丁志偉，楊大平，王永生，楊偉克，高建華

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101)

【研究意義】堿性磷酸酶ALP(Alkaline phosphatase)作為生物體內(nèi)一類高度保守的磷酸水解酶，其主要功能是催化磷酸單脂水解，參與機(jī)體磷酸基團(tuán)的代謝過程，而且還參與了昆蟲機(jī)體的解毒代謝和免疫防御過程[1-2]。ALP廣泛存在于昆蟲的頭、脂肪體、血淋巴、腸道、表皮、馬氏管、生殖腺和唾液腺等部位。家蠶(Bombyxmori)是一種吐絲營繭的經(jīng)濟(jì)昆蟲，其ALP酶活力大小與蠶體強(qiáng)健性和抗性強(qiáng)弱密切相關(guān)，一般情況下，蠶體ALP活力越高，其幼蟲生長發(fā)育健康齊一，蠶體抗逆性越強(qiáng)，繭絲產(chǎn)量高[3-4]。【前人研究進(jìn)展】昆蟲遭遇細(xì)菌等病原微生物侵染時，機(jī)體正常的物質(zhì)和能量代謝過程受阻，溶菌酶、解毒酶和水解酶等相關(guān)酶的活性也會發(fā)生一定的變化[5]。ALP被認(rèn)為是一類與昆蟲抗性密切相關(guān)的水解酶[6]。用低劑量的螟硫磷處理云杉色卷蛾，其血淋巴和中腸ALP基因被顯著上調(diào)，編碼的堿性磷酸酶活性也顯著高于對照組[7]。研究發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲ALP酶活性越高，其機(jī)體對有機(jī)磷農(nóng)藥的水解能力也越強(qiáng)；與敏感品系相比，對除蟲菊酯具有抗性的棉鈴蟲中腸ALP酶活性顯著增加[8-9]。棉鈴蟲遭受HearNPV侵染后，機(jī)體ALP的活性被顯著抑制，且抑制作用與感染病毒的劑量和感染后時間的增加呈正相關(guān)[10]。而在對家蠶的研究中發(fā)現(xiàn)，BmNPV感染家蠶幼蟲后，ALP活性及其基因的表達(dá)量在感染中期增加，感染后期會急劇減弱[11]。用病原微孢子蟲N.b和SCM6交叉感染4齡家蠶，中腸ALP酶活性呈現(xiàn)先迅速升高，隨后急劇降低的趨勢[12]。另外，家蠶在遭受蘇云金芽孢桿菌或黑胸敗血芽孢桿菌感染后，機(jī)體ALP酶活性呈現(xiàn)先逐漸增強(qiáng)后急劇減弱的的變化趨勢，這暗示堿性磷酸酶在家蠶抵御病原微生物侵染過程發(fā)揮了一定的功能[13-14]。【本研究切入點(diǎn)】細(xì)菌病是家蠶飼育過程中較常見的病害，具有一定的傳染性，危害嚴(yán)重，每年給蠶農(nóng)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[15]?？咕摹峒さ鞍缀头友趸傅让庖邞?yīng)答因子參與家蠶抵御細(xì)菌侵染的研究已有大量報道[16-18]，而關(guān)于ALP在家蠶抵御細(xì)菌侵染過程中的生理作用及分子機(jī)制的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究家蠶經(jīng)口感染大腸桿菌和金黃色葡萄球菌后，機(jī)體不同組織ALP酶活性變化規(guī)律，明確ALP在家蠶幼蟲抵御細(xì)菌侵染的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮的作用，為深入解析家蠶堿性磷酸酶ALP的生理功能奠定基礎(chǔ)，為篩選和培育強(qiáng)健性多絲量家蠶新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

家蠶品種：菁松，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所質(zhì)檢中心保存和飼育。革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichiacoli)和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所家蠶病理研究室提供。

主要儀器及試劑：ThermoFisher高速冷凍離心機(jī)，BioTek Synergy 2多功能酶標(biāo)儀。BCA蛋白測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，型號P0006)。堿性磷酸酶活性測試盒(北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)，型號BC2140)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng) 用高壓滅菌的牙簽在LB固體培養(yǎng)基平板上挑取單菌落，放入試管中，加入適量LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)10～16 h。取200～500 μl菌液，加入裝有10 mL液體培養(yǎng)基的試管中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值約為0.5，血球計數(shù)板計數(shù)并測算菌液濃度，轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，3500 r·min-1離心15 min，棄上清，用昆蟲生理鹽水懸浮菌體，使其濃度為2×108個·mL-1。

1.2.2 添食細(xì)菌及采集樣品 參照楊偉克[19]文獻(xiàn)報道的方法：分別將濃度為2×108個·mL-1的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌懸液，用微量移液器經(jīng)口喂食5齡第3天家蠶幼蟲，每頭家蠶喂食5 μl。以喂食等量的生理鹽水為對照組。在喂食不同細(xì)菌后的3、6、12、24和48 h，解剖家蠶幼蟲，取其血淋巴、中腸、馬氏管和脂肪體，樣品收集后用液氮凍存。

1.2.3 酶活性測定 分別取中腸、馬氏管和脂肪體0.5 g迅速放入玻璃勻漿器中，加入預(yù)冷PBS緩沖液1 mL，在冰上充分研磨勻漿，隨后將勻漿液倒入2 mL的離心管中，在4 ℃條件下，轉(zhuǎn)速4500 r·min-1離心10 ～ 15 min，上清液轉(zhuǎn)即為待測酶液。

取250 μl家蠶血淋巴，加入預(yù)冷PBS緩沖液750 μl，在4 ℃條件下，轉(zhuǎn)速6000 r·min-1，離心15 ～ 20 min，棄沉淀留上清液，即為待測酶液。

利用BCA蛋白測定試劑盒測定各樣品蛋白濃度，根據(jù)堿性磷酸酶測試盒操作說明測定并計算各個樣品的ALP酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016記錄數(shù)據(jù)并計算，GraphPad Prism 5對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同細(xì)菌對家蠶血淋巴堿性磷酸酶活性的影響

如圖1所示，與對照組相比，喂食大腸桿菌組和喂食金黃色葡萄球菌組，家蠶幼蟲血淋巴ALP酶活性在3、6和12 h均無顯著變化。而在24和48 h，不論是大腸桿菌處理組，還是金黃色葡萄球菌處理組，其ALP酶活性均顯著高于對照組(P<0.05)。

2.2 不同細(xì)菌對家蠶中腸堿性磷酸酶活性的影響

由圖2結(jié)果顯示，中腸ALP酶活性在喂食大腸桿菌和金黃色葡萄球菌后3 h，與對照組相比無顯著差異，6 h酶活性開始顯著增加(Ρ<0.05)，并且在12 h酶活性均極顯著高于對照組(Ρ<0.01)。在24 h大腸桿菌處理組和金黃色葡萄球菌處理組的ALP酶活性均呈現(xiàn)減弱趨勢，但與對照組相比并無顯著差異。在48 h細(xì)菌處理組的ALP酶活性均極顯著低于對照組(Ρ<0.01)。

2.3 不同細(xì)菌對家蠶馬氏管堿性磷酸酶活性的影響

由圖3可知，在喂食大腸桿菌和金黃色葡萄球菌后3和6 h，馬氏管的ALP酶活性與對照組相比沒有顯著變化，12 h酶活性開始增加，與對照組相比差異顯著(Ρ<0.05)，在24 h酶活性極顯著高于對照組(Ρ<0.01)。在喂食不同細(xì)菌后48 h，ALP酶活性開始顯著下降，與對照組相比差異達(dá)到顯著水平(Ρ<0.05)。在測定的時間范圍內(nèi)，喂食不同細(xì)菌后家蠶馬氏管ALP酶活性整體呈現(xiàn)先增加后減弱的變化趨勢。

2.4 不同細(xì)菌對家蠶脂肪體堿性磷酸酶活性的影響

如圖4所示，不論是大腸桿菌處理組還是金黃色葡萄球菌處理組，家蠶脂肪體ALP酶活性逐漸被抑制，隨著時間的延長，酶活性急劇減弱。脂肪體ALP酶活性在3和6 h略低于對照組水平，而在12 h酶活性開始顯著降低，大腸桿菌處理組和金黃色葡萄球菌處理組的ALP酶活性分別下降至對照組的59 %和65 %，差異達(dá)到顯著水平(Ρ<0.05)；而在24和48 h，ALP酶活性持續(xù)低于對照組，且差異達(dá)到極顯著水平(Ρ<0.01)。

3 討 論

昆蟲堿性磷酸酶不僅參與機(jī)體的物質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)離子平衡，而且參與機(jī)體的解毒代謝和免疫防御過程。赤擬谷盜進(jìn)食含有菊酯類殺蟲劑的飼料后，中腸和脂肪體ALP基因表達(dá)量增加，其編碼的堿性磷酸酶活性顯著上升[20]。對除蟲菊酯具有抗性的棉鈴蟲中腸ALP酶活性顯著高于敏感品系[9]。于歡等人發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲幼蟲感染HearNPV后，其機(jī)體的ALP活性被顯著抑制，且抑制作用與感染病毒的劑量和感染后時間的增加呈正相關(guān)[10]。家蠶感染蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)和質(zhì)型多角體病毒(Cytoplasmicpolyhedrosisvirus)，ALP酶活性呈現(xiàn)先顯著升高，隨后急劇減弱的變化趨勢[13-14]。家蠶遭受BmNPV感染后，各組織堿性磷酸酶活性及其基因的表達(dá)量在感染中期增加，感染后期會急劇減弱，這表明ALP很可能參與了家蠶對抗BmNPV侵染的免疫防御反應(yīng)[11]。

本研究結(jié)果顯示，不論是喂食革蘭氏陰性菌大腸桿菌還是革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌，家蠶血淋巴、中腸和馬氏管ALP酶活性整體呈現(xiàn)先增加后減弱的變化趨勢。在測定的時間范圍內(nèi)，經(jīng)口喂食不同細(xì)菌，其最先接觸和刺激中腸，中腸組織ALP酶活性在喂食細(xì)菌后6 h就開始逐漸增加，馬氏管和血淋巴ALP酶活性分別在感染細(xì)菌后12 h和24 h才開始顯著增強(qiáng)。說明蠶體不同組織ALP對細(xì)菌侵染的響應(yīng)不一致。另外，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對脂肪體ALP酶活性具有顯著的抑制作用，并隨著時間的延長，酶活性急劇減弱。家蠶脂肪體可以分泌抗菌活性因子參與機(jī)體免疫防御過程；另外，家蠶的脂肪體含有許多酶系，對蠶體代謝起著重要作用。當(dāng)用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌侵染家蠶時，引起宿主脂肪體內(nèi)免疫調(diào)控途徑的變化，直接或間接抑制了ALP等參與蠶體中間代謝相關(guān)酶活性的變化。

4 結(jié) 論

用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌經(jīng)口侵染家蠶，不同組織器官ALP酶活性變化規(guī)律及其對細(xì)菌的響應(yīng)時間和受影響程度并不一致。添食不同細(xì)菌，家蠶中腸、血淋巴和馬氏管ALP酶活性呈現(xiàn)先顯著升高，后急劇降低的變化趨勢，而脂肪體ALP酶活性從12 h開始顯著降低，并一直處于被抑制狀態(tài)。提示中腸、血淋巴和馬氏管ALP在家蠶抵御細(xì)菌侵染的免疫防御過程發(fā)揮了一定的作用，具體的作用機(jī)制有待深入研究。