崔廷婷 萬宇平陳立軍崔娜崔海峰吳小勝

(1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，北京 102206；3.灤州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 灤州 063701)

三唑酮是一種高效、低毒、廣譜的內(nèi)吸性殺菌劑，兼有保護(hù)、治療、鏟除和熏蒸等作用，可用于防治小麥的紋枯病、全蝕病、白粉病、根腐病，水稻的稻瘟病、稻葉尖枯病、稻曲病、黑粉病等多種病害[1]。其還是一種甾醇抑制劑和植物生長調(diào)節(jié)劑，在與一些農(nóng)藥混配后具有協(xié)同增效作用[2]。但大量使用該農(nóng)藥，會(huì)導(dǎo)致部分產(chǎn)地農(nóng)作物中三唑酮檢出率偏高，殘留在農(nóng)產(chǎn)品中的三唑酮會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害[3,4]，也會(huì)影響我國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和出口貿(mào)易[5]。因此，三唑酮及其代謝物三唑醇在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留檢測(cè)受到了越來越多的關(guān)注。

目前，關(guān)于三唑酮及其代謝物三唑醇的殘留檢測(cè)方法多為氣相色譜法[6-8]、液相色譜法[9]和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[10-13]。這些方法可以精確地進(jìn)行定量分析，但設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜，檢測(cè)成本高、周期長，而且需要專業(yè)的人員，只能用于小批量樣品抽檢，無法滿足對(duì)大批量樣品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)、快速檢測(cè)的需要。而酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)具有特異性高、敏感性強(qiáng)、快速方便、不需要昂貴儀器設(shè)備、檢測(cè)成本低、適合于大批量樣品的檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已在農(nóng)獸藥殘留及微量毒素檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用。因此，本研究擬建立一種快速、靈敏檢測(cè)煙草、蔬菜水果中三唑酮及其代謝物殘留的酶聯(lián)免疫吸附方法，旨在為農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雌性Balb/c小鼠(6～8周齡)，清潔級(jí)，由北京勤邦生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供；1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯(DBU)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、碳化二亞胺(EDC)、三唑酮、三唑醇(純度≥99%)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)均購自Sigma公司；其它化學(xué)試劑為分析純。復(fù)溶液為pH7.0、0.1mol·L-1的磷酸鹽緩沖液。

1.2 儀器與設(shè)備

8010S勻漿機(jī)，上海斯伯明儀器設(shè)備有限公司；2000SBL電子天平，美國Setra公司；QL-901漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Anke TDL-40B低速離心機(jī)，海安亭科學(xué)儀器有限公司；微量移液器(單道20～200μL、100～1000μL，多道20～300μL)，美國Thermo公司；DHP-600生化培養(yǎng)箱，天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；MK3酶標(biāo)儀，美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 三唑酮半抗原的合成

合成路線見圖1。取1.0g三唑酮加乙醇溶解，加入0.35g DBU，攪拌，再加入0.87g氨基己酸水溶液，加熱回流反應(yīng)12h；停止反應(yīng)，旋蒸，除去乙醇，加水和1.3g氫氧化鉀，震蕩，加乙酸乙酯萃取，分去有機(jī)相，水相調(diào)節(jié)pH值到4，加乙酸乙酯萃取，有機(jī)相水洗，無水硫酸鈉干燥蒸干，得到淺黃色油狀物，二氯甲烷/石油醚(1∶10，V/V)重結(jié)晶，即得到三唑酮半抗原產(chǎn)物。其化學(xué)結(jié)構(gòu)用核磁共振鑒定。

1.3.2 人工抗原的制備

將三唑酮半抗原與BSA和OVA分別偶聯(lián)，作為免疫原和包被原。具體操作過程：取14mg半抗原，溶解于1mL DMF中；稱取載體蛋白50mg，使之充分溶解在3.8mL MES緩沖液(pH5.0)中，將半抗原緩慢滴加到蛋白溶液中；取30mg EDC用0.2mL MES緩沖液(pH5.0)充分溶解后加入半抗原蛋白混合液中，室溫下攪拌24h；用0.01mol·L-1PBS緩沖液4℃透析3d，每天換3次透析液；分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 單克隆抗體的制備

按照常規(guī)方法免疫Balb/c小鼠制備腹水抗體，用飽和硫酸銨法純化后備用[14]。

1.3.4 抗原、抗體最適工作濃度的確定

分別將包被原(三唑酮半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物)和三唑酮單克隆抗體溶液倍比稀釋，進(jìn)行間接競(jìng)爭ELISA方陣試驗(yàn)，選取OD450nm值在1.0左右的包被原和抗體濃度為最佳工作濃度。

1.3.5 間接競(jìng)爭ELISA方法的建立

用包被緩沖液將包被原稀釋成最佳工作濃度后，包被在96孔酶標(biāo)板上，100μL/孔，37℃溫育2h；傾去板中溶液，經(jīng)PBST洗滌3次，加入封閉液200μL/孔，37℃溫育2h；洗滌3次，加入系列濃度的三唑酮標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL/孔，再加入經(jīng)抗體稀釋液稀釋成最佳工作濃度的單克隆抗體溶液50μL/孔，25℃避光反應(yīng)30min；洗滌4～5次后，加入酶標(biāo)二抗100μL/孔，25℃避光反應(yīng)30min；洗滌4～5次后加入底物液A液(過氧化脲)和B液(四甲基聯(lián)苯胺)各50μL/孔，25℃顯色15min，加入2mol·L-1H2SO4終止液50μL/孔，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值(OD值)。

信貸扶貧資金管理方面主要的創(chuàng)新有：第一，借款主體的創(chuàng)新，先后嘗試了直接貸款到戶、扶持經(jīng)濟(jì)實(shí)體、支持地方主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)和龍頭企業(yè)，以及直接貸款到戶與委托幫扶貸款相結(jié)合等方式；第二，貸款方式創(chuàng)新，1986年以來嘗試了政府信用下的經(jīng)濟(jì)實(shí)體貸款、依托社會(huì)信用的小額貸款、抵押和擔(dān)保為基礎(chǔ)的企業(yè)或政府貸款等；第三，貼息方式創(chuàng)新，嘗試了貼息給承貸銀行、貼息給借款人等方式；第四，承貸機(jī)構(gòu)選擇，先后嘗試了商業(yè)銀行承貸、政策銀行承貸、地方政府選擇等方式。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用間接競(jìng)爭ELISA方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別選擇三唑酮標(biāo)準(zhǔn)品濃度0μg·L-1、1μg·L-1、3μg·L-1、9μg·L-1、27μg·L-1、81μg·L-1，以濃度為0μg·L-1時(shí)的OD值為B0值，相應(yīng)三唑酮濃度的OD值為B值，以百分吸光度值(B/B0)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 樣品前處理

1.3.7.1 煙草樣本

稱取1±0.05g均質(zhì)的煙草樣本至10mL聚苯乙烯離心管中，加入5mL乙腈，渦動(dòng)3min混勻；4000r·min-1室溫離心5min；取20μL樣本液至4mL聚苯乙烯離心管中，加入1980μL復(fù)溶液，渦動(dòng)30s，取50μL用于分析。

1.3.7.2 蔬菜水果樣本

稱取1±0.05g均質(zhì)的果蔬樣本至10mL聚苯乙烯離心管中，加入4mL乙腈，渦動(dòng)3min混勻；4000r·min-1室溫離心5min；取20μL樣本液至4mL聚苯乙烯離心管中，加入1980μL復(fù)溶液，渦動(dòng)30s，取50μL用于分析。

1.3.8 酶聯(lián)免疫方法技術(shù)參數(shù)的確定

1.3.8.1 檢測(cè)限試驗(yàn)

1.3.8.2 特異性試驗(yàn)

選擇與三唑酮具有類似結(jié)構(gòu)和類似功能的其它殺菌劑(三唑醇、環(huán)唑醇、粉唑醇、戊唑醇、己唑醇、烯唑醇)進(jìn)行交叉反應(yīng)性檢測(cè)。計(jì)算交叉反應(yīng)率：

交叉反應(yīng)率=X/Y×100%

式中，X為引起50%抑制的三唑酮濃度；Y為引起50%抑制的其它殺菌劑濃度。

1.3.8.3 準(zhǔn)確性和重復(fù)性試驗(yàn)

用回收率和變異系數(shù)分別來評(píng)價(jià)ELISA方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。以3個(gè)不同濃度的三唑酮、三唑醇標(biāo)準(zhǔn)品分別對(duì)空白樣本進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率和變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原的核磁共振氫譜鑒定

取半抗原產(chǎn)物經(jīng)核磁共振得圖2。從圖2可知，1H-NMR(CDCl3,300MHz)δ：11.00(1H,s)，7.51(1H,ddd,J=8.132,J=5.483,J=1.670)，7.46(1H,ddd,J=8.132,J=5.485,J=1.670)，6.94(1H,dd,J=8.132,J=5.485)，6.94(1H,dd,J=8.132,J=5.483)，6.52(1H)，8.270(1H,d,J=1.903)，8.1(1H,d,J=1.903)，3.87(2H,t,J=7.434)，1.25(3H,s)，1.25(3H,s)，1.25(3H,s)，1.84(2H,tt,J=7.434,J=7.022)，1.41(2H,tt,J=7.434,J=7.022)，1.55(2H,tt,J=7.434,J=7.367)，2.30(2H,t,J=7.367)。圖譜中，化學(xué)位移δ=11.0的為間隔臂上羧基氫共振吸收峰；δ=1.85、1.41、2.30的為間隔臂上亞甲基氫的共振吸收峰，這些峰的存在，證明間隔臂偶聯(lián)成功，三唑酮半抗原結(jié)構(gòu)正確。

2.2 最佳工作濃度的選擇

方陣法測(cè)定不同包被原和單克隆抗體的間接競(jìng)爭抑制ELISA測(cè)定結(jié)果(OD450nm值)見表1。在ELISA包被過程中，包被效果與濃度呈正相關(guān)，但濃度過高，不僅浪費(fèi)試劑，而且會(huì)降低待測(cè)物的競(jìng)爭能力，從而影響靈敏度[16]。考慮到酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm值的敏感范圍在1.00左右，為了既保證測(cè)定結(jié)果的靈敏可靠，又減少抗原的用量，試驗(yàn)應(yīng)選擇的最適包被原稀釋倍數(shù)為1∶10000，最佳抗體稀釋倍數(shù)為1∶300000。

表1 不同包被原和單克隆抗體稀釋濃度的OD450nm值

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以百分吸光度值(B/B0)為縱坐標(biāo)(Y)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。以Logit(B/B0)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，將圖3轉(zhuǎn)換后可知，在1～81μg·L-1濃度范圍內(nèi)，Logit(B/B0)與三唑酮濃度對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，如圖4所示。建立擬合回歸直線方程為Y=-2.175X+1.086，相關(guān)系數(shù)r為0.9950，半數(shù)抑制濃度(IC50)為3.0μg·L-1。

2.4 檢測(cè)限測(cè)定

20個(gè)空白樣本的B/B0在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的濃度見表2，綜合考慮幾種樣本的檢測(cè)限數(shù)據(jù)，得出本方法對(duì)煙草和蔬菜水果樣本的檢測(cè)限為0.5mg·kg-1。

表2 方法的檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果

2.5 特異性測(cè)定

由于三唑醇是三唑酮的代謝產(chǎn)物，所以選用的三唑酮單克隆抗體與三唑醇有94.6%的交叉反應(yīng)，而與其它類似結(jié)構(gòu)的殺菌劑的交叉反應(yīng)均<1%，說明該方法具有良好的特異性。

2.6 準(zhǔn)確性和重復(fù)性測(cè)定

ELISA測(cè)定的準(zhǔn)確度用回收率表示，精密度用變異系數(shù)表示。以市售空白煙葉、白菜、茄子、蘋果、香蕉樣本為試驗(yàn)材料，向其中分別添加三唑酮及其代謝物三唑醇標(biāo)準(zhǔn)品，添加量為0.5mg·kg-1、1.0mg·kg-1、2.0mg·kg-1。結(jié)果表明，樣品加標(biāo)回收率為73.6%～102.5%，重復(fù)檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)為5.8%～9.2%，說明該ELISA方法測(cè)定煙草、蔬菜水果中三唑酮及其代謝物三唑醇?xì)埩艟哂辛己玫臏?zhǔn)確性和重復(fù)性，可用于農(nóng)作物中三唑酮及其代謝物三唑醇的殘留檢測(cè)。

3 結(jié)論

酶聯(lián)免疫法因靈敏度高、特異性好、操作簡便、檢測(cè)成本低、一次性檢測(cè)樣本量大等特點(diǎn)，能夠更好地滿足我國食品企業(yè)、政府監(jiān)管部門等開展檢測(cè)工作。本研究初步建立了煙草和蔬菜水果中三唑酮及其代謝物三唑醇?xì)埩魴z測(cè)的酶聯(lián)免疫吸附法。該方法的IC50為3.0μg·L-1，樣本檢測(cè)限為0.5mg·kg-1；陽性樣本的加標(biāo)回收率為73.6%～102.5%，樣本重復(fù)檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)為5.8%～9.2%，并且樣本前處理簡單、儀器設(shè)備投資少、檢測(cè)成本低，適用于大批量樣本中三唑酮及其代謝物三唑醇?xì)埩舻目焖俸Y選。