高美紅 許曉玲 白佳樺 劉彥 楊凌

（1，河北工程大學，056000；2，北京市農林科學院畜牧獸醫(yī)研究所 100097）

自從“多莉”誕生以來，多種哺乳動物已經通過體細胞核移植（SCNT）技術成功獲得克隆個體。SCNT 克隆技術將供體細胞的細胞核注入到去核的卵母細胞中，融合后通過體外發(fā)育創(chuàng)造出一個可存活的胚胎，然后將其移植到受體動物子宮內進行繁殖[1]。盡管在過去十年中很多科學家為改進該項技術作出了重大努力[2]，但目前克隆效率仍然低下。在所有影響克隆效率因素中，核供體細胞是其中關鍵因素之一。供體細胞類型及細胞所處的周期都影響克隆胚胎的發(fā)育[3]。

成纖維細胞是一種用于體細胞克隆常用的供體細胞[4]，在SCNT 研究中廣泛應用[5,6]。目前已成功將家畜成纖維細胞用于體細胞核移植技術。通過體細胞核移植到卵母細胞中進行克隆是目前生產優(yōu)質種畜和轉基因動物，保護瀕危物種最有效的技術[7]。成纖維細胞體外培養(yǎng)時貼附快，增殖分裂能力強、生長速度快，形態(tài)特征明顯極易觀察區(qū)分，是取材方便，培養(yǎng)簡單且穩(wěn)定性、一致性高的細胞類型之一，常用于二倍體細胞功能和細胞系建立的相關研究[8]。

1 成纖維細胞的來源和特征

成纖維細胞是基于形態(tài)學特征(拉長的纖維形狀) 定義的。在形態(tài)上，成纖維細胞是扁平的紡錘形細胞，缺乏基底膜，細胞核呈圓形拉長，被巨大的內質網包圍。成纖維細胞是最豐富的間質細胞類型[9]。被認為是產生和降解細胞外基質最重要的細胞，也被認為在間質纖維化中起關鍵作用。目前已報道的分離成纖維細胞的不同技術，包括從切碎組織的生長物中培養(yǎng)成纖維細胞和通過各種方法選擇性去除混雜細胞[10]。在培養(yǎng)成纖維細胞時必須考慮幾個方面。成纖維細胞在培養(yǎng)中表現(xiàn)出不同的形態(tài)學和生化特征，這取決于其起源位置、分化狀態(tài)和培養(yǎng)條件。它們在培養(yǎng)中通過形態(tài)學標準的鑒定至關重要的，特別是在與其他細胞類型的混合培養(yǎng)中。但到目前為止，單純從形態(tài)上很難準確識別成纖維細胞。在某些情況下，纖維細胞是根據其紡錘形結合間質細胞標記物波形蛋白染色陽性和上皮細胞或其他類型細胞標記物染色缺失，如平滑肌細胞、星形膠質細胞或造血細胞來確定的[11,12]。

在進行持續(xù)且大量的牛成纖維細胞培養(yǎng)時，為保證取材方便且不影響供體動物健康十分關鍵[4]。而采集耳緣皮膚組織（約1cm2）對供體健康影響極小，取樣便捷，可多次采集，適合各種動物的現(xiàn)狀，也適用于其他瀕危動物或珍稀物種[13，14]，避免了供體源本基因的損害，且取材后對動物存活和正常生長無甚影響[15]。

2 牛成纖維細胞鑒定方法

2.1 細胞形態(tài)學鑒定

形態(tài)學觀察是借助倒置顯微鏡從細胞的形態(tài)、核仁和胞體大小、核質比例、染色質等指標評價細胞[16]。成纖維細胞在顯微鏡下表現(xiàn)出典型的纖維狀和長紡錘形形態(tài)，交叉重疊生長，細胞核呈橢圓形，細胞多在培養(yǎng)皿或組織塊邊緣分布生長，細胞融合成片并彼此連接成網狀[17]?？傮w生長呈放射狀、火焰狀或漩渦狀遷移。

2.2 分子生物學鑒定細胞

成纖維細胞特異表達波形蛋白（Vimentin，Vim），是一種中間絲狀(IF) 蛋白。早期用免疫熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)了一個復雜的纖維網狀結構，不同于已知的上皮細胞骨架中的角蛋白系統(tǒng)。在小鼠發(fā)育過程中，Vim 最初出現(xiàn)在高度遷移的細胞類型中(即當胚胎還是兩層上皮細胞時，外胚層細胞開始遷移到新形成的“中胚層裂”中)。在間質細胞中，角蛋白基因被關閉，波形蛋白基因被打開[18]。Vim 是細胞骨架的重要組成部分，在細胞和生物體層面具有重要的生物學功能。Vim 在細胞遷移過程中與微管、肌動蛋白和AJs 相互作用并調控[19]?？梢愿鶕潢栃员磉_鑒定牛耳成纖維細胞。

2.2.1 細胞HE 染色鑒定

HE 染色是蘇木素-伊紅染色的簡稱。其中蘇木精染液為堿性，主要使細胞核內的染色質與胞質內的核糖體著紫藍色；伊紅為酸性染料，主要使細胞質和細胞外基質中的成分著紅色。兩者結合能清晰的顯出細胞的形態(tài)和特點。HE 染色方法簡單，常用于各種細胞鑒定。

具體操作為首先將第3 代牛耳成纖維細胞調整細胞數約為2×105個/mL，接種于有無菌蓋玻片的6 孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至蓋玻片爬滿，棄去培養(yǎng)液，PBS 洗滌，4%多聚甲醛固定30min。取出蓋玻片，加入HE 染色，染色后樹膠封片，在顯微鏡下拍照觀察。

據張媛[20]等染色結果顯示，經HE 染色，成纖維細胞核為藍紫色，細胞質為淡粉色，核仁明顯呈橢圓形，胞質疏松著色淺，結合形態(tài)可證實其為成纖維細胞。

2.2.2 波形蛋白基因Vim RT-PCR 鑒定

基于成纖維細胞特異性表達波形蛋白基因Vim mRNA 原理，可以利用RT-PCR 方法來進行鑒定。首先，將第2 代(P2)細胞接種于6 孔板，待細胞匯合度達80%后，使用TRIzol 法提取總RNA，反轉錄成cDNA。根據NCBI 數據庫中，成纖維細胞標志物Vim 基因的核酸序列，設計特異性引物（見附表）[21]，利用RT-PCR 的方法，按照退火溫度，擴增Vim 基因的目的片段。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

附表 RT-PCR 引物信息及反應條件

根據羅惠娜[21]等RT-PCR 的結果鑒定分離培養(yǎng)的細胞表達Vimentin 基因，證明符合成纖維細胞的特性。

2.2.3 Western blot 檢測鑒定波形蛋白

成纖維細胞特異性的表達波形蛋白Vim，因此，可以利用Western blot 的方法進行鑒定。將原代成纖維細胞接種于6 孔板，培養(yǎng)48h。提取細胞總蛋白，通過的SDS-PAGE 分離電泳，并轉移至PVDF 膜上；膜在5% 脫脂奶粉中封閉2h，將PVDF膜取出放入一抗中，一抗為兔抗人Vimentin 多克隆抗體，用密封袋封口，封閉(4°過夜孵育)。24h 后，棄一抗，在含有0.1%Tween-20（TBST）中洗。將PVDF 膜取出放入二抗中，二抗為山羊抗兔IgG，操作方法同上；使用化學發(fā)光試劑進行顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光檢測Vimentin 表達情況[22]。

Western blot 檢測牛皮膚成纖維細胞中Vim 的表達差異，單體分子量約53kD。白劍[23]等試驗證明，成纖維細胞中高表達波形蛋白，從而進一步證實獲取的牛皮膚細胞具有典型的成纖維細胞特性。

2.2.4 細胞免疫熒光染色鑒定

細胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究、相互作用研究和細胞信號轉導研究。該方法是將免疫學方法與熒光標記技術相結合，研究特異波形蛋白在細胞內的分布情況，從而來鑒定成纖維細胞[24]。成纖維細胞培養(yǎng)貼壁后，棄去細胞培養(yǎng)液，通過添加0.4%多聚甲醛固定10min，用0.3%TritonX-100 的滲透，室溫透化破膜20min，然后用PBS 再洗3 次。用山羊血清封閉，室溫孵育2h，然后棄封閉液滴加一抗波形蛋白(在PBS 中稀釋1：100)，4℃孵育過夜。24 h 后，從4℃冰箱中取出復溫1h 后棄一抗，用PBS 漂洗，避光條件下加入二抗孵育，37℃孵育避光中放置2h，棄二抗，在最后的洗滌過程中，用DAPI 染色標記細胞核。陰性對照（不加一抗）進行類似處理。最后用蒸餾水清洗培養(yǎng)皿，在200 倍放大的熒光倒置顯微鏡上計數每孔表達總數。

純度計算方法為：Vim 陽性表達數目/標記細胞數目（如DAPI）的比值可知其純度。

根據Budel 和Djabali[25]的報道，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)成纖維細胞標志蛋白（Vim）染色呈綠色熒光(陽性)，DAPI 染核呈藍色。細胞純度達到95%以上，表明分化后的細胞具有成纖維細胞特性。

3 用途

由于成纖維細胞具有間質表型，波形蛋白在所有類型的成纖維細胞中均高表達。這使得波形蛋白作為一種通過免疫熒光和免疫組化染色來直觀識別成纖維細胞群體的常用方法被廣泛使用[26]。波形蛋白是鑒定成纖維細胞的標志，梭形、核圓形是其主要形態(tài)特征之一。通過成纖維細胞內標記物(波形蛋白)的表達來表征細胞群體，在成纖維細胞中，波形蛋白參與許多對組織修復和再生至關重要的過程，包括細胞遷移、增殖、分化、血管生成、細胞外基質重塑和免疫反應等[27]。由于波形蛋白作為一種間質細胞標記物，主要用于成纖維細胞鑒定的基礎。為方便更好分離純化成纖維細胞，在做有關于任何動物的成纖維細胞時都可用上述方法去鑒定。

4 總結與展望

雖然牛耳成纖維細胞已被證實存在于皮膚中，但由于混雜多種雜細胞。根據標志蛋白分別用HE 染色、RT-PCR、Western blot 和免疫細胞熒光檢測分析表明成纖維細胞特性，為成纖維細胞的研究和應用提供便捷的路徑，并為細胞育種及體細胞核移植牛的培育奠定基礎[28]。