗證實驗，并比較預測多糖得率與實際多糖得率。

表1 響應面分析試驗因素及水平表設計Table 1 Independent variable and their levels of response surface methodology

1.2.4 白首烏多糖含量得測定 采用硫酸-苯酚法[22]檢測粗多糖中多糖含量，繪制得葡萄糖標準曲線為Y=15.65x-0.00742（其中Y為吸光度，A；x為葡萄糖濃度，mg/mL），R2=0.9998，按照公式（1）計算多糖得率：

劉訓峰在講話中表示，與臨港的戰(zhàn)略合作是國資聯手開發(fā)桃浦智創(chuàng)城的新起點、新篇章，也是雙方開啟未來合作的新契機，未來將繼續(xù)加強良性互動，實現共同發(fā)展。

式中，y：超聲波提取多糖得率，%；C：由標曲計算所得多糖濃度，mg/mL；V：定容體積，mL；N：稀釋倍數；m：測定所用得粗多糖質量，mg；M：粗多糖質量，g；W：提取用白首烏粉末質量，g。

1.2.5 白首烏多糖的理化性質研究

1.2.5.1 白首烏多糖的單糖組成測定 白首烏多糖的單糖組成的測定采用離子色譜法（IC）[23]。取干凈的色譜瓶，稱量多糖樣品5 mg，加入配制好的2 mol/L三氟乙酸（TFA）溶液，121 ℃加熱2 h。通氮氣，吹干。加入甲醇清洗，再吹干，重復甲醇清洗2～3次。加入無菌水溶解，過0.22 μm微孔過濾膜后，供進樣分析。

儀器配置及檢測條件：Thermo ICS5000+離子色譜系統，電化學檢測器，CarboPac PA20液相色譜柱；淋洗程序：0.1 mol/L NaOH 淋洗液，0.5 mL/min流速。

1.2.5.2 白首烏多糖的分子量分布測定 白首烏多糖的分子量分布使用高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）測定[24]。將樣品充分溶解于流動相中，用微孔過濾膜過濾后供進樣。以葡聚糖標準品（Mw180、Mw2700、Mw9750、Mw36800、Mw135350）制作校正曲線。校正曲線為lgMw=-0.2679tR+10.8092 ，其中Mw為標準樣品的平均相對分子量，tR為保留時間（min），R2=0.9956。

儀器配置及檢測條件儀器：Waters1525 高效液相色譜儀（2414示差折光檢測器和Empower3工作站），Ultrahydrogel? Linear 300 mm×7.8 mm×2 μm色譜柱；淋洗程序：0.1 mol/L NaNO3淋洗液，流速為0.9 mL/min。

1.2.5.3 白首烏多糖的紅外光譜測定 取2 mg干燥樣品與200 mg KBr混合并研細均勻，壓成薄片，傅里葉紅外光譜儀在4000～400 cm-1進行紅外光譜掃描。

1.2.5.4 白首烏多糖溶解度測定 白首烏多糖的溶解度測定參考Huang等[25]的方法。稱取500 mg的白首烏多糖樣品，溶解于5 mL蒸餾水中并且在常溫下攪拌6 h，隨后在3000 r/min轉速下離心10 min，計算上清液體積，收集沉淀并烘至恒重，實驗重復3次。白首烏多糖的溶解度根據公式（2）計算：

式中，y：白首烏多糖的溶解度，mg/mL；M：多糖樣品質量，mg；m：烘干后沉淀質量，mg；V：上清液的體積，mL。

1.3 數據處理

單因素實驗數據分析及顯著性檢驗采用Origin9.6軟件進行分析，響應面優(yōu)化實驗采用Design-Expert 8.0.6軟件進行設計及結果與方差分析，顯著水平P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 液料比對超聲波輔助提取白首烏多糖得率的影響 由圖1可知，隨著液料比的增加，白首烏多糖得率逐漸升高，當液料比為20:1 mL/g時，白首烏多糖得率最高，此時多糖得率為1.14%。這是因為，當液料比較低時，溶劑與樣品接觸不充分從而導致提取不徹底。隨著液料比的繼續(xù)增加，多糖的得率呈下降趨勢，這可能是因為隨著液料比的增加使隨后的料液的分離濃縮操作難度增加，導致多糖的損失增加。因此選擇液料比20:1 mL/g。

圖1 液料比對白首烏多糖得率的影響Fig.1 Effect of solvent to material ratio on extraction yield of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.1.2 超聲時間對超聲波輔助提取白首烏多糖得率的影響 由圖2可知，隨著超聲時間的增加，白首烏多糖得率逐漸升高，當超聲時間為40 min時，白首烏多糖得率最高，此時多糖得率為1.25%。這是因為，隨著時間的增加，多糖得率增加，當超聲時間為40 min時，多糖已經基本溶出，此時多糖得率為1.25%。隨著超聲時間的繼續(xù)增加，不會提高白首烏多糖的得率，反而使部分小分子多糖降解，導致得率下降[26]。因此選擇超聲時間40 min。

圖2 超聲時間對白首烏多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.1.3 超聲功率對超聲波輔助提取白首烏多糖得率的影響 由圖3可知，隨著超聲功率的增加，白首烏多糖得率逐漸升高，當超聲功率為350 W時，白首烏多糖得率最高，此時多糖得率為1.27%。這是因為隨著超聲波產生的空穴效應和震動利于多糖的溶解。隨著超聲功率的繼續(xù)增加，多糖得率呈下降趨勢，這是因為過高的超聲波功率會導致多糖的降解[27]，因此選擇超聲功率350 W。

圖3 超聲功率對白首烏多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction yield of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.1.4 超聲溫度對超聲波輔助提取白首烏多糖得率的影響 由圖4可知，隨著超聲溫度的增加，白首烏多糖得率逐漸升高，當超聲溫度為50 ℃時，多糖得率最高為1.29%，這是因為溫度的升高可以提高多糖的溶解度。隨著超聲溫度的繼續(xù)升高，多糖得率開始下降，這是因為當溫度達到60 ℃時，有部分水溶性淀粉隨多糖一起溶解，需要對提取液做去淀粉處理，在去淀粉的過程中導致白首烏多糖的損失。因此選擇超聲溫度50 ℃。

圖4 超聲溫度對白首烏多糖得率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction yield of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.2 響應面優(yōu)化試驗優(yōu)化

2.2.1 響應面試驗結果 在單因素實驗結果的基礎上，根據Box-Behnken的中心組合原理設計了29組實驗，結果見表2。試驗結果使用Design-Expert 8.0.6軟件進行擬合分析。

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 對白首烏多糖得率的響應面試驗結果進行回歸分析，結果見表3。對四個因素進行回歸擬合后得到回歸方程：Y=1.31+0.12A+0.23B-0.11C+0.055D+0.12AB+0.10AC+0.080AD+0.045BC+0.052BD+0.098CD-0.21A2-0.39B2-0.21C2-0.33D2。由方差分析可知，校正系數R2=0.9796,R2Adj=0.9592；模型的P值小于0.0001，為極顯著；失擬項P值大于0.05，不顯著。這說明模型擬合度較好，說明實驗的二次模型擬合度較高，可正確反映個因素與響應值之間的變化關系。由模型的方差分析可得出液料比與超聲溫度交互項（AD）對響應值有顯著影響（P＜0.05），而液料比（A）、超聲時間（B）、超聲功率（C）、超聲溫度（D）、液料比與超聲時間交互項（AB）、液料比與超聲功率交互項（AC）、超聲功率與超聲溫度交互項（CD）及各因素的二次項對響應值具有極顯著影響（P＜0.01）。各因素對響應值的影響顯著性排序為B＞A＞C＞D。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface method design and test results

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

兩因素之間交互作用的響應面圖見圖5。兩個因素之間的交互作用可以通過響應面表示出來，兩因素交互項的三維圖越陡峭，等高線呈橢圓則表明這兩個因素的交互項對響應值的影響越顯著。圖中三維圖的陡峭順序為AB＞AC＞CD＞AD＞BD＞BC，即液料比與超聲時間交互項、液料比與超聲功率交互項、超聲功率與超聲溫度交互項以及液料比與超聲溫度交互項三維圖最陡峭，表明超聲時間與液料比之間的交互作用、液料比與超聲功率之間的交互作用、超聲功率與超聲溫度之間的交互作用以及液料比與超聲溫度之間的交互作用對白首烏多糖得率的影響顯著；從等高線來，BC與BD的等高線接近圓形，表明超聲時間與超聲功率之間的交互作用及超聲時間與超聲溫度之間的交互作用對白首烏多糖得率的影響不顯著（P＞0.05），這與模型的方差分析相一致。

2.2.3 驗證實驗 經Design-Expert8.0.6預測模型極值點，結果顯示最佳提取條件：液料比21.96:1 mL/g、超聲時間為43.63 min、超聲功率為345.53 W、超聲溫度為51.45 ℃。在此最佳提取條件下白首烏多糖得率為1.39%。根據實際操作設計驗證實驗，其提取條件為：液料比為22:1 mL/g、超聲時間為44 min、超聲功率為350 W及超聲溫度為52 ℃，按此提取條件進行3次平行實驗，實驗結果為在此條件下的多糖得率為1.35%±0.02%，驗證實驗結果與預測值的誤差為2.88%，誤差較小，表明該模型擬合度良好，對超聲波法提取白首烏多糖的工藝優(yōu)化合理、有效。

圖5 兩因素的交互作用對白首烏多糖得率的響應面圖Fig.5 Response surface plots of variable parameters on extraction yield of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.3 白首烏多糖表征

2.3.1 單糖組成結果分析 由圖6和圖7可知，白首烏多糖由巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸以及葡萄糖醛酸組成，其含量分別為0.17%、1.66%、7.40%、10.51%、74.41%、0.79%、0.85%、0.36%、3.28%、0.57%。由白首烏多糖的單糖組成數據可以得出該多糖中葡萄糖含量最高，說明白首烏多糖的主要組成為葡聚糖，這對其結構解析具有一定的參考價值。

圖6 單糖標準品的離子色譜圖Fig.6 Ion chromatography of complex standard monosaccharides and uronic acids

圖7 白首烏多糖的單糖分析離子色譜圖Fig.7 Ion chromatography of of monosaccharide in polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.3.2 分子量測定結果分析 由圖8和表4可知超聲波法提取的白首烏多糖分子量分布狀況，其重均分子量主要集中在1.71×107、1.15×106、5.93×104Da，其多分散系數分別為1.40、1.55、1.65，峰面積比為14.28%、21.18%、64.54%。

2.3.3 白首烏多糖紅外光譜分析 如圖9所示，白首烏多糖在3297 cm-1左右處有一處較寬的吸收峰，該峰是由O-H伸縮振動引起的，在2915 cm-1處出現的吸收峰是由C-H伸縮振動引起的。這兩個峰為多糖的特征峰。在1645 cm-1處出現的峰則是由-COOH伸縮振動引起的，說明白首烏多糖中存在-COOH，這一點與白首烏多糖的單糖組成測定結果一致[28]。此外在1200～950 cm-1處出現的一組較強的吸收峰是吡喃糖環(huán)上的醚鍵（C-O-C）的伸縮振動及羥基O-H變角振動引起的[29]。在850 cm-1處的吸收峰為β-吡喃糖苷鍵的特征吸收峰[30]。紅外光譜掃描結果顯示白首烏多糖中含有β構型的吡喃糖，同時白首烏多糖中含有一定的糖醛酸，這與其單糖組成測定結果一致。

圖8 白首烏多糖相對分子量分布的高效液相色譜圖Fig.8 HPLC sepectrum of relative molecular weight of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

表4 白首烏多糖分子量分布Table 4 Molecular weight distribution of Cynanchum auriculatum Royle ex Wight polysaccharide

圖9 白首烏多糖的紅外吸收光譜圖Fig.9 FTIR spectra of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.3.4 白首烏多糖溶解度的測定 實驗結果顯示白首烏多糖的溶解度為（25.89±0.36）mg/mL，具有較好的溶解度。這可能是因為白首烏多糖中低分子量組分比較多從而使其具有良好的溶解度[31]。多糖的溶解度在功能性食品加工中具有重要的意義。可以考慮將其加入到飲料中，做成低端消費品，也可以將其加入到高端的功能性食品，提高其附加值。

3 結論

采用超聲輔助提取白首烏多糖，在單因素實驗的基礎上以響應面法優(yōu)化提取工藝，結果表明：模型擬合度較好，實驗的二次模型擬合度較高，四個因素對多糖提取量影響順序為超聲時間（B）＞液料比（A）＞超聲功率（C）＞超聲溫度（D），超聲輔助提取白首烏多糖的最佳提取工藝參數為：液料比22:1 mL/g、超聲時間為44 min、超聲功率為350 W及超聲溫度為52 ℃，此時多糖得率為1.35%±0.02%。白首烏多糖結構表征結果表明：白首烏多糖由巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸以及葡萄糖醛酸組成，重均分子量主要集中在1.71×107、1.15×106、5.93×104Da，具有一般多糖紅外光譜吸收峰以及良好的溶解性，為白首烏多糖結構解析及工業(yè)應用提供依據。