程艷，劉杰,2,*，蔣萍萍,2，俞果,2，蔣旭升，丁志凡，雷玲，張冰

1. 桂林理工大學，廣西環(huán)境污染控制理論與技術重點實驗室，桂林 541004

2. 自然資源部南方石山地區(qū)礦山地質環(huán)境修復工程技術創(chuàng)新中心，桂林 541004

重金屬Cd與Hg、As、Cr、Pb被稱為“五毒元素”，廣泛存在于巖石、土壤及沉積物中[1-2]?！度珖寥牢廴緺顩r調查公報》顯示，Cd在所有重金屬污染物中超標率最高，被認為是土壤環(huán)境中危害最大的污染物之一[3]。土壤Cd污染是影響作物的生長和農產品安全生產的重要原因[4]。當Cd在植物體內積累到一定濃度時，會對植物產生毒害作用，導致其生長受到抑制，主要表現為葉片褪綠、植株矮小、產量下降甚至死亡等癥狀[5-6]。Cd會使植物的膜透性增加，進而使膜系統(tǒng)受到損傷，植物體內的丙二醛(MDA)含量會增加，葉綠素降低[7-9]。葛依立等[10]研究發(fā)現，水蓼(PolygonumhydropiperL.)生物量和葉綠素含量隨Cd處理濃度升高而顯著降低。目前，尋找緩解Cd毒害的方法，降低Cd的生態(tài)風險，已成為生態(tài)環(huán)境領域的研究熱點。

Mn是植物與人類正常生長發(fā)育的必需微量元素之一，也是植物維持葉綠體結構重要元素[11-12]。研究表明，Mn能夠影響Cd的生理代謝活動，并緩解Cd對植物的毒性效應[13]。在水稻(OryzasativaL.)中，施加Mn可緩解Cd的毒性，降低植物對Cd的吸收和積累[14]，在超富集植物美洲商陸(PhytolaccaamericanaL.)和富集植物白羽扇豆(Lupinusanbus)中，均發(fā)現Mn能有效緩解Cd的毒性[15-16]。在水培實驗中，Mn顯著降低了Cd在超富集植物青葙中的生物累積性[17]。施加Mn2+抑制了黑麥草(LoliumperenneL.)根系對Cd的吸收[18]，大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)中，施加Mn2+可以抑制Cd2+從根向芽的吸收轉移[19]。對玉米增加Mn供應可抑制Cd的吸收，從而緩解Cd對玉米的毒害[20]。另外，在豇豆(Vignaunguiculata(Linn.) Walp)中發(fā)現，MDA隨著Cd濃度的增加而增加，說明膜結構嚴重受損，且葉綠素隨著濃度的增加而減少，在Cd暴露下施加Mn，MDA的濃度降低，且豇豆的葉綠素顯著增加，推測Mn2+和Cd2+在豇豆體內存在拮抗作用[21]。然而，也有研究表明，施加過量的Mn增加了油菜根部和地上部的Cd含量[22]。在水培條件下，Mn顯著增加水稻對Cd的積累[23]。這說明，Mn緩解植物Cd毒性的機理尚不清楚，因此，研究Mn對植物Cd毒害的緩解效應和機制十分必要。

青葙是近期發(fā)現的一種可同時超富集Cd和Mn的植物[24]。前期研究發(fā)現，Mn顯著影響青葙對Cd的積累和耐受性，但作用機制尚不明確[17]。本文通過水培實驗研究了不同濃度的Mn對Cd脅迫下青葙的生長、Cd吸收和生理的影響，以期為闡明Mn緩解青葙Cd毒性的效應和機制奠定基礎，為Cd和Mn復合污染土壤的植物修復提供理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 植物培養(yǎng)

青葙種子采集于廣西壯族自治區(qū)桂林市陽朔縣。將青葙種子采用體積分數為1%的H2O2溶液浸泡消毒后，選取顆粒飽滿的種子播種于育苗盤中，置于溫室中培養(yǎng)并且保持溫室溫度在25～30 ℃，光照時間為14 h。在育苗托盤內培育至約5～6 cm高，4～6片真葉時挑選生長一致的幼苗分別栽進裝有1/2Hoagland營養(yǎng)液(由購買的全營養(yǎng)液配制)的1 L塑料燒杯中，分2批進行培養(yǎng)，每5天更換營養(yǎng)液一次，置于溫室中培養(yǎng)。第1批只用1/2Hoagland營養(yǎng)液進行培養(yǎng)，植物種植2周后測定青葙根部Cd2+流速。第2批進行Cd和Mn處理，Mn和Cd以MnCl2·4H2O和CdCl2·2.5H2O的形式加入營養(yǎng)液中混合均勻配制成水溶液，其中，含Mn濃度(Hoagland溶液中Mn的濃度)為5、100和1 000 μmol·L-1，含Cd濃度為0、5和25 μmol·L-1。每處理3個重復，植物生長3周后收獲，用于測定Cd、葉綠素和MDA的含量。

1.2 葉綠素含量的測定

稱取青葙新鮮葉片0.2 g，加入2～3 mL體積分數為95%的乙醇，研磨成勻漿，再加入乙醇10 mL，繼續(xù)研磨，靜置3～5 min，以4 000 r·min-1的轉速離心10 min，上清液在紫外可見分光光度計(UV-5800PC Spectrophotometer，上海元析，中國)上于649 nm和665 nm這2個波長下測定吸光度(A)，葉綠素含量按以下公式計算：葉綠素a(Ca)=13.95A665-6.88A649，葉綠素b(Cb)=24.96A649-7.32A665[25]。

1.3 MDA含量的測定

采用硫代巴比妥酸(TBA)法，稱取青葙新鮮葉片0.2 g，加入1 mL體積分數為5%的三氯乙酸(TCA)研磨。勻漿在9 600 r·min-1下室溫離心15 min，保留上清液。然后吸取2 mL上清液，加入2 mL體積分數為0.5%的TBA(溶解在體積分數為20%的TCA中)，混合均勻后在96 ℃下(水浴)保溫25 min，然后放到冰浴上迅速冷卻，把冷卻之后的混合液在12 000 g離心5 min，600、532和450 nm波長下測得上清液的吸光度。MDA含量采用公式C(mol·L-1) =6.45(A532-A600)-0.56A450[25]計算。

1.4 Cd含量測定

青葙收獲后分為根、莖和葉三部分，用自來水先把根、莖和葉表面的灰塵洗凈，隨后用去離子水沖洗3次，置于烘箱中105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干至恒重后用電子天平測其干重。烘至恒重后的葉、莖和根于植物粉碎機中粉碎，粉碎后的樣品(約0.2 g)采用HNO3+HCLO4進行消解，Cd含量采用電感耦合等離子體光譜儀(PerkinElmer Optima 7000 DV，美國PerkinElmer公司)進行測定。

1.5 植物根部不同區(qū)域的Cd2+流速測定

利用非損傷微測系統(tǒng)(Non-invasive Micro-test Technology, NMT)完成。以非損傷性掃描離子選擇電極術獲取進出青葙根系的Cd2+離子濃度(mmol·L-1級)、流速及流向信息。離子選擇性電極由玻璃微電極、Ag/AgCl導線、電解質及液態(tài)離子交換劑(LIX)組成。本實驗所用微電極均為美國揚格公司提供。Cd2+選擇性微電極前端灌充4～5 μm Cd2+離子的液態(tài)交換劑液柱，后端灌充有1 cm左右的電解液柱(10 mmol·L-1Cd(NO3)2·4H2O)，將電極固定器上的Ag/AgCl絲從電極后面插入，使其與電解液接觸。固體電極作為參比電極。玻璃微電極需要校正后使用，校正液中Cd2+的濃度分別設置為0.5 mmol·L-1和0.05 mmol·L-1，其他成分與測試液相同。幼苗在測量前10 min轉移到裝有測試液(0.1 mmol·L-1CdCl2、0.1 mmol·L-1KCl和0.3 mmol·L-12-嗎啉乙磺酸(MES)，pH值5.8)的測試盒中平衡。測試時，將幼苗根系置于測試液中，用濾紙條將測試部位固定，再用樹脂塊壓好。測量區(qū)域是位于距離根尖200、800和1 600 μm的位置(圖1)。將植物放入測試盒中平衡10 min之后測定Cd離子流速，數據穩(wěn)定后，用移液管將不同量MnCl2·4H2O的儲備液依次加入測試盒中，得到最終Mn濃度為0、10和50 μmol·L-1，記錄瞬時Cd2+流速，直到分別達到10 min的穩(wěn)態(tài)Cd2+流速的2點電壓差。每個處理測量至少6次。

圖1 在距根尖200、800和1 600 μm的位置測量青葙根系的Cd2+流速

1.6 數據處理與分析

所有數據均采用單因素方差分析和鄧肯檢驗進行統(tǒng)計學分析，用SPSS20.0軟件分析2種分析方法的顯著性差異(P<0.05)。采用Excel軟件和Origin8.0進行統(tǒng)計分析作圖，每個處理重復3次。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 Cd毒害下施用Mn對青葙生長的影響

在Mn處理為5 μmol·L-1時，施加Cd濃度為0、5和25 μmol·L-1時，青葙根、莖和葉干重隨Cd濃度增加而減少。在Cd濃度為5 μmol·L-1時，施加1 000 μmol·L-1的Mn，青葙的根、莖和葉干重和總干重分別比5 μmol·L-1的Mn增加了76%、83%、55%和63%。在高Cd濃度(25 μmol·L-1)處理組，施加Mn后，青葙根、莖和葉干重和總干重都顯著增加(圖2)。在高Cd濃度處理下，施加Mn可以減輕毒害效用，可增加植株高度，減輕黃化現象(圖3)。在5 μmol·L-1和25 μmol·L-1Cd處理組中，施加Mn(1 000 μmol·L-1)后，總葉綠素顯著增加(圖4)。在Cd處理為5 μmol·L-1，Mn處理為1 000 μmol·L-1時，葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素分別比5 μmol·L-1的Mn處理增加了1.66倍、1.60倍和1.63倍，隨著Cd處理濃度的升高，MDA含量呈上升趨勢，在Cd處理為25 μmol·L-1時達到最大值，比對照增加了1.22倍，但是當在Cd濃度分別為5 μmol·L-1和25 μmol·L-1時，施加Mn濃度為100 μmol·L-1和1 000 μmol·L-1時，MDA含量較施加Mn濃度5 μmol·L-1時顯著降低(圖5)。但是施加高濃度的Mn降低效果較低濃度差，這可能因為Mn也是重金屬，過量的Mn也會對植物造成影響。結果表明，在Cd毒害作用下，施加一定濃度的Mn能緩解Cd的毒性，從而促進青葙的生長。

圖5 Mn對不同Cd濃度脅迫下青葙葉片丙二醛(MDA)含量的影響

圖4 Mn對不同Cd濃度脅迫下青葙葉片中葉綠素含量的影響

圖3 不同Mn濃度對Cd脅迫下青葙生長的影響

圖2 Mn對不同Cd濃度脅迫下青葙根、莖、葉和總干重的影響

2.2 Mn對青葙Cd含量的影響

由圖6可知，施加5 μmol·L-1的Mn時，隨著Cd處理濃度的增加，青葙葉、莖和根的Cd含量也隨之增加。在Cd處理為25 μmol·L-1、Mn處理為1 000μmol·L-1時，青葙莖和根的Cd含量顯著降低，分別較施加5 μmol·L-1的Mn處理降低41.4%和41.5%。Cd處理濃度為5 μmol·L-1時，施加不同濃度的Mn均使根的Cd含量顯著減低，在青葙葉片中，Cd處理濃度為5 μmol·L-1和25 μmol·L-1時，施加100 μmol·L-1的Mn時，葉中的Cd含量分別降低了4.4%和8.2%。且Cd處理濃度分別為5 μmol·L-1和25 μmol·L-1、施加1 000 μmol·L-1Mn時，青葙葉中Cd含量顯著降低。但施加100 μmol·L-1的Mn處理組與施加5 μmol·L-1的Mn處理組相比并無顯著差異。結果表明，在水培條件下，通過外源施加Mn會抑制青葙對Cd的吸收和積累，從而緩解Cd對青葙的毒害作用。

圖6 Mn對不同Cd濃度脅迫下青葙根、莖和葉Cd含量的影響

2.3 Mn對青葙根部不同區(qū)域Cd2+流速的影響

根系是植物吸收營養(yǎng)和水分的主要器官，在Cd環(huán)境下，根系不同部位的Cd2+流速存在差異。利用非損傷微測系統(tǒng)(NMT)，在距根尖200、800和1 600 μm處測定了青葙根系的Cd2+流速。流速為正值表示Cd2+從根部流出，為負值表示Cd2+流入根部。

結果表明，未施加Mn時在距根尖200 μm處Cd2+顯示為內流，當在測試時加入不同濃度的Mn均不同程度地抑制了Cd2+的內流，然而，10 μmol·L-1Mn處理組的Cd2+進入根系的速率明顯高于50 μmol·L-1Mn處理組的Cd2+流速。在加入Mn濃度為50 μmol·L-1時，Cd2+內流受到嚴重抑制，此時施加Mn對Cd2+流速的最大抑制率為71.4%(圖7(a))；平均Cd2+流速表明，施加Mn顯著抑制了根表面的Cd2+流速，此外，這種抑制作用依賴于Mn供應的濃度，在Mn施加濃度為10 μmol·L-1和50 μmol·L-1時，Cd2+的平均速率分別下降14.9%和61.1%(圖7(b))。

距根尖800 μm的測定結果與距根尖200 μm類似，未施加Mn時Cd2+顯示為內流，但距根尖800 μm的內流較距根尖200 μm慢。在測試時隨著加入Mn濃度的增加，抑制作用也增加(圖7(c))；當施加50 μmol·L-1的Mn時，Cd2+的最大抑制率為91.6%，平均Cd2+流速表明，Mn對Cd的抑制作用較不施加Mn增加了13倍(圖7(d))，說明加入Mn可抑制Cd2+在根部的吸收速率。

距根尖1 600 μm處未施加Mn時Cd2+均呈現為內流。在測試時加Mn后Cd2+內流受到抑制，在加入10 μmol·L-1和50 μmol·L-1的Mn時最大抑制率分別為74.1%和98.7%(圖7(e))；平均Cd2+流速表明，施加10 μmol·L-1和50 μmol·L-1的Mn的抑制作用分別比未施加的增加了2倍和4.3倍(圖7(f))。由此可見，施加不同濃度的Mn均能抑制青葙根系中Cd2+的內流。這說明Mn對Cd的毒性緩解作用與物質的量濃度比有關。

圖7 Mn對青葙根部不同區(qū)域Cd2+流速的影響

3 討論(Discussion)

Cd對植物的毒害作用表現為生長受到抑制，生物量下降[26]。Mn是植物生長發(fā)育必需的微量元素[12, 27]。目前多數研究結果認為，Mn的添加可緩解Cd的脅迫效應。鐘闈楨[28]的研究表明，Mn和Cd共同作用較Cd單獨作用能增加玉米和甘蔗的葉綠素。Zornoza等[16]發(fā)現，提高Mn供應水平可顯著緩解白羽扇豆(LupinusalbusL.)的Cd毒害癥狀。Mn對Cd毒性的緩解效應在超富集植物中也普遍存在。在Mn超富集植物商陸(PhytolaccaacinosaRoxb)和美洲商陸(PhytolaccaAmericanaL.)中均發(fā)現，植物對Mn的積累均有利于提高對Cd的耐受性[15, 27]，且Mn對Cd的毒性緩解作用與二者物質的量濃度比有關[24]。這與本研究結果一致，盡管Cd處理顯著抑制青葙的生長，但提高Mn供應水平卻顯著增加了青葙根、莖和葉的生物量(圖3)。另外，隨著Mn的加入，青葙受Cd毒害作用的黃化現象也有所減輕，葉綠素含量隨之增加(圖4)。

Mn緩解Cd對青葙的毒害作用可能與Mn減少Cd的積累有關。本研究發(fā)現，提高Mn的供應量可顯著降低青葙根、莖和葉中的Cd含量(圖6)，從而緩解Cd對青葙的毒害作用(圖6)。這一發(fā)現可能與Mn抑制根系Cd吸收有關，Cd和Mn之間的競爭可能是由于Cd共享Mn傳輸系統(tǒng)的一部分。由于Cd與Mn相似有物理和化學性質，Socha和Guerinot[29]研究發(fā)現，Cd和Mn在植物里的吸收和運輸可能使用相同的途徑。這說明二者之間存在競爭性抑制關系。因此，推測Mn對緩解青葙的Cd毒性具有重要作用。在本實驗中，在Cd濃度為25 μmol·L-1、Mn濃度為1 000 μmol·L-1時，青葙莖和根的Cd含量顯著降低，分別較施加5 μmol·L-1的Mn處理組降低41.4%和41.5%。這與前人的研究結果一致，在Cd存在下，向溶液中添加Mn可顯著促進植株生長，降低植株各器官中Cd的含量[15]。同樣，Ramos等[30]報道了在Cd和Mn處理下萵苣葉綠體中有大量的Mn積累，卻沒有明顯Cd中毒的癥狀，表明Mn的供應減輕了Cd對萵苣的毒害作用。且非損傷微測技術分析結果顯示，向測定溶液中添加Mn抑制了Cd2+進入根系的流速(圖7)。且在青葙距根尖200 μm處抑制效果最明顯，當施加50 μmol·L-1的Mn時，抑制作用明顯增強，這主要是由于距根尖200 μm處是分裂產生新細胞的主要地方。Wu等[31]也有類似的發(fā)現，Zn的供應顯著降低了小白菜根部的Cd2+流速。離子流速結果直觀反映Mn可抑制青葙對Cd的吸收，從而緩解Cd對青葙的毒害作用。另外，Mn緩解Cd毒性的原因可能是二者在競爭相同的轉運蛋白，定位于質膜上的ZIP家族的轉運蛋白PsIRT1和定位于液泡上的NRAMP家族的轉運蛋白AtNRAMP3被證明能夠同時轉運Mn和Cd[29]。前人的研究結果表明，NRAMP5是水稻吸收Mn和Cd的主要轉運體[32]。徐莜等[14]研究發(fā)現，在Mn和Cd共存的條件下，Mn2+通過優(yōu)先結合細胞膜上的載體蛋白和通道蛋白對Cd2+產生拮抗作用，從而抑制Cd2+的跨膜運輸，減少根系細胞胞液中的Cd含量和向地上部的轉運量，緩解Cd2+的生理毒害作用。

在青葙Cd含量沒有顯著下降的情況下，Mn仍然降低了Cd的毒性。例如，在低Mn處理(100 μmol·L-1)時，青葙體內Cd含量并沒有顯著減少，但是植物葉綠素含量和干重均較對照有顯著增加。Mn抑制青葙對Cd的積累并不能完全解釋Mn對Cd毒性的緩解作用。這表明，Mn在緩解青葙Cd毒性時還存在其他的作用機制。本研究發(fā)現，在Cd處理組中同時施加不同濃度Mn處理，MDA含量均比單獨施加Cd降低(圖5)。這說明，Mn供應可能引導青葙體內抗氧化酶系統(tǒng)啟動，從而減輕了體內的氧自由基濃度。因此，Mn有效激活抗氧化防御系統(tǒng)，這可能是另一個緩解青葙Cd毒性的積極生理作用機制[20]，前人報道了Cd脅迫下，Mn供應水平的增加改善了Phytolaccaacinosa的脂質過氧化、水分吸收和光合作用[28]。Mn的供應顯著增強了谷胱甘肽(GSH)、植物絡合素(PCs)和非蛋白硫醇等非酶類抗氧化物的合成[33]。這些化合物在植物中Cd的絡合和解毒過程中起著重要作用[34]。然而，是酶類氧化系統(tǒng)還是非酶類抗氧化系統(tǒng)在Mn緩解Cd毒性中起主導作用，尚需進一步的研究。

綜上所述，施加Mn顯著增加了Cd脅迫下青葙的生物量和葉綠素含量，表明提高Mn的供應水平可有效緩解Cd對青葙的毒性效應。Mn對Cd毒性的緩解作用可以歸因于2個方面：(1)通過競爭相同轉運體系，減少Cd的吸收和積累；(2)提高抗氧化系統(tǒng)的防御，減少Cd的脂質過氧化傷害。