李良良，吳 迪，張懷山，王夢柳，李葦潔

（1貴州省山地資源研究所，貴陽550001）（2六盤水市農業(yè)科學研究院）

獼猴桃屬獼猴桃科（Actinidiaceea）獼猴桃屬（Actinidia）藤本植物，共有54個種，其中原產于中國的有52種[1]?！t陽’是四川省選育的品種，屬于中華獼猴桃系列，果實短圓柱形，單果重70～100 g，果皮綠色，密被腺點，鮮果橫剖面沿果心有紫紅色線條呈放射狀分布，色彩鮮美，果肉細嫩，果味香甜，深受消費者喜愛[2]。獼猴桃屬植物倍性復雜多樣，目前已發(fā)現(xiàn)有二倍體到十二倍體植株的存在[3]。多倍體植株通常具有果實發(fā)育大、植株生長較為旺盛、產量較高、抗性較強等優(yōu)點[4-7]?！t陽’獼猴桃因倍性是二倍體，其抗病性、抗蟲性、抗寒性不及生產上所用的六倍體美味獼猴桃，如何改良‘紅陽’獼猴桃品種，提高其抗性成為我國獼猴桃產業(yè)發(fā)展急需解決的問題之一。

目前植物多倍體多采用化學方法中的秋水仙素處理[8]。秋水仙素能破壞紡錘體的形成，導致染色體的加倍[9]。韓禮星等[10]采用200 mg/L秋水仙素、300 mg/L 8-OH喹啉、500 mg/L對二氯苯處理獼猴桃1周左右成功得到多株嵌合體，但未見純合多倍體。蔣洪恩等[11]采用秋水仙素處理成功得到棗的四倍體植株。誘變育種能有效克服遠緣雜交不親和，有效縮短育種年限，創(chuàng)造新的種質資源[12]。多倍體育種能提高獼猴桃果實單果重、避免膨大劑的使用，而國內外對倍性育種的研究還相對較少。劉麗等[13]用秋水仙素對‘瓊露’獼猴桃進行處理，成功得到四倍體植株，并發(fā)現(xiàn)四倍體植株葉片變大，葉面變厚；張弛[14]以‘紅陽’獼猴桃離體組培苗為試驗材料，用0.2%秋水仙素浸泡48 h誘導率為20%。本研究在前人研究的基礎上，采用秋水仙素浸泡‘紅陽’獼猴桃新萌發(fā)愈傷組織的方法進行多倍體的誘導，以期能提高多倍體誘導率，獲得單果重大、抗性強、適應性好的新種質。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

前期工作已經成功建立‘紅陽’獼猴桃快繁體系[15]，選取剛剛萌發(fā)的‘紅陽’獼猴桃愈傷組織作為試驗材料。

1.2 多倍體的誘導和不定芽的再生

在超凈工作臺上取‘紅陽’獼猴桃新萌發(fā)的幼嫩愈傷組織，分別浸泡在經過抽濾滅菌的50、100、150 mg/L的秋水仙素溶液中3、4、5、6 h[13]，以浸泡在無菌水中處理5 h作為對照。吸水紙吸干后，接種在MS+2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的再生培養(yǎng)基上，光照度2 500 lx、時間16 h/d、25 ℃的條件下進行培養(yǎng)，每個處理接種50個愈傷組織，30 d后觀察愈傷組織的成活情況。分離愈傷組織長出的不定芽，轉接到MS+1 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的增殖培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，進行多倍體的鑒定。

1.3 多倍體鑒定

取0.5 cm2的再生新梢葉片放在潔凈的培養(yǎng)皿中，加入400 mL細胞裂解液（Partec HR-A），用鋒利的刀片快速剁碎，裂解2 min，將樣品通過30 μmol Partec Celltrics TM微孔膜過濾到上樣管中，加入DAPI染色液1 600 mL（Partec HR-B）染色1 min。采用德國Partec公司生產的流式細胞儀進行分析。

1.4 驗證試驗

在前期試驗的基礎上，用已經得到的最佳誘導‘紅陽’獼猴桃四倍體植株的秋水仙素濃度和處理時間對‘紅陽’獼猴桃健康的愈傷組織100個進行誘導，再將不定芽分成單株，轉接到MS+1 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的增殖培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，進行多倍體的鑒定。進一步驗證此配方對‘紅陽’獼猴桃愈傷組織的成活率和誘導率的影響，以得到更多的‘紅陽’獼猴桃四倍體和嵌合體。

2 結果與分析

2.1 秋水仙素對‘紅陽’獼猴桃愈傷組織存活率的影響

從表1可以看出，愈傷組織的存活率隨著秋水仙素濃度和處理時間的增加而逐漸降低。對照處理5 h后，愈傷組織存活率為96%；秋水仙素濃度為50 mg/L時，愈傷組織存活率由82%下降到60%；秋水仙素濃度為100 mg/L時，愈傷組織存活率由78%下降到58%；秋水仙素濃度為150 mg/L時，愈傷組織存活率由66%下降到18%?？梢姡锼伤靥幚砗笥鷤M織存活率均低于對照。在處理時間為3 h的條件下，秋水仙素濃度為50、100、150 mg/L時，愈傷組織存活率分別為82%、78%、66%。

表1 秋水仙素處理對愈傷組織存活率的影響

2.2 秋水仙素對‘紅陽’獼猴桃倍性及變異率的影響

采用流式細胞儀分析細胞核的相對含量，結果表明：1株為四倍體植株（圖1-A），有1個峰值，其細胞核相對含量為200；14株為嵌合體（圖1-B），有2個峰值，其細胞核相對含量分別為100、200；對照為二倍體植株（圖1-C），有1個峰值，其細胞核相對含量為100。

圖1 不同倍性細胞核DNA的相對含量

從表2可以看出，用100 mg/L的秋水仙素浸泡‘紅陽’獼猴桃愈傷組織5 h變異率達到23.68%，其中四倍體植株1株，嵌合體8株，其余濃度秋水仙素處理均未能得到四倍體植株。通過進一步的觀察發(fā)現(xiàn)，經過秋水仙素處理得到的四倍體植株與對照二倍體植株有明顯的差異，與對照相比，葉片加厚、加大，葉面變得粗糙，但出現(xiàn)明顯的畸形（圖版2），生長明顯變得緩慢。

表2 秋水仙素處理對植株變異率的影響

2.3 驗證試驗結果

前期試驗結果顯示，用100 mg/L秋水仙素處理‘紅陽’獼猴桃愈傷組織5 h，變異率為23.68%，得到1株四倍體和8株嵌合體，變異率最高，效果最好。

在前期工作的基礎上，進一步驗證試驗結果顯示：用100 mg/L秋水仙素浸泡愈傷組織5 h，100個愈傷組織成活69株，其余均變黑褐化死亡，其愈傷組織成活率達到69%；對成活的69株進行不定芽的誘導，待不定芽長至2～3片幼嫩的葉片，開始分離不定芽，得到成活的不定芽共196株；采用流失細胞儀對得到的196株不定芽檢測發(fā)現(xiàn)，變異植株47株，其中有6株四倍體，其余均為嵌合體，變異率達到23.97%。6株‘紅陽’獼猴桃四倍體植株均表現(xiàn)出長勢較弱、葉片有明顯畸形，與前期誘導試驗結果一致。

3 討論與結論

獼猴桃作為多年生藤本經濟作物，育種周期較長而導致育種速度緩慢，目前常用的育種手段為雜交，但其隨機性比較強，而倍性育種目的較為明確，可較快地創(chuàng)新種質資源，有效豐富育種材料。目前，多倍體的誘導多采用秋水仙素處理發(fā)芽的種子以及幼嫩的葉片等，以進一步得到倍性變化的植株[16]。本研究對‘紅陽’獼猴桃愈傷組織進行秋水仙素處理以誘導四倍體，因愈傷組織細胞分裂快、結構更加疏松，秋水仙素能更好地和細胞進行接觸，對細胞產生更好的誘導效果。秋水仙素誘導只有在合適的濃度和時間范圍內才能成功。但秋水仙素是一種有毒制劑，周慧文等研究表明，長時間的浸泡能導致植株的大概率死亡[17]，與本研究的結果一致。

前人多采用染色體計數(shù)法和去壁低滲火焰干燥法統(tǒng)計植物的倍性[6]，此種方法較為繁瑣，材料浪費現(xiàn)象比較嚴重，流式細胞儀作為一種新興的鑒定方法[18]，已經在多種果樹上得到了驗證和應用，但是價格相對較為昂貴[19]。本研究以100 mg/L秋水仙素浸泡‘紅陽’獼猴桃愈傷組織5 h，得到四倍體植株只有1株，嵌合體有8株。通過驗證試驗進一步表明，100 mg/L秋水仙素浸泡‘紅陽’獼猴桃愈傷組織5 h變異率達到23.97%，并得到47株變異植株，其中6株為四倍體植株，比秋水仙素直接處理組培苗莖尖的誘導率為20%[14]要高，這可能跟愈傷組織細胞松散與秋水仙素接觸面積更大，進而提高了誘導率有關。四倍體植株與二倍體植株相比，葉片變大，葉面變厚，但是畸形較為嚴重，后續(xù)能否長出完整的植株，還需要進一步觀察。本試驗得到多株嵌合體，能否從嵌合體中通過葉片離體再生技術分離出同質突變體[20]還需要進一步研究。