張 衡，吳 虹,卜妍紅，孫明慧，鄧 然，王 言，王夢蝶，王榮慧，吳 歡

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2. 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥研究與開發(fā)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 (rheumatoid arthritis，RA) 是一種慢性、系統(tǒng)性自身免疫疾病，病理特征為慢性滑膜炎性增生、侵蝕性血管翳形成及關(guān)節(jié)軟骨退化等[1]。中藥牛膝為莧科植物牛膝 (achyranthes bidentata BI) 的干燥根[2]，主要含有皂苷、植物甾酮以及糖類等成分，其主要有效成分牛膝總皂苷 (achyranthes bidentate saponins, ABS) 為五環(huán)三萜類化合物，具有抗炎鎮(zhèn)痛，抗腫瘤以及調(diào)節(jié)免疫等作用[3]，對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松等疾病具有良好的治療作用[4]。

微透析技術(shù) (microdialysis，MD) 是一種實(shí)時(shí)在體微量取樣技術(shù)，能針對靶部位細(xì)胞外液中的化合物 (包括內(nèi)源性、外源性) 進(jìn)行連續(xù)在體的取樣。MD技術(shù)采集到的樣品由于通過透析膜，生物大分子無法通過，可直接用于分析檢測而無需預(yù)處理[5]。本研究將MD探針植入AA大鼠關(guān)節(jié)腔采樣，結(jié)合UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)尋找并鑒定與RA相關(guān)的生物標(biāo)志物，解析可能的代謝途徑，從代謝組學(xué)角度闡明ABS干預(yù)RA的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物健康的SD大鼠,♂，體質(zhì)量(180-220) g，SPF級，許可證號SCXK (魯) 20190003，購于安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，在恒溫 (24 ℃)、自然光暗周期和自由飲水條件下飼養(yǎng)1周，待其適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥材與試劑牛膝藥材購自同仁堂，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室劉守金教授鑒定為懷牛膝；弗氏完全佐劑(FCA) (F5881)；乙醇(TEDIA公司，色譜純)；甲酸(阿拉丁公司，色譜純)；乙腈(批號：106246，美國Fisher公司，色譜純)。

1.3 儀器KQ-200KDB 型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司) ；SYZ-C石英第二沸騰高純水蒸餾器 (杰瑞爾電氣有限公司，中國) ；微透析灌注泵 CMA400 (瑞典CMA公司) ；微透析灌注器Ms-gan250、微透析收集器CMA470 (瑞典CMA公司) ；微透析探針 (MAB 6.14.4.C，膜長10 mm，直徑0.6 mm, 截留分子量15 kDa) ；YLS-7C型足趾容積測量儀 (北京凱輝盛達(dá)科技發(fā)展有限公司) ；Waters Acquity UPLC超高效液相色譜系統(tǒng) (Waters Corporation，美國) ；Waters QTOF 高分辨率飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 (Waters Corporation，美國) ；ME204電子天平 (瑞士METTLE TOLEDO公司)。

1.4 SD大鼠分組隨機(jī)把SD大鼠分成空白對照組、ABS組 (60 mg·kg-1) 及AA模型組，每組6只，除對照組外，大鼠右后足均用FCA (0.1 mL) 注射，建立AA大鼠模型，對照組注射同體積生理鹽水，造模成功d 1 (致炎d 17)后ABS組連續(xù)灌胃給藥7 d，每日1次，模型組及對照組用同體積的生理鹽水灌胃。

1.5 ABS的提取與定量測定懷牛膝樣品粉碎成均勻粉末，稱取100 g，放入圓底燒瓶 (2 L) 加入1 L乙醇加熱回流提取3次，1 h/次，合并提取液，70 ℃水浴旋蒸濃縮至無醇味，剩余提取液加入純水定容至1 L，超聲10 min，抽濾后量取150 mL過D101型大孔吸附樹脂柱，先用600 mL純水洗脫水溶性成分，棄去；然后用500 mL 70 %乙醇洗脫，洗脫液收集干燥至恒重[7]。采用紫外可見分光光度法測定提取后ABS的含量達(dá)55.34%。

1.6 UPLC-Q-TOF/MS檢測AA大鼠關(guān)節(jié)腔微透析液

1.6.1制備林格氏液 林格氏液由8.6 g的NaCl，0.28 g的CaCl2和0.3 g的KCL溶于1 000 mL超純水，使用前過0.22 μm的微孔濾膜。

1.6.2樣品的處理及QC樣品的制備 微透析探針植入大鼠膝關(guān)節(jié)腔，實(shí)時(shí)檢測大鼠的體溫使其維持在37 ℃。收集每只大鼠的720 μL微透析液樣品 (灌流速度1.5 μL·min-1, 收集周期為8 h) 并貯藏于-80 ℃。在分析之前，將透析液樣品通過真空離心器干燥。然后用甲醇重新復(fù)溶，渦旋，并在4 ℃，14 000 r·min-1離心10 min。所有微透析樣品各取10 μL，用作QC樣品。

1.7 組織病理學(xué)檢查將大鼠麻醉，腹腔取血。取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜，用10% (v / v) 多聚甲醛固定，經(jīng)脫鈣、脫水、石蠟包埋切片后，用蘇木精-伊紅 (HE) 染色法染色，顯微鏡下觀察滑膜組織病理形態(tài)變化。

1.8 關(guān)節(jié)腫脹度、關(guān)節(jié)炎評分測定實(shí)驗(yàn)前使用足趾容積測量儀測定各組大鼠的足趾腫脹度，AA大鼠在造模后d 7開始，對各組大鼠進(jìn)行足趾容積測定 (3 d/次),腫脹度：△=造模后足趾容積平均值-造模前足趾容積平均值。采用關(guān)節(jié)炎指數(shù) (arthritic index，AI) 評分法對各組大鼠評分 (3 d/次)。

1.9 液質(zhì)聯(lián)用條件UPLC色譜條件 色譜柱：HILIC column (waters公司, 2.1 mm×100 mm, 1.7 μm); 柱溫35 ℃；樣品室溫度保持6 ℃ 流速 200 μL·min-1；流動相為乙腈(A)-0. 1%甲酸水溶液 (B)，梯度洗脫 (0-3 min，95% A; 3-8 min，90%-82% A; 8-12 min，82%-65% A; 12-15 min，65%-90%A；15-18 min, 95%A )。

質(zhì)譜條件電噴霧離子源 (ESI) 在正、負(fù)離子模式分別進(jìn)行MSE掃描；低碰撞電壓：6 V；高碰撞電壓：20-30 V；離子源溫度：120 ℃；錐孔電壓：40 V；電噴霧電壓：2.5 kV；干燥氣溫度：350 ℃；掃描范圍：50-1 200 m/z。

1.10 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理

1.10.1多元統(tǒng)計(jì)分析 依次將UPLC-Q-TOF/MS在ESI+和ESI-模式下采集的各組質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI v3.03軟件用于自動數(shù)據(jù)處理 (包括峰值拾取、保留時(shí)間 (tR) 校正和歸一化)。通過QI軟件的閾值 (P<0.05, fold changes ≥ 1.5, CV<30%) 進(jìn)一步篩選數(shù)據(jù)。然后將篩選數(shù)據(jù)集導(dǎo)入Ezinfo 3.0軟件中進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，包括無監(jiān)督的主成分分析 (PCA) 及有監(jiān)督的正交偏最小二乘法判別分析 (OPLS-DA)。根據(jù)VIP >1.0來選出差異離子。

1.10.2潛在生物標(biāo)志物的識別和代謝通路分析 將篩選過的差異代謝物的m/z和質(zhì)譜高能量下的離子碎片信息與Human Metabolome Database (HMDB) (https://hmdb.ca/) 以及查閱文獻(xiàn)自建的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配來確認(rèn)篩選后的潛在代謝物。使用網(wǎng)絡(luò)分析平臺MetaboAnalyst 4. 0 (https://www.metaboanalyst.ca) 對ABS干預(yù)RA相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行代謝通路富集分析及拓?fù)浞治觥?/p>

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠足腫脹度與關(guān)節(jié)炎評分各組大鼠的關(guān)節(jié)炎評分及左后肢的繼發(fā)性足腫脹見Fig 1 (A、B)。與AA組相比，ABS組在給藥d 6 (造模d 23后) 對AA大鼠的足腫脹具有抑制作用并能改善其關(guān)節(jié)炎評分 (P<0.05)。這些結(jié)果表明AA大鼠模型構(gòu)建成功，ABS能明顯改善RA癥狀。

Fig 1 Secondary paw swelling, arthritis score and pathological changes of synovial tissues in each group of rats

2.2 各組大鼠滑膜組織病理形態(tài)學(xué)變化HE染色結(jié)果如Fig 1 (C、D、E) 所示：對照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織的細(xì)胞表面排列均勻、整齊，未出現(xiàn)滑膜異常增生(Fig 1C)；AA組大鼠滑膜組織明顯觀察到滑膜間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤，滑膜細(xì)胞增殖、呈錯(cuò)亂排列 (Fig 1D) ；ABS組 (60 mg·kg-1) 滑膜細(xì)胞排列尚整齊，但有少量炎性細(xì)胞浸潤 (Fig 1E)。

2.3 關(guān)節(jié)腔微透析液中代謝物的分離采用UPLC-Q-TOF/MSE在正、負(fù)離子模式下采集AA組、ABS組、對照組微透析樣品的LC-MS數(shù)據(jù)，總離子色譜圖 (Fig 2)。生成的原始UPLC-Q-TOF/MS數(shù)據(jù)集經(jīng)Progenesis QI v3.03軟件導(dǎo)入Ezinfo 3.0進(jìn)行無監(jiān)督的PCA以及有監(jiān)督的OPLS-DA分析。PCA圖 (Fig 3) 表明對照組、AA組、ABS組代謝輪廓具有明顯差異。ABS組的數(shù)據(jù)矩陣有從模型組到對照組的回歸趨勢，表明ABS給藥組對AA大鼠的代謝紊亂有糾正作用。

Fig 2 Representative TICs of microdialysis sample

Fig 3 PCA score plots of QCP samples and all tested samples of Control，AA，ABS groups in ESI+ mode (A) and ESI- mode (B)

2.4 潛在生物標(biāo)志物的篩選和鑒定OPLS-DA分析結(jié)果顯示：在正、負(fù)離子模式下，對照組和AA組以及AA組和ABS給藥組均可以被明顯地區(qū)分(Fig 4)。S-plots (Fig 4)中，距離中心區(qū)域越遠(yuǎn)代表代謝物在兩組之間分離度越大。其中紅框中的代謝物為VIP>1.0，這些化合物為潛在的生物標(biāo)志物。OPLS-DA及S-plots篩選出的差異代謝物，在正、負(fù)離子模式下共獲得了19種與ABS干預(yù)AA相關(guān)的生物標(biāo)志物，見Tab 1。由潛在的生物標(biāo)志物生成的heatmap呈現(xiàn)了3組之間的差異，見Fig 5。其中，與AA組相比，上述19種生物標(biāo)志物在ABS干預(yù)后能在不同程度上接近對照組水平。例如，在AA組中Asparaginylarginine，15-Deacetylcalonectrin，AMP，Palmitoleoyl Ethanolamide，Pentadecanoylcarnitine，Sebacic acid，Stearic acid，GMP，Uridine 5′-monophos-phate，Palmitic acid， 3,5-Dichloro-4-hydroxy-2-methoxy-6-methylbenzoic acid和Cortisol等生物標(biāo)志物水平明顯增加，但ABS組與之相比呈下降趨勢。同樣地，AA組中Cytidine，PA(18:0/14:1(9Z))，xi-3-(4-Isopropylphenyl)-2-methylpropanal，Prenyl glucoside，Diisobutyl phthalate，Kinetensin 1-3和Arnamiol等標(biāo)志物水平明顯降低，但ABS組與之相比呈增加趨勢。

Fig 4 OPLS-DA score plot and S-plot plot of rat microdialysis samples

Fig 5 Heat map of metabolite levels in control,AA and ABS groups

Tab 1 Potential biomarkers identified by UPLC-QTOF/MS

2.5 代謝通路分析為了識別受ABS影響的可能代謝途徑，通過MetaboAnalyst 4.0軟件構(gòu)建代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)，ABS治療RA的代謝途徑主要涉及嘌呤、嘧啶、脂肪酸等代謝，見Fig 6。

Fig 6 Pathway enrichment analysis of 19 potential biomarkers responsible in treatment of ABS

3 討論

中藥牛膝具有活血化瘀、滋補(bǔ)肝腎及引藥下行等功效。本課題組前期研究了牛膝不同極性提取部位的抗炎、鎮(zhèn)痛效果，結(jié)果顯示，正丁醇萃取的三萜皂苷類化合物能顯著減輕小鼠耳腫脹度，降低胸腺指數(shù)及脾指數(shù)，提示其能抑制體內(nèi)的免疫反應(yīng)并具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用[6]。已有研究證明，ABS對RA具有療效，但其干預(yù)機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步探究[7]。

在關(guān)節(jié)腔微環(huán)境中，內(nèi)源性代謝物與基質(zhì)可能存在特異性或非特異性結(jié)合。傳統(tǒng)的樣本處理方法通過加入試劑解除其相互作用。適宜規(guī)格的微透析探針能阻斷大分子物質(zhì)穿過而選擇性采集小分子代謝物，其“采樣”與“純化”的雙重功能，可得到無生物大分子的微透析樣品，相比于血樣和組織樣品純凈度高，無需樣品前處理可直接進(jìn)樣分析，避免了前處理的冗長及可能帶來的誤差，使代謝組學(xué)結(jié)果更加客觀[8]。

本研究表明，ABS給藥能有效抑制AA大鼠的繼發(fā)性腫脹，且明顯改善滑膜增生和炎性細(xì)胞浸潤。建立基于UPLC-Q-TOF/MS結(jié)合微透析技術(shù)的代謝組學(xué)方法，從內(nèi)源性差異代謝物的角度來探究ABS抗RA的機(jī)制。代謝組學(xué)的PCA圖表明，ABS組有向?qū)φ战M水平回歸的趨勢，故ABS具有改善RA病理過程代謝紊亂的作用，并鑒定出19個(gè)與ABS干預(yù)RA有關(guān)的生物標(biāo)志物。這些生物標(biāo)志物主要涉及嘌呤代謝、脂肪酸代謝、嘧啶代謝和類固醇激素代謝等途徑。結(jié)合關(guān)節(jié)炎評分、足腫脹度及滑膜組織病理形態(tài)學(xué)變化等指標(biāo)的變化，發(fā)現(xiàn)ABS組比AA模型組更接近對照組，表明ABS主要通過調(diào)節(jié)嘌呤、嘧啶、脂肪酸和類固醇激素的代謝紊亂以及抑制炎癥和調(diào)節(jié)免疫來緩解RA的進(jìn)程。

3.1 嘌呤代謝的變化越來越多的研究結(jié)果表明RA的發(fā)展與嘌呤代謝紊亂有關(guān)。嘌呤代謝參與多種生理和病理過程，通過參與炎癥反應(yīng)，在RA的病理過程中發(fā)揮作用[9-11]。在炎癥部位中，各種細(xì)胞(如免疫細(xì)胞)分泌一系列細(xì)胞間效應(yīng)分子，將三磷酸腺苷(ATP)釋放到胞外，ATP和二磷酸腺苷(ADP)通過胞外二磷酸三磷酸核苷水解酶1 (CD39)轉(zhuǎn)化為一磷酸腺苷(AMP)，從而導(dǎo)致AMP水平上升[12]。CD39和胞外ATP在FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制功能中也起著重要作用。CD39在FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中表達(dá)并促進(jìn)腺苷的產(chǎn)生，腺苷的產(chǎn)生會使FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌免疫抑制細(xì)胞因子如IL-10。此外，研究表明腺苷的產(chǎn)生會使細(xì)胞內(nèi)AMP水平增加。在本實(shí)驗(yàn)中，AA大鼠的嘌呤代謝出現(xiàn)了明顯的變化，其中，AMP水平明顯升高，ABS給藥后恢復(fù)到正常水平。表明ABS干預(yù)后的AA大鼠嘌呤代謝紊亂得到逆轉(zhuǎn)，ABS可能通過干預(yù)嘌呤代謝途徑發(fā)揮治療RA作用。

3.2 脂肪酸代謝的變化脂肪酸，包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，參與多種疾病代謝過程，如RA、II型糖尿病和心血管疾病的發(fā)展[13]。研究表明，在RA中炎性細(xì)胞因子TNF-α刺激脂肪組織分解釋放游離脂肪酸，導(dǎo)致血漿中游離脂肪酸水平升高[14]。也有研究表明，硬脂酸和棕櫚酸在RA中均具有顯著變化，是預(yù)測RA的重要生物標(biāo)志物[15-16]。本研究結(jié)果表明，AA大鼠的硬脂酸和棕櫚酸水平顯著增高，并在ABS的干預(yù)下回調(diào)至正常水平，提示ABS可能通過降低游離脂肪酸水平，改善脂肪酸生物合成途徑的代謝紊亂而達(dá)到干預(yù)RA的作用。

3.3 嘧啶代謝的變化本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組中的胞苷水平下降，一磷酸尿嘧啶水平升高。在ABS給藥后，胞苷和一磷酸尿嘧啶的水平均恢復(fù)到接近對照組的水平，結(jié)果表明ABS具有改善嘧啶代謝紊亂的作用。嘧啶核苷酸衍生物也能對細(xì)胞信號和能量代謝起到調(diào)節(jié)作用。然而，與嘌呤核苷酸衍生物在細(xì)胞生物功能中的作用相比，嘧啶核苷酸衍生物的相關(guān)報(bào)道較少，推測ABS可能通過調(diào)節(jié)嘧啶代謝紊亂干預(yù)RA。

3.4 類固醇激素的變化皮質(zhì)醇是類固醇激素的一種，在離子運(yùn)輸、心血管系統(tǒng)、免疫功能和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等方面具有調(diào)節(jié)作用[17]。研究表明，RA炎性條件下，炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β激活肝臟中11b-羥基類固醇脫氫酶 (11b-HSD) 使血清中皮質(zhì)醇水平升高[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于對照組，模型組皮質(zhì)醇水平升高，ABS下調(diào)過高的皮質(zhì)醇水平，表明ABS可能通過調(diào)節(jié)類固醇激素代謝發(fā)揮治療RA的作用。

本研究將微透析技術(shù)與UPLC-Q-TOF/MS相結(jié)合，檢測AA大鼠關(guān)節(jié)腔微透析液中代謝物的變化。經(jīng)多元統(tǒng)計(jì)分析，共篩選出19個(gè)與牛膝總皂苷干預(yù)AA相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，通過通路富集分析發(fā)現(xiàn)它們主要涉及嘌呤代謝、嘧啶代謝、脂肪酸合成及類固醇激素合成途徑。研究表明微透析結(jié)合代謝組學(xué)研究能揭示ABS干預(yù)AA的代謝相關(guān)機(jī)制，為ABS作用機(jī)制的深入探討奠定。