汪順，單聰，朱華賀，譚波，李小茜，楊愛東

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203

腸黏膜在防止病原體、毒素和過敏原從外部進(jìn)入組織起著至關(guān)重要的作用。研究表明，脂多糖（LPS）誘導(dǎo)仔豬腸損傷模型中腸黏膜屏障功能被破壞，繼而引起促炎因子升高和炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腸黏膜損傷加重[1]。因此，改善腸組織損傷是避免炎癥反應(yīng)級聯(lián)擴(kuò)大的關(guān)鍵途徑。大黃有清熱瀉火、涼血解毒功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，大黃具有抗炎、抗腫瘤等作用[2]，且可通過抑制炎癥因子釋放，改善大鼠腸源性膿毒癥[3]。mTOR信號通路主要調(diào)節(jié)機體的生長和代謝，在自噬調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，激活mTOR信號通路可改善大鼠腸缺血再灌注引起的腸組織損傷[5]。本課題組前期研究表明，大黃可下調(diào)mTOR下游p70S6K和eIF4E mRNA的表達(dá)從而減少白細(xì)胞介素（IL）-6和IL-1β的釋放[6]，但是否與mTOR上游PTEN/PI3K/Akt信號通路有關(guān)還有待研究?；诖?，本實驗通過建立LPS誘導(dǎo)大鼠腸組織損傷模型，觀察大黃對模型大鼠PTEN/PI3K/Akt信號通路的影響，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

清潔級Wistar雄性大鼠30只，體質(zhì)量（200±20）g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物許可證號SCXY（滬）2018-0006。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物中心SPF級動物房。本實驗經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理會審查批準(zhǔn)（PZSHUTCM19012502）。

1.2 藥物

生大黃27 g，飲片購自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，批號170401，常規(guī)煎制；LPS，來源于大腸桿菌O55：B5，Sigma公司，批號057M4013V；地塞米松片，上海信誼藥廠有限公司，批號015190213。

1.3 主要試劑與儀器

PTEN兔抗鼠單克隆抗體（貨號9188）、Akt兔抗鼠多克隆抗體（貨號4691）、β-actin兔抗鼠單克隆抗體（貨號3700），美國CST公司；PI3K兔抗鼠單克隆抗體（貨號ab182651），美國Abcam公司；羊抗兔IgG二抗（貨號A0208）、RIPA裂解液（貨號P0013C）、BCA試劑盒（貨號P0010），上海碧云天；EnVision試劑（貨號K400311-2），丹麥Dako公司。電熱恒溫水浴鍋（DK-S22），上海精宏；微波爐（WD800SL-4Ⅱ），格蘭仕公司；切片機（RM2145），德國徠卡公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GNP-9270），上海精宏實驗設(shè)備有限公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

2 實驗方法

2.1 分組、造模和給藥

按隨機數(shù)字表將大鼠分為正常組、模型組、地塞米松（0.27 mg/kg）組、大黃低劑量（0.8 g/kg）組、大黃高劑量（3.2 g/kg）組，每組6只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，造模前地塞米松組、大黃低劑量組、大黃高劑量組給予相應(yīng)藥液灌胃5 d，1次/d。第5日給藥后2 h，除正常組外，余各組大鼠尾靜脈注射LPS（8 mg/kg）復(fù)制腸損傷模型。大黃27 g水煎成84 mL（0.32 g/mL），給藥前按4∶1比例稀釋成不同劑量，大黃低、高劑量組分別含原藥材0.08、0.32 g/mL；取地塞米松片10片，研碎后溶于100 mL純凈水（0.075 mg/mL）。灌胃體積均為2 mL，正常組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。按人與動物間體表面積折算等效劑量[7]。

2.2 取材

大鼠造模7 h后，腹腔注射烏拉坦（2.0 mg/kg）麻醉，75%酒精消毒，打開腹腔，取出大腸組織，經(jīng)處理后置于4%多聚甲醛中固定，-80 ℃冰箱保存。

2.3 病理觀察

取大鼠腸組織，脫水，石蠟包埋，切片（厚度5 μm），常規(guī)HE染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

2.4 免疫組化檢測腸組織PTEN、PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)

取大鼠腸組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，PBS清洗3次×3 min；微波爐加熱后自然冷卻，清洗3次，0.3%H2O2抑制20 min；清洗3次；依次用20%羊血清、一抗孵育；清洗3次；EnVision試劑（HRP/R）37 ℃孵育30 min；清洗3次；DAB顯色；蘇木素襯染色，熱水藍(lán)化；樹脂封片并鏡下觀察，紫藍(lán)色為背景，棕黃色為陽性產(chǎn)物。采用IMS軟件對免疫組化結(jié)果進(jìn)行圖像采集并進(jìn)行半定量分析。

2.5 Western blot檢測腸組織PI3K、p-mTOR蛋白表達(dá)

稱取0.1 g大鼠腸組織，加入1 mL裂解液，4 ℃勻漿，離心后取上清液，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，定量后組織原液制備成4 μg/μL蛋白樣品，Western blot檢測腸組織PI3K、p-mTOR蛋白的表達(dá)，采用Image J軟件分析灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，符合正態(tài)分布兩組間比較用成組t檢驗；偏態(tài)分布數(shù)據(jù)以[M（P25，P75）]表示，2組間比較用Mann-WhitneyU檢驗；多組間比較符合正態(tài)分布且方差齊用方差分析，兩兩比較用LSD檢驗；如數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊則用非參數(shù)檢驗方法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 HE染色病理觀察結(jié)果

正常組大腸組織未見明顯病理性改變；模型組腸壁黏膜層廣泛變性壞死，大量肉芽組織增生（+++）；各給藥組病理學(xué)改變較模型組減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠腸組織形態(tài)（HE染色）

4.2 免疫組化檢測結(jié)果

圖2 各組大鼠腸組織PTEN、PI3K、Akt、mTOR蛋白陽性表達(dá)（免疫組化染色，×200）

紫藍(lán)色為背景，棕黃色為陽性產(chǎn)物，腸黏膜上皮細(xì)胞呈廣泛連續(xù)性著色。模型組著色減少，PI3K、Akt著色明顯；大黃高劑量組PTEN著色明顯增多，各給藥組PI3K、Akt著色顯著減少；mTOR各組無明顯變化。見圖2。與正常組比較，模型組大鼠腸組織PTEN蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.001），PI3K、Akt蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.001，P＜0.01）；與模型組比較，大黃高劑量組大鼠腸組織PTEN蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01），地塞米松組和大黃低、高劑量組大鼠腸組織PI3K蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.001），Akt蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.001）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠腸組織PTEN、PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)比較（±s，陽性面積率）

表1 各組大鼠腸組織PTEN、PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)比較（±s，陽性面積率）

注：與正常組比較，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

組別 只數(shù) PTEN PI3K Akt mTOR 正常組 6 3.67±0.60 8.65±3.67 6.00（3.87，11.72） 7.00（6.40，12.05） 模型組 6 1.65±0.49*** 13.67±3.22*** 10.69±2.02** 8.08（7.56，10.54） 地塞米松組 6 1.11（0.62，2.51） 9.33±3.70### 7.29（6.05，10.58）# 9.29±6.27 大黃低劑量組 6 1.98±0.51 7.58±1.86### 5.33（4.48，10.18）### 5.19（4.59，11.97） 大黃高劑量組 6 2.38±0.77## 8.08±2.19### 5.74±1.31### 4.91±1.50

4.3 Western blot檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠腸組織PI3K、p-mTOR蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松組和大黃低、高劑量組大鼠腸組織PI3K蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），地塞米松組和大黃低、高劑量組大鼠腸組織p-mTOR蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.000 1）。結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠腸組織PI3K、p-mTOR蛋白表達(dá)比較（±s，每組6只）

5 討論

LPS作為內(nèi)毒素的主要成分，是一種強力的炎癥誘導(dǎo)劑[8]。腸道被認(rèn)為是導(dǎo)致多種嚴(yán)重疾病的始動器官[9]，腸道中存在大量革蘭陰性菌[10]，是內(nèi)毒素的潛在來源，當(dāng)機體處于休克、感染等應(yīng)激狀態(tài)時，內(nèi)毒素會透過腸黏膜進(jìn)入血液，導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥、膿毒癥及多器官功能障礙綜合征等危重癥疾病[11-12]。由此可見，改善腸組織損傷，恢復(fù)腸黏膜的“屏障”功能是避免由內(nèi)毒素引起的全身炎癥反應(yīng)和危重疾病的關(guān)鍵一環(huán)。

PI3K/Akt信號通路與LPS引起腸黏膜屏障功能密切相關(guān)[13-14]。PI3K是一種細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，在細(xì)胞的生長、遷移和細(xì)胞周期進(jìn)程中有著重要作用[15]，影響細(xì)胞多種生物學(xué)功能。PI3K通?？杀簧L因子、細(xì)胞因子和激素等細(xì)胞外刺激所激活，激活后的PI3K磷酸化下游靶標(biāo)并激活A(yù)kt[16]?；罨腁kt可磷酸化哺乳動物mTOR，并發(fā)揮自噬調(diào)節(jié)作用[17]。PTEN參與細(xì)胞生長、代謝，以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)與環(huán)境有關(guān)的多個細(xì)胞過程[18]，其最重要的功能是使PI3K下游靶標(biāo)去磷酸化并抑制Akt的激活，是PI3K/Akt信號傳導(dǎo)的主要負(fù)調(diào)節(jié)劑[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腸壁黏膜層廣泛變性壞死，大量肉芽組織增生，提示造模成功。大黃低、高劑量組病理學(xué)改變較模型組減輕，表明大黃對LPS導(dǎo)致的腸組織損傷具有保護(hù)作用。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠腸組織PTEN蛋白表達(dá)顯著降低，PI3K、Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)顯著升高，表明LPS引起的腸組織損傷與PTEN/PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

Kwon等[20]研究發(fā)現(xiàn)，大黃可通過激活核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶-1抗氧化劑途徑，阻斷核因子-κB失活導(dǎo)致的促炎因子和介質(zhì)的釋放，從而減輕食管黏膜炎癥損傷。彭淑梅等[21]研究發(fā)現(xiàn)，大黃可降低腫瘤壞死因子-α水平，改善全身性炎癥反應(yīng)綜合征。本實驗結(jié)果表明，大黃能改善內(nèi)毒素導(dǎo)致的大鼠腸損傷，且能上調(diào)PTEN，下調(diào)PI3K、Akt、p-mTOR蛋白的表達(dá)。雖然免疫組化結(jié)果顯示各組大鼠腸組織mTOR蛋白表達(dá)無顯著差異，但Western blot結(jié)果顯示模型組大鼠腸組織p-mTOR表達(dá)顯著升高，大黃低、高劑量組p-mTOR顯著降低，表明LPS能磷酸化mTOR，而大黃對此產(chǎn)生抑制，這可能與大黃降低其上游蛋白Akt的表達(dá)有關(guān)。

PTEN/PI3K/Akt信號通路是細(xì)胞內(nèi)參與增殖調(diào)控的信號通路之一，與自噬高度相關(guān)[22]。研究表明，Akt磷酸化后mTOR會形成mTORC1，mTORC1能磷酸化多種自噬相關(guān)蛋白并抑制自噬體的形成，從而抑制自噬作用[23-24]。此外，結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1和2（TSC1/2）可將有活性的GTP酶轉(zhuǎn)化成無活性的GDP并負(fù)性調(diào)控mTORC1[25]。我們前期研究表明， 大黃可下調(diào)mTOR下游p70S6K和eIF4E mRNA的表達(dá)，但并未驗證其上游其他蛋白或基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，大黃可降低模型大鼠腸組織p-mTOR表達(dá)，除與上游Akt表達(dá)降低有關(guān)外，可能還與TSC1/2復(fù)合物有關(guān)，我們將在以后的實驗中深入研究。

綜上，大黃對內(nèi)毒素性腸損傷大鼠具有保護(hù)作用，其作用機制可能與其上調(diào)PTEN和下調(diào)PI3K、Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)有關(guān)。